菠萝蛋白酶粗提液的凝胶过滤层析.ppt

菠萝蛋白酶粗提液的凝胶过滤层析,一、实验目的,理解和掌握凝胶过滤层析技术原理和实验操作步骤。,二、实验原理,层析 以基质为固定相，以液体或气体为流动相，有效成分 和杂质在这两个相中连续多次进行分配、吸附或交换 作用，最终结果是使混合物得到分离。 种类：柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析,常用术语 固定相 流动相 床体积，Vt 洗脱体积，Ve 外水体积，Vo 内水体积，Vi 基质体积，Vg,凝胶过滤 利用具有一定孔径的多孔凝胶作为固定相，把分子大小不同的物质分离开的层析技术，又称为分子筛。,凝胶的类型有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）、聚丙烯 酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。 葡聚糖凝胶用得最多，它是-1，6葡聚糖与1-氯-2，3- 环氧丙烷反应交联而成的 ，有不同型号的凝胶。,凝胶的吸水能力与凝胶的交联度关系密切。 G表示交联度，G后面的数字是凝胶吸水量（ml/g干胶）乘以10所得的值。,交联度越大，G值小，网状结构致密，颗粒内孔径越小，吸水值小，分辨率高，分级范围窄，机械性能好。 交联度越小，G值大，网状结构疏松，颗粒内孔径越大，吸水值大，分辨率低，分级范围宽，机械性能不好。,三实验设备: 层析柱(2x20cm)、恒流泵、自动部分收集器、水浴锅、751-紫外分光光度计,四实验试剂 1、Sephadex G75（葡聚糖G75） 2、柱层析试剂0.1M PBS 3000 ml pH7.8 3、测酶活试剂： （1）1%酪蛋白300 ml ： （2）激活剂 300 ml ： （3）5%TCA（三氯乙酸）400 ml 4、酶液浓缩 （1）用实验一的透析袋。 （2）PEG（聚乙二醇）6000,五实验步骤,凝胶的预处理 凝胶（干粉）必须使用前在过量的溶剂中充分吸胀，一般多为dH2O、盐溶液或buffer，放置室温较长时间，使之充分吸胀。 用倾斜法出去混杂的小颗粒，重复3到4次，以防止粉末等物质塞住胶孔。 加热100溶胀，不同交联度，时间不同，G50需2小时，可杀死细菌和霉菌，且可排除凝胶内包藏的气泡。,柱的选择,柱的直径与长度之比，一般为1:251:100,装柱,1、垂直安装好层析柱，筛板不能留有气泡。 2、先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将糊状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降； 3、待其自然沉降至柱高的1/4时，打开出水口，使上端 液面缓慢下降至需要的高度； 4、将层析柱与洗脱液连接，让2-3倍柱体积的洗脱液流过固定相，使其平衡。 5、调节流速，每管4ml，每6min收集1管。,加样,吸出床上方多余液体直至与胶面相切。 沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起， 打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液 当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。 按加样操作，用1 ml洗脱液冲洗管壁2次。最后加入34 ml洗脱液于凝胶上， 盖上盖子，柱进水口连通恒流泵，柱出水口与部分收集器相连。,洗脱,以4ml/管，每6min收集1管的速度收集，同时检测280nm吸收值，直至数值由0达到最大值再到0，结束收集，约2025管。,蛋白检测和酶活测定,用紫外分光光度计测各管的A280 A280数值高的管进行酶活测定A275 把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液浓缩到12ml，用吸管把酶取出，-10保存，留到下次电泳实验用。,实验完毕，玻棒搅动G75，加少量缓冲液，倒回烧杯,总的实验流程,装柱（装柱时,柱内留10 ml 的水,倒入Sephadex G75，要求Sephadex G75均匀，大约1.5h） 调节流速4mL/管/6分（注意：恒流泵的转速不能太高） 加样:约58ml 收集管（收集2025管） 用紫外分光光度计测各管的A280 ,A280数值高的管进行酶活测定：按下表进行，其中，以一管作为对照。 把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇吸水，直到酶液浓缩到23mL，用吸管把酶取出，留到下次电泳实验用。 把Sephadex G75倒到烧杯中 清洗干净层析柱、部分收集器、恒流泵的塑料管,酶活单位：在上述条件下(37,酶促反应10min)，每10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。,六实验结果分析,1、做好实验数据原始记录； 2、绘出洗脱峰； 3、学生对该实验提出些可行性的意见。,