生物化学——第一章_蛋白质化学1.ppt

蛋白质的结构与功能,第 一 章,蛋白质的分子组成 蛋白质的分子结构 蛋白质结构与功能的关系,主要内容：介绍蛋白质的构件单位氨基酸的结构、分类、性质及肽的概念，重点讨论蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系。,第一节 蛋白质通论,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质的元素组成,碳、氢、氧，还有氮和少量硫等 C 5055% H 67% O 1924% N 1319% S 04% 有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。 各种蛋白质含氮量接近，平均为16%。 1克氮相当于6.25克蛋白质为测定样品中蛋白质含量的依据。 凯氏定氮法测定蛋白质含量： 蛋白质含量=蛋白氮×6.25,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能,蛋白质是由20种L-型氨基酸组成的长链分子，包括： 1、简单（单纯）蛋白质：完全由氨基酸构成； 2、结合（缀合）蛋白质：还有非蛋白质成份的辅基或配基。 蛋白质构象： 每一种天然的蛋白质都有自己特有的空间结构，这称为蛋白质构象。,蛋白质结构的不同组织层次： 1、一级结构：多肽链共价主链的氨基酸顺序； 2、二级结构：多肽链以氢键排列成沿一维方向的周期性结构 的构象，如纤维状蛋白质中的-螺旋和-折叠片； 3、三级结构：多肽链以各次级键（非共价键）盘绕成具有特 定走向的紧密球状构象； 4、四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互结合 方式。,第二节 氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,COOH,H,C,H2N,R,L-氨基酸,D-氨基酸,-氨基酸的通式,（一）、氨基酸的分类,1、非极性疏水性氨基酸,20种氨基酸按侧链R的理化性质分为4类：,吲哚基,2、极性中性氨基酸,羟基,巯基,酰胺基,3、酸性氨基酸,羧基,4、碱性氨基酸,胍基,咪唑基,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,（二）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，氨基酸分子中同时带有可解离的弱碱性基团（-NH2 - NH3+）和弱酸性基团（-COOH - COO - )。,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,注：二十种氨基酸的结构特点 含胍基的氨基酸：精氨酸 含咪唑基的氨基酸：组氨酸 亚氨基酸：脯氨酸 含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 含吲哚基的氨基酸：色氨酸 含-氨基的氨基酸：赖氨酸,三.氨基酸的理化性质,（一）物理性质,1.形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。 2.溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。 3.熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。 4.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。 5.光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收。,5. 紫外吸收,色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸收谱带,最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,苯丙氨酸 （Phe）,酪氨酸 （Tyr）,色氨酸 （Try）,4.氨基酸旋光性,（一）氨基酸的结构通式：,1、构成蛋白质的氨基酸均为L-氨基酸。 2、除R为H（甘氨酸）外，其余氨基酸均具有旋光性。 3、各种氨基酸的区别在于侧基R基上。,从氨基酸的结构通式可以看出：,（二）氨基酸的构型：,构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外，均含有-碳原子，在空间各原子有两种排列方式：L-构型与D-构型，互为镜像关系。,（二）化学性质,1. 两性电离及等电点：,氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可电离出H+，所以氨基酸具有酸碱两性性质。通常情况下，氨基酸以两性离子的形式存在,三、氨基酸的化学反应 1.