专题一 基因工程选修三DNA重组技术的基本工具,基因工程的基本操作程序,基因工程的应用,蛋白质工程的崛起.ppt

2.基因、DNA、染色体 之间是怎样的关系？,按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,一、基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状,基因重组,一、基因工程的概念,基因工程操作依据的理论基础,细胞生物都以DNA作为遗传物质，且其基本结构是相同的；,各种生物表达基因共用一套密码子。,棉花细胞 (不能抗虫),抗虫基因,转基因抗虫棉 (能抗虫),苏云金芽孢杆菌,目的基因,导入,剪刀,针线,运载体,检测 表达,受体细胞,分子手术刀,分子缝合针,分子运输车,培育转基因抗虫棉的简要过程,主要来源于原核生物,属名头字母+种名头2字母,现已从300微生物中分离出约4000种限制酶,1.分子手术刀 限制酶,识别双链DNA分子中 特定核苷酸序列,切割特定序列中的 特定位点,限制酶作用的化学键,主要来源于原核生物,属名头字母+种名头2字母,现已从300微生物中分离出约4000种限制酶,1.分子手术刀 限制酶,能够识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,黏性末端或平末端,DNA1,重组DNA,由于切割后的载体和目的基因具有相同的末端，故重组DNA存在3中可能连接。即 、 、 。,重组DNA一定是载体-目的基因连接吗？,载体-目的基因,载体-载体,目的基因-目的基因,DNA连接酶连接重组DNA分子,E.coli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,只作用于 末端,主要作用于 末端，还可作用于 末端,磷酸二酯键,黏性,平,黏性,通过形成新的磷酸二酯键，形成重组DNA,2.分子缝合针DNA连接酶,复习,基因工程的原理？ 基因工程的基本工具？ 限制酶的作用特点及作用结果？ DNA连接酶的种类及作用特点？ DNA连接酶和DNA聚合酶的比较？,催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,将单个核苷酸加到DNA片段上，形成磷酸二酯键,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；,目的基因怎样才能遗传到子细胞呢？,将外源基因导入受体细胞,具有特殊的标记基因，便于进行筛选；,质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒,一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。,对受体细胞无害,具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因插入；,载体能对受体细胞有害吗？,载体怎样才能具有能连接不同目的基因的潜能呢？,目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,3.分子运输车载体,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,练习,既含有抗四环素基因 也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因 也不含有抗氨苄青霉素基因,三大工具,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,小节：基因工程的工具,原核细胞基因结构示意图,mRNA,真核细胞基因结构示意图,目的基因的获取,基因表达载体的构建,目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,基因工程基本操作的四个步骤,1,2,3,4,（一）目的基因主要是_。,编码蛋白质的结构基因,（三）获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、化学方法人工合成,一、目的基因的获取,（二）目的基因的来源：,1、从自然界中已有物种中分离出来,2、人工的方法合成,1.基因文库：,2.基因文库的分类：,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,（一）从基因文库中直接获取,提取某种生物的全部DNA,限制酶切,一定大小的DNA片段,与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,3.基因文库的构建方法,（1）基因组文库,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链DNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,逆转录酶,DNA聚合酶,（2）部分基因文库,2.原理：,体外模拟双链DNA复制,（二）利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 含有目的基因 ),3.条件：,与目的基因的起始段互补核苷酸序列,一段已知目的基因的核苷酸序列,4.前提：,变性（90-95）：目的基因DNA受热变性后解链为单链；,复性（55-65）：引物与单链相应互补序列结合；,延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的DNA链；,约2n,5.过程,PCR技术扩增与DNA复制的比较,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,主要细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,例：根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,（三）化学方法人工合成的目的基因,适用：基因比较小，核苷酸序列已知,1.目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,二、基因表达载体的构建,2.基因表达载体的组成：,启动子+目的基因+终止子+标记基因,（一）转化：,（二）方法,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程。,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：植物体受损伤时，伤口细胞会分泌酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点：,经济有效,（2）基因枪法 （3）花粉管通道法,缺点：成本较高,受体细胞 (单子叶植物),我国科学家独创，转基因抗虫棉,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序： 常用的动物受体细胞：受精卵和卵细胞,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞(吸收环境中DNA生理状态) 表达载体(缓冲液)与感受态细胞混合 (温度)感受态细胞吸收DNA分子,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,（一）检测（分子水平）,1、检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,提取转基因生物的基因组DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,（1）方法:,分子杂交,方法:,抗原-抗体杂交,（2）过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,（二）鉴定（个体生物学水平）,抗虫、抗病接种实验，活性比较等,人体细胞,质粒,大肠杆菌,目的基因 (人胰岛素基因),用同一种限制酶 进行酶切,DNA连接酶连接目的基因和质粒,重组质粒(重组DNA),重组质粒导入大肠杆菌细胞,繁殖,人胰岛素,复制目的基因,获取目的基因 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 化学方法人工合成目的基因 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 植物、动物、微生物 目的基因的检测与鉴定 检测：分子水平是否插入、转录、翻译 鉴定：个体水平,小节: 基因工程的基本操作程序,基因工程的基本工具？ 限制酶的特点？ DNA连接酶和载体的种类？ 基因工程的基本操作程序？ 获取目的基因的方法？ 基因工程的核心步骤是？ 基因表达载体的组成？ 将抗虫基因转移到棉花细胞中遗传和表达称为？ 将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法？ T-DNA的特点？ 目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键？ 