生药中各类成分及定性定量分析方法.ppt
生药中各类成分及 定性定量分析,Which compounds occur in herbal drugs? How to qualify and quantify these compounds?,一、黄酮类 (flavonoids),具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物,色原酮,2-苯基色原酮,一、黄酮类 (flavonoids),C6-C3-C6,1、结构类型（Structures）,黄酮(flavone),黄酮醇(flavonol),二氢黄酮(dihydroflavone),二氢黄酮醇(dihydroflavonol),异黄酮(isoflavone),二氢异黄酮(dihydroisoflavone),查耳酮(chalcone),橙酮(aurones),黄烷 (flavanes),花色素 (anthocyanidins),双黄酮 (biflavone),2、黄酮类的分布与活性 (distribution & bioactivity),豆科：葛根、甘草、槐米、大豆 唇形科：黄芩 菊科：水飞蓟、红花、苍耳子 鸢尾科：射干、鸢尾 小檗科：淫羊藿 香蒲科：蒲黄 松科、柏科、银杏科：银杏叶（双黄酮）,3、理化性质 (physico-chemical properties),性状：结晶性固体 颜色：黄色，与分子中交叉共轭体系及助色 团类型、数目、及取代位置有关 溶解度: 苷易溶于热水，能溶于水、醇、碱 水; 苷元易溶于醇、EtOAC、乙醚、 碱水,酸碱性 酸性，因有酚-OH 7，4-二-OH 7或4-OH 一般-OH 5-OH NaHCO3 Na2CO3 1NaOH 5NaOH 微弱碱性 (吡喃环上的1-位氧原子的未共用电子对),7,4,5,HCl-Mg还原反应：生药粉末 醇提 滤液 橙红-紫色 金属盐络合反应：邻二酚羟基；3- 羟基，4酮基；5- 羟基，4酮基 镁盐、铝盐、锆盐、铅盐反应 有色络合物,HCl、Mg粉,显色反应,Bright-yellow comoles compound,Al3+,Al3+,4、黄酮类主要定量方法 （Major quantitative methods ）,总黄酮测定（UV法） 原理：黄酮类化合物常可与某些试剂（如硝酸铝和亚硝酸钠等）形成稳定的有色络合物,应用：紫外-可见分光光度法（山楂叶中总黄酮-药典方法）,药材提取物亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠,500 nm处测定,4、黄酮类主要定量方法 （Major quantitative methods ）,单体黄酮测定,薄层扫描法(TLCS) 高效液相色谱法（HPLC）,对照品 芦丁(rutin) (1)；金丝桃苷(hyperoside) (2)；木犀草素-7-O-D-半乳糖苷(luteolin-7-O-D-galactoside) (3)；忍冬苷(lonicerin) (4)；tricin-7-O-D-glucopyranoside (5)；chrysoeirol-7-O-neohesperidoside (6)；tricin-7-O-neohesperidoside (7)和槲皮素(quercetin) (8),1,OH,H,Glc(6-1)rha,H,2,OH,H,Gal,H,3,OH,H,H,Gal,4,OH,H,OH,Glc(6-1)rha,5,OMe,OMe,H,Glc,6,OMe,H,H,Glc(2-1)rha,7,OMe,OMe,H,Glc(2-1)rha,应用：HPLC法测定金银花中木犀草苷和芦丁,A,B,金银花黄酮类化合物色谱图 (A) 对照品; (B) L. japonica,二、蒽醌类(anthraquinones),蒽醌 (anthraquinones),1、结构类型（Structures）,氧化蒽酚 (oxanthranol),蒽酚 (anthranol),二蒽醌 (dianthraquinones）,二蒽酮 (dianthrone),蒽酮 (anthrone),2、蒽醌苷的分布与活性 (distribution & bioactivity),蓼科：大黄、何首乌、虎杖 豆科：番泻叶、决明子 百合科：芦荟 茜草科：茜草、巴戟天,颜色：多显黄色或橙红色，多具荧光 性状：结晶体，具升华性 溶解度：苷元溶于甲醇、乙醇、乙醚、氯仿，几不溶于水 ；苷易溶于水、稀醇, 可溶甲醇、乙醇，难溶于苯、乙醚等 。