由-氨基参加的反应：,(1) 与亚硝酸反应：放出氮气，氮气的一半来自氨基氮，一半来自亚硝酸，在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量，此反应可用于测定蛋白质的水解程度。,(2) 与甲醛的反应： 用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。,(3) 与2,4-二硝基氟苯（2,4-DNFB）的反应（Sanger反应）：生成黄色的二硝基苯-氨基酸衍生物。 (4) 与苯异硫氰酸酯（PITC）反应（Edman反应）：生成苯乙内酰硫脲-氨基酸。 (5) 与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应：生成荧光物质DNS-氨基酸。,(3)、(4)、(5)反应用于蛋白质的N-末端的测定。,2.-羧基参加的反应： (1)与碱反应成盐 (2)与醇反应成酯 (3)与酰化试剂反应成酰氯,3.-氨基与-羧基共同参加的反应 与茚三酮的反应：除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。,4 .R-侧链反应-呈色反应,5、成肽反应,* 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,* 肽是由氨基酸通过肽键脱水缩合而形成的化合物。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由多个氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,蛋 白 质 的 共价结 构,第 三 节,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),化学法断裂肽键： 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基 所形成的肽键。,酶法断裂肽键,定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,（一）肽和肽键结构,1、肽链的结构特点是： （1）肽链中的骨干是 单位规则地重复排列，称 之为共价主链： （2）每个肽键的形成都丢失一个水分子，故肽键中的氨基酸称氨基酸残基。 （3）各种肽链的主链结构一样，但侧链R基即氨基酸残基的顺序不同。 （4）一条多肽链通常在一端含有一个游离的末端氨基，称N端；另一端含一个游离的末端羧基，称C端。,2、肽的命名：从N端氨基酸开始，称某氨基酰某氨基酰某氨基酸， 如简写：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu。,3、肽键的平面结构： 顺式构型中的两个C彼此接近，引起 各R基之间的空间位 阻，造成结构不稳； 反在式构型中两者相 距较远，结构比较稳 定。肽链中的肽键全 是反式构型。,4、肽键共振 肽键是一种酰胺键，通常在羰基碳和酰胺氮之间是单键，这样肽链主链上的3种键（ C-C键， C-N肽键，N-C键）都是单键，所以原则上多肽主链上的任何共价键都可发生旋转。,但在酰胺氮和羰基氧之间会发生共振相互作用，其结果表现两种极端形式： C和O之间有一个键和一个键连接，而酰胺N上留有一个孤电子对，这种结构允许C-N键自由旋转（A）； C和N原子参与键的形成，在羰基O上留下一个孤e-对，带负电荷，酰胺N带正电荷，这样C-N键就成为一个双键，阻绕C-N键的自由旋转（B）。 肽键共振的结果： （1）阻绕肽键C-N的自由旋转，只保留N-C键和C-C键的 旋转； （2）组成肽基的4个原子和2个相邻的C原子倾向于共平 面，形成多肽主链的酰胺平面。,（二）肽的物理和化学性质 1、物理性质 在水溶液中以偶极离子存在，这决定于游离末端-NH2 ，-COOH以及酸性和碱性氨基酸侧链R基团上可解离的功能团。肽键中的亚氨基不解离。 2、化学反应 （1）游离的-NH2和-COOH及R基团可发生与氨基酸中相应的基团类似的反应； （2）N末端的氨基酸残基也能与茚三酮发生定量呈色反应； （3）双缩脲反应为肽和蛋白质所特有、而氨基酸所没有的一种颜色反应（紫红色或紫蓝色，与CuSO4碱性液反应），借助分光光度计可定量分析。,二、蛋白质的二级结构,主要的化学键： 氢键,肽单元（肽键平面）,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,酰胺平面与- 碳原子的二面角 酰胺平面 多肽链可看成是由一系列酰胺平面组成：,1/3的肽键不能旋转，只有碳原子连接的两个单键（C- N和C- C），能够旋转。, 二面角（ 和 ） 两相邻酰胺平面，能以共同C为定点而旋转。 绕C- N键旋转角度为 绕C - C键旋转角度为,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（一） -螺旋,目 录,多为右手螺旋,1. -螺旋结构,3.6残基/圈 0.54nm/圈,氢键是维持此结构的主要作用力,-螺旋结构有左、右螺旋之分，天然蛋白质为右手-螺旋结构，典型 右手-螺旋结构可用3.613表示。