实验六、微生物细胞的大小测量和显微计数目....ppt
实验六 微生物细胞的大小测量和显微计数,主 讲:徐尔尼 生命科学学院生物技术系,一、目的与要求 学习测微尺测定微生物细胞大小，以及血球计数板计算微生物细胞数目的原理。 掌握使用测微尺和血球计数板对微生物细胞进行大小测量和细胞计数的方法。 增强微生物细胞大小的感性认识。,二、基本原理 1、微生物细胞大小的测量 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助特殊测量工具测微尺（包括镜台测微尺和目镜测微尺）。 测微尺原理：镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0.01mm(即10m)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度，然后再用目镜测微尺测量微生物细胞的大小。,二、基本原理 2、显微直接计数 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。 血细胞计数板原理：计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各该有一个方格网，每个方格多共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。,二、基本原理 每个计数室（大方格）边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（即万分之一毫升）。 每个计数室有25或16个中方格。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就得出一个大方格的总菌数，然后换算成1ml菌液中的总菌数。,三、实验器材 1、菌种：酿酒酵母菌液、细菌三形片 2、试剂：无水乙醇、香柏油、二甲苯 3、仪器或其他用具：目镜测尺、镜台测微尺、血球计数板、盖玻片、无菌吸管、酒精灯、显微镜、擦镜纸、滤纸等,四、操作步骤 1、微生物细胞大小测量 1）目镜测微尺的校正： 将目镜测微尺装入目镜载物台上放镜台测微尺调节粗调和细节调至直看到镜台测微尺的刻度 转动目镜，推动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数根据两测微尺重合格数，计算出目镜测微尺每格实际长度 。 按上述步骤分别校正低倍镜、高倍镜和油镜的下目镜测尺每小格的实际长度。,四、操作步骤 2）菌体大小的测量： 取下镜台测微尺 将待测标本片放在载物台上 观察标本片中细胞所占目镜测微尺的格数 根据目镜测尺的实际长度算出细菌的大小 操作要点： 观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。 换高倍镜和油镜校正时，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。,四、操作步骤 2、显微直接计数 1）血球计数室的观察和清洗 取血球计数板置于载物台上 观察熟悉计数室的中方格和小方格 取下血球计数板用自来水冲洗计数室后，再用无水乙醇将血球计数室冲洗干净 置干燥箱干燥 。,2）样品中酵母菌细胞的直接计数： 取干净血球计数板 在计数室上方盖上盖玻片 用无菌吸管，吸取摇匀的酵母菌稀释液 在盖玻片边缘沾一下，让菌液沿缝隙靠毛细管渗透作用进入计数室 静置5min 低倍镜或高倍镜计算每个中方格内的细胞数 完毕后清洗血细胞计数板 冲洗、干燥,计数规则： 1）要求每小格内约有510个菌体为宜； 2）选计数室四个角的中方格和中央的一个中方格进行计数； 3）当细胞位于方格的线上时，一般只数上方和右边线上的细胞； 4）酵母出芽，又未脱离母体的，只有当芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计算； 操作要点： 血球计数室要清洁。 观察时光线不宜过强，否则难以找到计数室。 吸取菌液前菌液要充分摇匀。 血球计数室充满菌液后，要静置5min。,五、实验数据及处理结果 1、大小测量 1）将目镜测微尺校正结果填入下表： 接目镜放大倍数： 2）将各菌测定结果填入下表,五、实验数据及处理结果 2、显微计数 将结果记录于下表中，A表示五个中方格的总菌数，B表示菌液稀释倍数。,六、思考与讨论 1、根据你的体会，说明用血细胞计数板的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？ 2、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。 下次实验项目：培养基的配制与高压蒸汽灭菌,采用目镜测微尺测量经显微镜放大后的细胞物象，由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此在测量前要先对目镜测微尺进行校正。,校正公式： 目镜测微尺每格长度(m)两重合线间镜台测微尺小格数×10/两重合线间目镜测微尺小格数,10m,计数室,16小方格 × 25中方格计数室,25小方格 × 16中方格计数室,计数室的刻度有两种规格：,计算公式： 25个中方格计算公式： 总菌液中的总菌数（个/ml）A/5×25×104×B 50000A×B 16个中方格计算公式： 总菌液中的总菌数（个/ml） A/5×16×104×B 32000A×B 式中：A为五个中方格的总菌数；B为菌液的稀释倍数；,