,3、理化性质 (physico-chemical properties),酸性：酸性强弱与酚羟基数目及位 置有关 -COOH（NaHCO3 ） 2个以上-酚OH（Na2CO3 ） 1个-酚OH （1%NaOH ） 2个以上-酚OH （5%NaOH ）,Borntrager反应,含蒽醌的乙醇溶液+碱水溶液 红色 溶液黄色+乙醚振摇 分取醚层，乙醚层黄色 水层红色，醚层无色,H+,+碱水,鉴别反应,醋酸镁络合反应 样品乙醇液滴于滤纸上 喷0.5% Mg(Ac)2 MeOH试液 显色,4.蒽醌衍生物主要定量分析方法,总蒽醌: UV法测定 原理：与醋酸镁络合反应,应用：UV法测定番泻叶中总番泻苷含量,药材,番泻苷提取物,FeCl3,HCl,乙醚提取物,0.5% Mg(Ac)2 MeOH,515nm,4.蒽醌衍生物主要定量分析方法,单体蒽醌: 薄层扫描法和高效液相色谱法,sennoside A,sennoside B,番泻叶中番泻苷A和B的色谱图,1.结构类型,三萜皂苷（triterpenoid saponins）：皂苷元为30个碳原子组成的三萜类衍生物(酸性皂苷),五环三萜 (pentacyclic triterpenoids),四环三萜 (tetracyclic triterpenoids),三、皂苷类(saponins),甾体皂苷(steroidal saponins) 甾体皂苷的皂苷元由27个碳原子组成(中性皂苷),螺甾烷醇 (spirostanol)型 异螺甾烷醇(isospirostanol)型 呋甾烷醇(furostanol)型 变形螺甾烷醇(pseudo-spirostanol)型,2. 皂苷的分布与活性,甾体皂苷：百合科（麦冬、知母）、薯蓣科 三萜皂苷：五加科（人参、三七）、豆科（甘草、黄芪）、桔梗科（党参、桔梗）、葫芦科（土贝母、丝瓜根）、石竹科（太子参）、鼠李科（酸枣仁）,3.皂苷的理化性质,吸湿性：多为白色的无定形粉末，具吸湿性。 溶解性：可溶于水、甲醇、乙醇，不溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂; 易溶于水饱和的丁醇或戊醇。,泡沫试验 醋酐-硫酸反应 (Liebermann-Burchard 反应),鉴别反应,4.皂苷主要定量分析方法,总皂苷: 中国药典用重量法测定桔梗中三萜总皂苷。,4.皂苷主要定量分析方法,单体皂苷： HPLC-UV：人参中三萜皂苷类成分人参皂苷 Rg1、Re、Rb1的测定，检测波长为203nm；重楼中重楼皂苷I、II的测定，检测波长为210nm。 HPLC-ELSD：黄芪中三萜皂苷类成分黄芪甲苷；知母中甾体皂苷类成分菝葜皂苷元。,山银花中皂苷类成分的高效液相色谱分析,R1,R2,1,ara(2-1)rha(3-1)glc(4-1)glc,glc(6-1)glc,2,ara(2-1)rha(3-1)glc,glc(6-1)glc,3,ara(2-1)rha,glc(6-1)glc,4,H,glc(6-1)glc,5,ara(2-1)rha(3-1)glc(4-1)glc,H,6,ara(2-1)rha(3-1)glc,H,7,ara(2-1)rha,H,色谱柱：Zorbax SB-C18(2504.6mm，5.0µm)；柱温：25；流动相：A 乙腈-醋酸(95:0.5) ， B 0.5% 醋酸；梯度洗脱：29%A(0-10min)，29-46%A(10-25 min)，46%A(25-30min)；检测器：蒸发光散射检测器；漂移管温度：106；氮气流速：2.6L/min。,山银花中皂苷类成分的高效液相色谱图,A: 混合对照品 B: 山银花 L. confusa,RRLCESI TOF MS 快速测定三七中12个三萜皂苷,1.生物碱结构类型,吡咯烷类 (pyrrolidine),吡啶类 (pyridine),喹啉类 (quinoline),异喹啉类 (isoquinoline),喹唑酮类 (quinnazolidone),吲哚类 (indole),莨菪烷类 (tropane),亚胺唑类 (imidazole),嘌呤类 (purine),四、生物碱类(alkaloids),2.生物碱的分布,毛茛科：乌头、黄连 防己科：防己、北豆根 罂粟科：罂粟、延胡索 茄科：蔓陀罗、洋金花 百合科：百合、贝母 豆科：山豆根、苦参,黄连素（小檗碱） 抗菌 毛果芸香碱 治疗青光眼 山莨菪碱（6542） 抗胆碱 高三尖山酯碱 抗白血病 长春新碱 抗肿瘤 延胡索乙素 镇痛 苦参碱 抗癌 利血平 降压 石杉碱甲 抗老年痴呆 秋水仙碱 抗痛风 麻黄碱 平喘 吗啡 镇痛 。 。 