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遗传育种学 Genetic thremmatology 第九章 体细胞杂交 遗传育种学 Genetic thremmatology 二、促进细胞融合方法 1.1 生物融合（病毒法）biological fusion 遗传育种学 Genetic thremmatology 1.2 化学融合 聚乙二醇（PEG）、硝酸盐、磷酸盐、丙 三醇、膜动剂（AZC） 聚乙二醇作为融合剂是加拿大科学家高国楠 等发现的，是细胞融合技术的另一突破。聚乙二 醇是一种促进细胞融合能力很强的化学融合剂之 一，溶于水。,遗传育种学 Genetic thremmatology 一、体细胞杂交的定义 体细胞杂交，就是采用细胞融合的方法， 使原来不能或很难进行有性杂交的两种生 物，通过体细胞融合将它们的染色体核基 因共存于一个杂交细胞。 体细胞杂交属于生物技术中细胞工程学的 一个分支，与染色体工程、染色体组工程 和细胞质工程等有所区别。 遗传育种学 Genetic thremmatology 金鱼囊胚细胞的病毒融合 取囊胚期的胚胎用尖镊子剥去卵膜，放入盛有Holtfreter 液的培养皿，用发圈把胚盘从卵黄上切割下来，再用嘴控 移液管把胚盘转移到含有EDTA的缺钙、缺镁的holtfreter 液（分离液），在室温下放置2-3min，再用微吸管吹打， 使其分散成单个囊胚细胞，用Holtfreter液洗两次，然后 挑选大小一致的圆形囊胚细胞，双双放在盛有-丙内酯 灭火的仙台病毒液体的多孔血凝板或96孔板的培养板里。 每孔2个细胞，使彼此粘连在一起，在37下孵育15- 20min，再在解剖镜下检查融合情况。把融合的囊胚细胞 选出，放在Holtfreter液里。然后转移到含有15%小牛血 清的MEM培养液里培养 。 遗传育种学 Genetic thremmatology 机 理 在高浓度(40以上)的聚乙二醇溶液 中，由于PEG与水之间的氢键作用，使 溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发 生膜结构的变化，由此形成膜蛋白质的 外壳，引起细胞融合。,1,遗传育种学 Genetic thremmatology 遗传育种学 Genetic thremmatology PEG法对海藻种间原生质体的融合也有效。近 几年，PEG法已使三组种间海藻原生质体融合成 功，它们是：双星藻和纤细水绵、长石莼和囊礁 膜、条斑紫菜和肠浒苔。 张大力用PEG诱导长石莼和囊礁膜原生质体的 融合研究中观察到，原生质体的质且好坏直接 影响融合率的高低，甚至决定融合的成败，只有 用幼嫩新鲜的藻体制备的原生质体进行融合才能 成功。 遗传育种学 Genetic thremmatology,遗传育种学 Genetic thremmatology 遗传育种学 Genetic thremmatology 聚乙二醇化学融合法特点 聚乙二醇具有广泛的适应性、简便、快速、高效的优点。 缺点： PEG诱导细胞融合的有效浓度范围很窄，最适浓度为50- 55%，此时对细胞毒性很大 PEG诱导悬浮细胞的融合率远远低于诱导同样细胞单层培 养时的融合率。 PEG诱导产生的杂交细胞频率仍在10-5较这一很低水平。 容易形成多细胞融合体，不容易在显微镜下观察细胞融 合的过程。 遗传育种学 Genetic thremmatology,1.3 物理融合 优点：,1.3.1 电融合法 自从Zimmermann（1978）等和Senda （1979）等报道应用脉冲电流诱导植物原生质体 融合取得成功以来，为电融合技术发展奠定了基 础。,诱导率较高：是PEG的100倍 操作简单、快速，不存在细胞毒性问题 可以显微镜观察融合过程 缺点：采用高压电脉冲，使细胞内部某些低电 离电位分子可能发生离解而造成“电损伤”，影 响融合细胞的存活,2,遗传育种学 Genetic thremmatology 电融合实例 刘沛霖以大鳞副泥鳅的囊胚细胞为材料，在 915室温下，电场液用0.02mol/L甘露醇加 1mmol/L氯化钙配成，细胞密度为（2.5 3）X 104，细胞膜紧密接触2 5min，脉冲处理13 次，时间常数10 50us，融合率为46.72%，细胞 存活率达88.6% 遗传育种学 Genetic thremmatology,遗传育种学 Genetic thremmatology 电融合装置电路方框原理图 遗传育种学 Genetic thremmatology,1.3.2 激光融合 优点：无毒，融合体成活率高，能保证只 有所选择的细胞或原生质体得到融合。 缺点：每次只能产生一个融合体，激光微 束系统的设备昂贵。,遗传育种学 Genetic thremmatology 三、细胞融合过程 1. 点接触：2个细胞表面结合在一起的凝集状态。 2. 面接触：加入PEG等融合物质，则进入面融,遗传育种学 Genetic thremmatology 异核体 同核体,合状态，细胞呈斜球形。 3. 融合：双方的细胞质和细胞膜完全合并，结 果形成一个圆球形或卵圆形融合细胞，即异 核体。 3,遗传育种学 Genetic thremmatology,遗传育种学 Genetic thremmatology,四、体细胞杂交应用 4.2、植物育种,4.1 微生物育种 我国的邢孔昭等(1988)将巴龙霉素产 生菌与新霉家产生菌的高产变异株进行了 种间原生质体融合，获得了比区龙霉素产 生菌原始菌株单依产量(300ugmL)高5-6 倍的重组体菌株。 遗传育种学 Genetic thremmatology 4.3 水产生物方面的应用 张大力等将长石莼与囊礁膜原生质体融 合，并将其融合体培养了20天，形成自养细 胞团。 Fujita将淡红紫色的野生型条斑紫菜与绿 色突变型的条斑紫菜的原生质体融合，培育 出长达60cm左右的嵌合叶状体。,马铃薯与番茄、拟南芥菜与本油菜 等是些属间有性不亲和的组合，经细胞 融合技术和组织培养技术，已培养出前 所未有的再生植株 遗传育种学 Genetic thremmatology 在鱼类，易泳兰等把大鳞副泥瞅×鳗尾泥 鳅杂交囊胚细胞与大鳞副泥鳅卵融合，培育 了15.7(6尾)的融合鱼。 将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育了 3.5%融合鱼苗，工作还表明，鱼类囊胚细胞 与末受精卵的电融合可以简化细胞核移植操 作过程，一次可以处理卵数相当于一次核移 植卵数的2-3倍。,4,
