糖尿病的分子机制(病理班).ppt
,糖尿病分子机制,11级病理班,2,唐同学，男，15岁。三个月前受凉感冒，之后常感觉口渴、总想喝水、感觉没有力气，体重减轻5斤。 诊断：1型糖尿病，糖尿病酮症酸中毒。,1型糖尿病,IDDM 是人类一种内分泌疾病，多数情况下是由自身免疫系统损伤了胰岛细胞所致的 当胰腺中超过了90的细胞受损时出现临床表现（空腹高血糖，糖尿及酮症酸中毒）,1型糖尿病的分类,免疫介导糖尿病（1A） 特发性糖尿病(1B),1A 型糖尿病： 在基因遗传，环境因素和自身免疫机制的共同作用基础上发生和发展的结果，其特点：炎症选择性破坏细胞。 1.表达于激活的CD8+ T淋巴细胞的FAS配体（FASL）和表达于胰岛细胞的FAS受体，激活凋亡的死亡受体途径； 2.激活的 CD8+ T淋巴细胞释放穿孔素和颗粒酶，诱导细胞凋亡； 3.浸润于胰岛细胞的各种免疫细胞释放细胞因子，包括白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF-）和干扰素-（IFN-），促进细胞凋亡； 4.巨噬细胞、树状突细胞和细胞释放活性氧元件，如一氧化氮（NO），调控细胞凋亡。,1A研究中使用的动物模型,NOD小鼠（非肥胖糖尿病小鼠） BB大鼠（Biobreading大鼠）,证实了T细胞是 细胞破坏的启动者和最终效应者,NOD小鼠,NOD小鼠的MHC中缺乏类E（与HLA-DR同源）,1A发病与HLA复合物上DQ-A和DQ-B有关,自身抗原到底是胰岛素还是谷氨酸脱羧酶（GAD）?,自身免疫的胰腺炎,白细胞:胰岛外周积累除了ER-MP25+还有MOMA-1+ 巨噬细胞:BM8+巨噬细胞 T淋巴细胞:CD4+CD8+ B淋巴细胞:对T淋巴细胞有辅助作用（APC）,直接和间接,B淋巴细胞的辅助作用,NOD/Jsd小鼠,NOD/Lt小鼠,实验,发病雌性NOD小鼠,CD4+和CD25+的T细胞增多,未发病雌性NOD小鼠,CD4+和CD25+的T细胞未增多,通过RT-PCR技术检测发病的NOD小鼠的 CD4+T细胞更偏向于分泌辅助细胞TH1的 致炎淋巴因子，其中尤其是INF-。,自身免疫的胰腺炎,还有研究表明当T细胞诱导发育为TH2时不 会者产生1A,IL-12和IL-18是 T淋巴细胞向TH1分化的相关细胞因子,NOD/Born（环磷酰胺加速糖尿病发病的NOD小鼠）,LADA和1B,LADA（成人隐匿性免疫糖尿病）,1B,细胞凋亡的信号转导,死亡受体介导的信号途径,线粒体途径,颗粒酶B途径,死亡受体介导的信号途径,IFN-,B细胞,Fas,DISC,Fas受体多聚化,诱导,表达,募集,Caspase8/10,DD,FADD,使Caspase8水解活化 激活效应Caspase3,6,7,线粒体途径,激活效应Caspase-3，6，7,颗粒酶B途径,颗粒酶B存在于CTL细胞和NK细胞中,T细胞活化之后会释放颗粒酶和穿孔素,激活Caspase3，7，8，10,Caspase（半胱天冬蛋白酶）,通过剪切核内底物 （核纤层蛋白，细胞骨架蛋白等） 使细胞凋亡,II型糖尿病患者不需要依靠胰岛素，可以使用口服降糖药物来控制血糖，又称非胰岛素依赖糖尿病。所谓的“2型糖尿病“，是各种致病因素的作用下，经过漫长的病理过程而形成的。由于致病因子的存在，正常的血液结构平衡被破坏，血中胰岛素效力相对减弱，经过体内反馈系统的启动，首先累及胰岛，使之长期超负荷工作失去代偿能力。再继续下去，就像强迫一个带病的人干活一样，最终累死。,2型糖尿病,2型的发病机制,胰岛素抵抗的机制,胰岛细胞凋亡的机制,胰岛素的信号的转导通路,胰岛素受体(INSR) 胰岛素受体是一个四聚体，由两个亚基和两个亚基通过二硫键连接。 两个亚基位于细胞质膜的外侧，其上有胰岛素的结合位点； 两个亚基是跨膜蛋白，起信号转导作用。 无胰岛素结合时，受体的酪氨酸蛋白激酶没有活性。 当胰岛素与受体的亚基结合并改变了亚基的构型 后，酪氨酸蛋白激酶才被激活， 激活后可催化两个反应 使四聚体复合物中亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化,这种过程称为自我磷酸化 将胰岛素受体底物(IRS)上具有重要作用的十几个酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的IRS能够结合并激活下游效应物。