,毛发横切面和毛发-角蛋白的结构,原纤维,细胞,-螺旋,角质层（鳞状细胞）,微纤维,微纤维,大纤维,影响 -螺旋形成的因素： 1.多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基（如Lys、Asp、Glu），不能形成稳定的-螺旋。 2.Gly连续存在时，由于没有侧链的约束，其可任意取值，所需二面角几率很小，不易形成-螺旋。 3.R基大（如Ile）不易形成-螺旋 4. Pro由于侧链的吡咯环及C没有H参与螺旋氢键形成，使螺旋拐弯（中断），产生一个“结节（kink）”。 5.R基较小，且不带电荷的氨基酸利于-螺旋的形成。如多聚Ala能自发卷曲成-螺旋。,（二）-折叠,两条或多条伸展的多肽链（或一条多肽链的若干肽段）侧向集聚，通过相邻肽链主链上的N-H与C=O之间有规则的氢键，形成锯齿状片层结构，即折叠片。,-折叠（-pleated sheet）结构特点 又叫-构象（-conformation），主要存在于- 角蛋白中。 氢键与肽链的长轴接近垂直。 多肽主链呈锯齿状折叠构象。 侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。 两个氨基酸之间轴心距为0.35nm（反平行）或0.325（平行）（完全伸展为0.36nm ）。, -折叠有两种类型： 平行式 （二面角 = 119°、= +113° ）即所有肽链的N-端都在同一方向，主要存在于球状和纤维状蛋白质中。 反平行式 （二面角 = 139°、= +135° ）即相邻两条肽链的方向相反，主要存在于纤维状蛋白质中。 反平行-折叠比平行的更稳定。,平行和反平行的 折叠,（三） - 转角和- 凸起 - 转角（ - turn）又叫 - 弯曲（ -bend）、发夹结构（hairpin structure），是一种非重复结构。 在-转角部分，由4个氨基酸残基组成，弯曲处的第1个氨基酸残基的 -C=O 和第4个残基的 NH 之间形成氢键，形成 的环状结构。 某些氨基酸如Gly、Pro在转角处经常出现。 - 转角结构主要存在于球状蛋白分子的表面，约占全部碱基的1/4。,-凸起（-bugle）是-折叠股中额外插入一个残基，使得在两个正常氢键之间，在凸起折叠股上是2个残基，而另一侧正常股上是1个残基，从而引起多肽键方向的小的改变。,核糖核酸酶分子中的二级结构,（四）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,超二级结构（super secondary structure） M.Rossmann于1973年提出，为二级和三级结构之间过渡构象层次。 若干个相邻的二级结构单元（-螺旋、-折叠、-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件。 组合形式有、 等类型。,（1） 类型 由两股或三股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。存在于-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。,（2）类型 由两段平行式的-折叠通过一段连接链（-螺旋或无规卷曲）连接而形成。 最常见的是3股平行的链和2段-螺旋构成（ ） ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。,x,在此类型中几乎所用的连接链都是右手交叉：,（3）类型 一条多肽链的若干段折叠反平行组合而成。两个股通过一个短环连接，主要有： 曲折（-meander）由多条反平行式的-折叠链通过紧凑的-转角连接而成。 回形拓扑结构（Greek key topology）,曲折,回形拓扑结构,（4）-折叠桶 由多条-折叠股构成的-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条-折叠股组成。 SOD的-折叠筒由8条-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。,（5）-螺旋 回折-螺旋 两个-螺旋通过一个转角连接在一起。 噬菌体的阻遏蛋白含此结构 。,螺旋-回折-螺旋,角蛋白（ keratin）结构,来源于外胚层，包括皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，为结构蛋白。, -角蛋白 一般4个螺旋圈一个-S-S-，保证结构稳定。 根据-S-S-的含量，有硬角蛋白（如蹄、角、爪、甲，硬、不易拉伸）和软角蛋白（皮肤、胼胝，有伸展性）。,毛发的结构： 3股右手-螺旋（左手超螺旋） 原纤维(2nm)（原纤维排成9+2电缆式） 微纤维(8nm) （成百根微纤维） 大纤维(200nm),-螺旋,原纤维,微纤维 (9+2),微纤维,大纤维,鳞状细胞,皮质细胞, - 角蛋白 主要存在于蚕丝和蜘蛛丝内。