。 。 。 。,Alkaloids,Effect,3. 生物碱理化性质,多数生物碱为结晶状固体 ,一般无色; 多数生物碱具左旋光性; 多数生物碱具碱性。,溶解度：游离生物碱极性较小，不溶或难溶于水，能溶于氯仿、乙醚、苯、丙酮、乙醇等有机溶剂，也能溶于稀酸的水溶液而生成盐类。生物碱盐类易溶于水和乙醇，不溶或难溶于有机溶剂。,生物碱的沉淀反应 碘化铋钾：生物碱 + Dragendorff试剂（BiI3 KI） 桔红、红棕 碘化汞钾: 生物碱+ Mayer试剂 (HgI2·KI) 白、淡黄,贝母生物碱薄层色谱图 1、 2阴性对照 3.西贝素苷对照品 4. 西贝素对照品 5. 样品990716 6. 样品 990718 7. 样品990720 8、9伊贝母药材对照 : 展开系统为乙酸乙酯：丙酮：甲酸：水（5：3：0.5：1） ：展开系统为氯仿-甲醇-水（40：10：1）,II,I,罂粟壳薄层色谱（1-11 罂粟壳） 展开剂：甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（20：20：3：1） 显色：依次喷碘化铋钾试液和亚硝酸钠试液,吗啡,可待因,罂粟碱,4. 生物碱含量测定,总生物碱： 酸性染料比色法。 酸碱滴定法，如中国药典对制川乌中酯型生物碱的测定。,4. 生物碱含量测定,单体生物碱： 薄层扫描法：两面针生物碱测定- 中国药典 高效液相色谱法: 通常采用离子对色谱或离子抑制色谱法,贝母生物碱的高效液相色谱分析,对照品： 贝母辛（peimissine）、鄂贝啶碱（ebeiedine）、去氢鄂贝啶碱（ebeiedinone）、湖贝甲素（hupehenine）、异浙贝甲素（isoverticine）、贝母素甲（verticine）、贝母素乙（verticinone）和西贝素（imperialine）,贝母生物碱高效液相色谱图,对照品,浙贝母,伊贝母,五、强心苷类 (cardiac glycosides),是一类对心肌有兴奋作用，具有强心生理活性的甾体化合物,1.结构类型,强心甾烯型,蟾蜍甾烯型,强心三要素： C17内酯环； C/D 顺式； a-去氧糖,五、强心苷类 (cardiac glycosides),2.强心苷的分布,夹竹桃科：羊角拗、黄花夹竹桃 萝摩科：香加皮、白前、白薇 玄参科：洋地黄、毛花洋地黄 百合科：万年青,3.强心苷理化性质,甾体母核的反应：Liebermann-Burchard 反应 -去氧糖显色反应：Keller-Kiliani反应 五元不饱和内酯环反应：如Legal反应、Keddes反应（与某些芳香硝基化合物形成有色加成物 ）,鉴别反应,4.强心苷定量分析方法,总强心苷：不饱和内酯环的反应-紫外-可见分光光度法； 单体强心苷：TLCS、HPLC、GC 如中国药典（2005年版）使用高效液相色谱法测定蟾酥中强心苷类成分华蟾酥毒基和脂蟾酥毒配基,狭叶洋地黄Digitalis lanata Ehrh. 中强心苷类HPLC分析,生药中多类成分的同时含量分析 Simultaneous ditermination of multi-type compounds in crude drugs,Why ? Multi-compounds, multi-targets How ? Hyphenated techniques,Example-1 金银花中多类成分的测定(HPLC-MS),对照品HPLC-MS图,样品HPLC-MS图,样品HPLC-MS图,Example-2 山银花中绿原酸和三萜皂苷的同时测定 (HPLC-UV-ELSD),Example-3 金银花中多类成分的测定 (HPLC-VWD-ELSD),中药指纹图谱,指纹是灵长类动物手指末端指腹上由凹凸的皮肤所形成的纹路，也可指这些纹路在物体上印下的印痕。当人的手指接触到物品时，通常可在该物品上留下指纹，这些印痕最常在犯罪学、法医学上被当作证据。尚未发现有不同的人拥有相同的指纹，每个人的指纹也是独一无二。,中药指纹图谱的特点,整体性 模糊性 特征性,中药指纹图谱的应用,真伪鉴别 质量稳定性评价,中药指纹图谱的应用,芍药 Paeonia lactiflora Pall.,川赤芍 Paeonia veitchii Lynch.,中药指纹图谱的应用,中药指纹图谱的建立及技术要求,指纹图谱的获取 相似度计算,获取方法：HPTLC、LC-DAD、LC-MS等 方法学验证：,相关系数法、夹角余弦法、欧式距离法、 模糊相关法等,中药指纹图谱的发展,指纹图谱的获取方法：多维多息 相似度计算方法优化：加权相似度 谱效关系研究,