,什么是胰岛素抵抗,IR是指机体在一定量的胰岛素水平作用下,葡萄糖摄取和处理能力降低,肌细胞和脂肪细胞不能利用糖,以及肝细胞不能有效抑制糖原分解和糖异生,而向血中释放过多葡萄糖,致使血糖浓度增高。,1）受体前水平 由于编码胰岛素或胰岛素原基因的突变引制胰岛素一级结构改变和胰岛素生物活性降低，造成的胰岛素抵抗。目前至少发现了六种，如图,(1)从胰岛素基因水平,1.1胰岛素分子上的某一个氨基酸被代替，而此氨基酸对胰岛素的生物活性起关键性作用,1.2胰岛素原转换为胰岛素的过程中，正常的咸基残端被裂开。,B52突变（苯丙氨酸 亮氨酸） INS一级结构改变-受体结合障碍。,65位（精氨酸 非咸性氨基酸） 蛋白酶识别点消失 INS加工障碍 胰岛素原在C肽和B链之间断裂 妨碍受体识别,2）受体水平 胰岛素受体基因的突变以及胰岛素受体抗体的产生导致胰岛素抗体 基因突变对受体功能的影响： 受体合成时mRNA提前终止 受体合成率，数目 胰岛素受体蛋白合成受阻 细胞膜受体数量 受体降解加速 受体酪氨酸酶活性降低 受体再利用障碍 受体与胰岛素的亲和力下降 胰岛素受体基因突变，引发胰岛素受体缺陷，从而导致胰岛素抵抗，此时胰岛素B细胞代偿性分泌大量胰岛素，形成高胰岛素血症，持续高胰岛素血症进一步降低胰岛素的生物效应，由此恶性循环。,（2）从胰岛素受体水平,编码受体的基因改变,胰岛素受体基因突变导致正常受体数量减少：受体降解加速：受体酪氨酸酶活性降低：受体再利用障碍：受体与胰岛素的亲和力下降从而导致胰岛素抵抗，此时胰岛素细胞代偿性分泌大量胰岛素，形成高胰岛素血症，持续高胰岛素血症进一步降低胰岛素的生物效应，由此恶性循环。,2000,3）受体后水平 胰岛素受体底物（IRS），葡萄糖运载体（Glut），以及葡萄糖激酶，糖原合成酶等共同引发胞内事件。 Glut 对葡萄糖摄取及代谢速率的影响 （一组结构相似的蛋白质，具有组织特异性，已发现5种) Glut2 基因突变 致胰岛素分泌障碍，肝脏胰岛素抵抗 Glut4 基因突变 外周胰岛素抵抗 IRS （一组胰岛素敏感组织中与胰岛素各种生物效应调节密切相关的 信号蛋白，包括IRS14） IRS1基因突变 外周胰岛素抵抗和糖脂代谢异常 IRS2基因突变 外周胰岛素抵抗和胰岛素缺乏, 葡萄糖激酶 对葡萄糖摄取与代谢的影响 葡萄糖激酶 G 6-P-G 促进肝细胞对其摄取 兴奋B细胞分泌胰岛素 基因突变 葡萄糖激酶结构或功能改变 肝脏胰岛素抵抗 胰岛素分泌障碍 此外，己糖胺/葡糖胺代谢途径，游离脂肪酸，瘦素， TNF-a以及脂联素都会导致胰岛素抵抗。,（3）从胞内水平,胰岛素受体底物IRS,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K),葡萄糖激酶,糖原合成酶,胰岛素受体底物IRS,基因突变 编码胰岛素受体IRS的基因发生突变导致正常irs减少引起IR,其他因素导致异常 肿瘤坏死因子(TNF)和代谢物(多为FFA、葡萄糖)均可促使IRS的丝氨酸磷酸化而抑制酪氨酸磷酸化和胰岛素信号转导,从而导致IR;长期高血糖促使蛋白激酶C活化,催化胰岛素受体底物丝氨酸磷酸化,抑制PI-3K活性,导致IR,IKK-的活化进而催化胰岛素受体底物 (IRS)特定部位的Ser/Thr残基磷酸化，抑制信号分子的Tyr残基磷酸化,导致IR。,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K),游离脂肪酸(FFA)释放增多，血清FFA的升高可引起骨骼肌、肝脏的PI-3K活性降低，胰岛素的信号传导通路中断， 致使葡萄糖无法进入细胞内参与代谢，引起IR。,葡萄糖激酶,在起病早期或伴明显家族史的常见型2型糖尿病中见到GCK内含子1b变异。导致该酶的结构改变从而无法将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖。,糖原合成酶,在周围组织对葡萄糖的非氧化摄取、合成糖原的过程中，糖原合成酶（GSY）基因产物起到重要作用。这一过程的受阻可引起周围组织对胰岛素的抵抗IR，,在2型糖尿病患者GSY基因中发现了双核苷酸复序列多态性（TG）。