目的基因的检测与鉴定的方法？,复习,一、植物基因工程硕果累累,转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。,(一)抗虫转基因植物,杀虫基因：,Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因 植物凝集素基因,Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因 植物凝集素基因,产生的抑制剂可与害虫消化道的蛋白酶结合,淀粉酶抑制剂抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性,合成的糖蛋白可与昆虫肠道粘膜上的某种物质结合,编码的蛋白质在害虫肠道降解成有毒的多肽,转基因抗虫棉,(二)抗病转基因植物,病原微生物：,主要有病毒、真菌和细菌等。,抗病转基因植物采用的基因：,抗真菌转基因植物采用的基因：,病毒外壳蛋白基因（CP基因） 病毒复制酶基因,几丁质酶基因 抗毒素合成基因,(三)抗逆转基因植物,可以调节细胞渗透压的基因 抗冻蛋白基因 抗除草剂基因,(四)利用转基因改良植物的品质,将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物；改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性。,例如：将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，赖氨酸含量提高30%。,将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄；,将植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，出现颜色变异。,二、动物基因工程前景广阔,1.用于提高动物生长速度,2.用于改善畜产品的品质,外源生长素基因,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,普通鼠和生长速度加快的转基因鼠（右）,3.用转基因的动物生产药物,乳腺生物反应器 乳房生物反应器,将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。,获取目的基因（例如血清蛋白基因）,构建基因表达载体 （在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）,显微注射导入哺乳动物受精卵中,形成胚胎,将胚胎送入母体动物,发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）,4.用转基因的动物作器官移植的供体,1、供体动物： 2、存在的难题： 3、解决方法：,将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达； 或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。,猪,免疫排斥,三.基因工程药品异军突起,利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,我国已生产的产品：白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等。,近20种，年产值达30亿。,工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。,作用：胰岛素是治疗糖尿病的特效药。 传统生产方法： 主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。产量低，价格昂贵。 基因工程方法：1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。 1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%50%。,基因工程药品 胰岛素,基因工程药品 干扰素,化学本质：是病毒侵入动物或人体细胞后产生的一种糖蛋白。 作用：抗病毒的特效药。,干扰素产品,基因工程药品 生长激素,治疗侏儒症的唯一方法：是向人体注射生长激素。 传统生产方法：需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。 人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,四、基因治疗曙光初照,1）原理：,把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。,2）实例：,复合型免疫缺陷症,3）基因治疗的方法,体外基因治疗：,体内基因治疗：,先从病人体内获得某种细胞(T细胞)，进行培养，体外进行基因转移，筛选成功细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。,直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。,4）用于基因治疗的基因种类,1.正常基因取代病变基因；弥补病变基因；,2.反义基因产生mRNA与病变mRNA互补；,3.编码可以杀死癌细胞的蛋白酶基因；,多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果胶使细胞壁破损。成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如图。据图回答下列问题：(原生质体是去掉细胞壁的植物细胞),(1)若已获取PG的mRNA，可通过_获取PG基因。重组质粒转移到大肠杆菌中的目的是_。,(2)用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有_的培养基进行筛选，理由是_。之后，还需将其置于质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞_现象来鉴别细胞壁是否再生。,(3)由于导入的目的基因能转录出反义RNA，且能与_互补结合，因此可抑制PG基因表达的翻译过程。若_，则可确定转基因番茄培育成功。,知识回顾,基因工程的实质是什么？,将一种生物的基因转移到另一种生物体内， 后者可以产生它本来不能产生的蛋白质，进 而表现出新的性状。,思考：,基因工程有没有局限？ 基因工程产生的蛋白质有没有不足？,一、蛋白质工程崛起的缘由,例如：,玉米中赖氨酸含量比较低,天冬氨酸激酶 （352位的苏氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,天冬氨酸激酶 （异亮氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）,玉米中赖氨酸含量可提高数倍,二、蛋白质工程的基本原理,与基因工程的关系：,蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。,蛋白质工程流程图：,蛋白质 三维结构,氨基酸序列 多肽链,基因 DNA,mRNA,从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到相应的脱氧核苷酸序列,蛋白质工程的主要步骤通常包括：,（1）从生物体中分离纯化目的蛋白； （2）测定其氨基酸序列； （3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能 地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构; （4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响； （5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如定点突变； （6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,某多肽链的一段氨基酸序列是： 丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸 丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：UGG 赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：UUU、UUC,讨论： 1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。 2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改 造目的基因（DNA）？,讨论,蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,三、蛋白质工程的进展与前景,诱人前景：,用蛋白质工程制成电子元件： 优点：体积小、耗电少和效率高,联系作者：zhbghostqq.com,