,结构域 （1）结构域（structural domain）的概念 在一些相对较大的蛋白质分子中，在空间折叠时往往先分别折叠成几个相对独立的区域，再组装成更复杂的球状结构，这种在二级或超二级结构基础上形成的特定区域称为结构域。它的结构层次介于超二级结构和三级结构之间。,肌钙蛋白,溶菌酶(2个),（2）结构域的特点 一般由100200 个氨基酸残基组成，范围 40400 个。氨基酸可以连续，也可不连续。 常是几个超二级结构的组合。对于较小的蛋白质，结构域与三级结构等同。 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。 酶活性中心常位于两个结构域的界面上。 结构域之间由“铰链区”相连，分子构象有一定的柔性，使蛋白质实现一定的功能。 蛋白质分子内，结构域可进行相对独立的运动，水解后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性。,（3）功能域 功能域（functional domain）是蛋白质分子中能独立存在的功能单位，它可以是一个结构域，也可由几个结构域组成。 这些结构域可以位于一条多肽链上或者几条多肽链上，活性部位是功能域，它往往位于结构域之间的交界处。,（4）结构域的类型 反平行-螺旋（全- 结构）,-螺旋反平行排列，形成上下型纤维束。相邻螺旋之间以环相连。 常见的是四纤维束，呈轻度左手扭曲。如蚯蚓血红蛋白中四个-螺旋组成的结构域。,两个铁原子, 平行或混合型折叠片（,- 结构） 单绕平行桶 8个平行的折叠股环形排列，1、8两个折叠股借氢键形成一个闭合圆筒，肽链按Rossman折叠方式卷绕。,丙糖磷酸异构酶,丙酮酸激酶结构域,外桶,内桶,双绕平行片（马鞍形扭曲片） 由4-9个平行的折叠股或混合的折叠股构成马鞍形片，两侧由螺旋和环状区保护。,NAD,裂缝,乳酸脱氢酶结构域（侧面）,乳酸脱氢酶结构域（顶面）, 不规则小蛋白结构域（富含金属或二硫键） 小于100个氨基酸残基的结构域不规则，只有少量的二级结构，但富含二硫键及金属，它们对构象起稳定作用。,胰岛素,三、蛋白质的三级结构,肽链中所有原子在三维空间的排布位置。 即多肽链在二级结构的基础上折叠成具有特定走向的紧密球状结构。,（一） 定义,三.蛋白质的三级结构,一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。在三级结构中，大多数的亲水的R侧基分布于球形结构的表面，而疏水的R侧基分布于球形结构的内部，形成疏水的核心。,目 录,肌红蛋白 (Mb),胰岛素分子的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,三维结构特征： 1.纤维状蛋白通常只含一种二级结构，而球蛋白通常含有多种二级结构 2.球状蛋白质具有明显的折叠层次 一级结构-二级结构-超二级结构-结构域、三级结构-四级结构 3.球蛋白是紧密的球状或托球状实体 4.疏水残基埋藏于球体内，亲水基暴露于球体外 5.表面有一空穴，这个空穴能结合配体，蛋白质的活性部位 6.由二级结构向三级结构转变主要动力是疏水作用,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,血红蛋白的四级结构,五、蛋白质分子的结构层次,第五节 蛋白质分子结构与功能的关系,一.蛋白质一级结构与功能的关系 研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。 进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。,例一：镰形细胞贫血症：编码珠蛋白链的结构基因第六个密码子由CTTCAT，相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸由GluVla；其空间结构发生相应改变，丧失运输氧的生物活性。,例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子. 例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原 前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽. 信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。 胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,（二）一级结构与种属差异,对比不同机体的同种功能蛋白质，发现其种属差异明显; 亲缘关系越近,其蛋白质结构越相似。,与功能相关的氨基酸是高度保守的，这说明不同种属的生物在进化上来自相同的祖先。不同种属间的同源蛋白质一级结构上的氨基酸残基数差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。,二.蛋白质的构象与功能的关系,别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式. 例：血红蛋白的别构效应 一个亚基与氧结合后，引起该亚基构象改变 进而引起另三个亚基的构象改变 整个分子构象改变 与氧的结合能力增加,肌红蛋白的结构与功能 肌红蛋白（myoglobin，Mb）是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。,1963年，Kendrew等完成了Mb的空间结构测定工作。, Mb的结构 由一条多肽链（珠蛋白，153残基）和一个血红素（heme）辅基组成，分子量16 700 。 球状分子，单结构域。 8 段直的-螺旋组成（AH），拐弯处是由18个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲），其中4个Pro各自处在一个拐弯处，其他拐弯处还有Ser、Thr、Asn、Ile等残基。 血红素辅基 ，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。,抹香鲸Mb三级结构, Heme的结构 Fe()与原卟啉形成4个配位键（平面）。另2个配位键垂直卟啉面。 血红素辅基结合在珠蛋白疏水空穴中，垂直伸出分子表面，通过93位His（F8 ）（近侧 proximal）的咪唑基与Fe形成第5个配位键。,血红素(heme),在Heme氧结合一侧，有另一His （64位，E7）远侧His（distal），起空间位阻作用。, 氧合肌红蛋白 氧与Fe形成第六个配位键，氧轴与Fe-O键有60°倾斜。由远侧His残基位阻引起。,大2.5万倍,大250倍,C,C,血红蛋白的结构与功能 血红蛋白（hemoglobin, Hb）四级结构的测定由佩鲁茨（Perutz）1958年完成。,The Nobel Prize in Chemistry 1962,“for their studies of the structures of globular proteins“,Hb (1937-1960) Perutz et al. (1960) Nature 185:416,Mb (1947- 1960) Kendrew et al. (1960) Nature 185:422, Hb结构要点 4条肽链（亚基）组成，每个亚基含1个heme： 2 条链141AA/链，2 条链146AA/链 共：574AA残基， 4分子heme 分子量64kD，比Mb（16.7kD）约大4倍，分子近球形（6.5×5.5×5.0nm）。 一级结构：Hb的、链和Mb差别较大，只有27个氨基酸残基是共有的。,四级结构：Hb中的4个亚基（ 2 2 ）按正四面体排布，分布于四面体的4个顶角。,在4个亚基中，相同亚基（2个或2个 ）之间的相互作用很小，两个不同亚基（、）之间相互作用最大。,Hb中的盐桥： 脱氧Hb 4个亚基中通过8个盐桥相互结合，其构象呈紧张态，对氧的亲和力很低。 当第一个亚基与O2结合时，盐桥破坏所需要的能量较多。但当一个亚基结合氧之后，引起构象从紧张态变成松弛态，其它的盐桥也依次破坏，所需要的能量也少。构象的变化导致Hb对氧的亲和力大大增强，第四个亚基结合氧的能力比第一个大几百倍。,血红素与珠蛋白的结合：Hb的Fe 与His F8的咪唑基形成第5个配位键，镶嵌在疏水空穴中。,heme group,氧合引起Hb 构象变化 脱氧Hb的heme中，Fe()位于卟啉环平面上方（F8-His一侧）约0.06nm,卟啉环平面也凸起。 当氧合时， Fe()向卟啉环靠拢约0.039nm，此时， Fe()处于平面上方仅0.021nm，heme由凸形变为平面状。 这一微小的移动，有重要的生物学后果。,Fe2+移动时，拖动His F8残基，进而引起螺旋F和拐弯EF和FG的位移，这些移动传递到亚基的界面，亚基移动使盐桥破坏，导致四级结构的改变，Hb由紧密的T态（tense state）变成松散的R态(relaxed state)。,血红蛋白的氧合曲线 Hb的四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S型曲线。,H+ 、CO2和 DPG对血红蛋白结合氧的影响,Bohr (1904) discovered that high CO2 or acid pH causes the release of O2 from Hb.,波尔效应 ： 增加H+ 和CO2 浓度能显著降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放，反之，高浓度的O2也能促使Hb释放H+ 和CO2 。,生理意义：肺部氧合Hb到组织后更易释放出氧；对组织缓冲pH有一定意义。 原因： H+ 和CO2 能够与Hb的特定位点结合，使其从R态转变为T态。 与波尔效应相关的基团： 亚基中的N端氨基和His122的咪唑基； 亚基His146咪唑基。它们在T态时是高度质子化的。,BPG 的影响 2,3-二磷酸甘油酸（ 2,3-bisphosphoglycerate , BPG ）是Hb的重要别构效应物。在Hb中只有一个BPG结合部位，位于4个亚基形成的中央孔穴内。BPG通过盐桥将2个亚基交联在一起。,BPG只与脱氧血红蛋白结合，降低血红蛋白与氧的亲和力。氧合Hb中，中央孔穴太小，容不了BPG，因为氧的结合引起了Hb的构象变化。,BPG,T-state (deoxy-Hb),R-state (oxy-Hb),BPG在组织缺氧时代偿性增加，满足组织对氧的需要。,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。,亨廷顿舞蹈病,疯牛病,老年痴呆症,疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一种人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,正常,疯牛病,一、蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,第六节 蛋白质的理化性质,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜,二、蛋白质的胶体性质与沉淀,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质沉淀方法：,盐析： 条件:高浓度的强电解质盐(如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等)-盐析; 低浓度的盐溶液-盐溶。 机理：破坏水化膜，中和表面的净电荷。 注意:盐析法不会使蛋白质产生变性。,2.有机溶剂沉淀法： 条件:有机溶剂如乙醇、丙酮等。 机理：破坏蛋白质的水化膜。 注意:低温条件下进行，否则溶解热会使蛋白质变性。,3.重金属盐沉淀 条件：pH 稍大于pI为宜; 机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 注意:蛋白质变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。,4.生物碱试剂沉淀法 条件：pH稍小于pI;生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。,5.弱酸或弱碱沉淀法： 条件：pH=pI 机理：破坏蛋白质表面净电荷。,三、蛋白质的变性、沉淀和凝固,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素： 1）物理因素：高温、高压、射线等; 2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等。,蛋白质变性后的性质改变： 溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,复性(renaturation),天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,* 蛋白质变性易沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质的凝固作用 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,四、蛋白质的紫外吸收,五、蛋白质的呈色反应,茚三酮反应 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,（一）分离纯化蛋白质的意义,研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高,不变性； 提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态； 作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。,（二）蛋白质分离纯化的一般步骤,材料的选择原料的预处理蛋白质的抽提从抽提液中沉淀蛋白质纯化蛋白质的结晶,第七节 蛋白质的分离纯化,1.原料的选择：要求含待分离的蛋白质丰富，廉价，容易收集，新鲜无腐败。 2.原料的预处理：胞外蛋白质，材料破碎后，用适当的溶剂直接抽提；胞内蛋白质，则需要破碎细胞膜，再用适当的溶剂抽提。 3.从抽提液中沉淀蛋白质：常用盐析法、低温乙醇沉淀法、等电点沉淀法。,4. 纯化：将沉淀的蛋白质溶解，再选择适当的纯化方法，得到纯度比较高的蛋白质溶液。 方法：透析或超滤、电泳法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析法、超速离心法等。 5. 蛋白质的结晶：从溶液中重新沉淀蛋白质。,（三）蛋白质的分离和纯化方法,1.透析及超滤法,* 透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,*使用丙酮沉淀时，必须在0-4低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。,*盐析是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,2.丙酮沉淀与盐析,3.电泳,电泳是带电的颗粒在电场中定向移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳技术 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。,层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液由（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,（四）层析,蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。,小 结,1.蛋白质分类：A：按分子形状分；B：按生物学功能分； 2.蛋白质的结构可分为4个层次： 一级结构是指多肽链通过肽键共价连接的氨基酸序列。 蛋白质主链的折叠形成由氢键维系的重复性结构称为二级结构，最常见的二级结构有螺旋、折叠片、转角和无规则卷曲。 三级结构是指由二级结构元件构成的整个多肽链的三维构象，包括相距甚远的肽段间和侧链基团间的相互关系。 蛋白质的四级结构是指聚集两条或更多具有三级结构的多肽链（亚基）空间配置形成的构象。,3.天然蛋白质分子受某些物理因素或化学因素的影响，物理化学性质改变，生物活性丧失的现象称为蛋白质变性，变性的实质是分子中的次级键被破坏，引起天然构象解体，而蛋白质一级结构保持不变。 4.蛋白质的生物功能取决于它的构象，构象是由氨基酸序列决定的。 5.导致一个蛋白质中氨基酸改变的基因突变能产生所谓分子病。,6.蛋白质可采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤法等进行测定。 7.蛋白质的某些颜色反应，如双缩脲反应和酚试剂反应，可用于定性或定量检测。根据蛋白质溶解度不同可以分离蛋白质，如盐析、等电点沉淀法和低温有机溶剂沉淀等；根据蛋白质分子大小进行分离的方法有透析、超滤和凝胶过滤法；根据蛋白质带电性质进行分离的方法有电泳法和离子交换层析法。,小 结 1.结构层次 元素组成：C、H、O、N（16%）、S 结构单位：20种L-氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等） 一级结构：肽键；多肽链；N端C端 二级结构：稳定力（氢键）；类型（螺旋，折叠，转角，无规卷曲） 三级结构特点 四级结构特点 2.重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性 3.分离纯化：超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛 5.结构与功能关系（举例）,习题,1、PI为6.5的蛋白质 A、在pH7的溶液中带正电 B、在pH7的溶液中带负电 C、在pH5的溶液中带负电 D、在pH5的溶液中为兼性离子 2、多肽链中主链骨架的组成是 A、NHCCOCNH B、CNHCCOCNH C、CCONHCCONH D、CCHNOCCHNO E、CCNHOCCN 3、下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，最先被洗脱的是： A、马肝过氧化氢酶（Mr：247500） B、Mb（Mr：68500） C、血清清蛋白（Mr：68500） D、牛乳球蛋白(Mr:35000) E、牛胰 岛素（Mr：5700）,4、下列哪种因素可促进Hb转变为HbO2 A、氧分压增高 B、血液pH下降 C、CO2分压增高 D、血液H+增高 E、温度增高 5、有一含a、b、c、d四种蛋白质混合液，它们的分子量相同，pI为5，8.6，6.8和9.2。在pH为8.6的缓冲液中，用醋酸纤维素薄膜电泳时，四种蛋白质电泳区带的排列次序(从正极开始)是： A、a、c、b、d B、a、b、c、d C、d、b、c、a D、c、b、a、d E、b、c、d、a,6、具有四极结构的蛋白质分子，在一级结构分析时发现 A、只有一个N端和一个C端 B、具有一个以上N端和C端 C、没有N端和C端 D、只有N端，没有C端 7、蛋白质分子中不存在的氨基酸是 A、半胱氨酸 B、胱氨酸 C、瓜氨酸 D、精氨酸 E、羟脯氨酸,习 题 某溶液中蛋白质的百分含量为55%，此溶液的蛋白质氮的百分浓度为 A、8.8% B、8.0% C