它位于19号染色体载脂蛋白C-2及富含组氨酸的钙结合蛋白基因之间，拥有10个等位基因，杂合度0.82，在2型糖尿病发病及胰岛素抵抗中的作用机制尚待进一步研究。,主要表现： 胰岛素分泌量的缺陷 胰岛素分泌模式异常 细胞功能障碍的原因尚不明确 可能因素有： 炎症应激 氧化应激 内质网应激 糖毒性作用 脂毒性作用 继发性高血糖的毒性作用 胰岛淀粉样多肽沉积,胰岛细胞凋亡,炎症应激,高糖可诱导胰岛细胞IL-1合成和分泌，促进Fas触发的细胞凋亡。在2型糖尿病患者中浸润于胰岛的巨噬细胞也可产生IL-135 。,炎症应激 炎症因子 促进脂肪分解 FFA 一氧化氮合酶 B细胞产生IgG FFA流入胰岛 表达 B细胞 损伤线粒体 iNOS，NO 杀伤性T细胞 葡萄糖激酶， 过度激化 Glut2 胰岛素合成分泌 胰岛细胞凋亡,氧化应激,氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导 致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增 加，产生大量氧化中间产物。 高血糖的致病作用在很大程度上是通过活性氧簇 （ROS）、活性氮（RNS）生成和继发的氧化应激反应介导的。ROS、RNS除直接氧化损害 DNA、蛋白质、脂质、大分子物质外，还间接通过核因子B（NF-B）、p38丝裂原活化蛋白激酶、NH3末端Jun激酗应激活化蛋白激酶（JNKSAPK）、己糖胺等细胞应激敏感途径损害组织。,在2型糖尿病患者中，高血糖活化这些通路，但由于胰岛细胞的超氧物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶表达量低，进而抗氧化能力低，因此细胞特别易受到氧化应激的损害。,在2型糖尿病患者细胞处于自由基的慢性增加和细胞内氧化还原调节能力降低的环境，引起 细胞凋亡。,内质网应激,各种原因导致的未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网 腔内的积聚，被称为内质网应激。在胰岛素抵抗和2型糖尿病时，由于胰岛素原的合成增加，当超过内质网的负荷，引起内质网应激，其中由蛋白质堆积所引起的一系列后续反应称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。未折叠蛋白反应首先表现为蛋白质合成暂停，随着应激反应蛋白基因表达，可进一步改善细胞生理状态。但当应激原强度超过细胞自身处理能力时，内质网也会诱导特有的内质网性细胞凋亡通路，诱导细胞凋亡。,糖毒性作用,长期高血糖可能影响参与凋亡的基因表达，通过改变Bcl蛋白家族之间的平衡来调节细胞凋亡水平。Federici等发现在高葡萄糖（16.7mmol/L） 条件下，高血糖能够持续增加促凋亡基因Bad、Bid、Bik的表达，减少Bcl-xl抗凋亡基因的表达，而对Bcl-2抗凋亡基因的表达没有影响。高血糖打破了促凋亡和抗凋亡之间的平衡，并向着凋亡的方向发展，促进胰岛细胞凋亡。,脂毒性作用,FFA可通过增加合成鞘髓磷脂醇产物一酰基鞘氨醇（一个细胞凋亡信息分子）导致细胞凋亡，酰基鞘氨醇可上调NF-B的表达，而后者又可上调NO合酶的表达，使NO产生增加；FFA可以通过一氧化氮独立机制的影响使正常的胰岛细胞凋亡。,继发性高血糖的毒性作用 （1)长期高血糖可能影响参与凋亡的基因表达，通过改变Bcl蛋白家族之间的 平衡来调节细胞凋亡水平20 。Federici等发现在高葡萄糖（16.7mmol/L） 条件下，高血糖能够持续增加促凋亡基因Bad、Bid、Bik的表达，减少Bcl-xl抗凋亡基因的表达，而对Bcl-2抗凋亡基因的表达没有影响。高血糖打破了促凋亡和抗凋亡之间的平衡，并向着凋亡的方向发展，促进胰岛细胞凋亡。 （2）糖毒性的生物化学机制可能是由慢性氧化应激引起。氧化和抗氧化作用失衡所致的氧化应激引起胰岛细胞凋亡21 。,（3）高血糖可通过上调Fas受体和刺激FasL表达引起胰岛细胞凋亡。2型糖尿病可能是一个炎症性过程，高血糖诱导细胞产生炎性细胞因子 IL-1，IL-1激活NF-B而触发通过上调Fas受体而引起细胞的凋亡。 （4）Liu22 等提出糖毒性诱导细胞凋亡的机制之一可能是葡萄糖的代谢影响O-连接的N-乙酰氨基G对细胞内蛋白质的修饰，产生对糖负荷的适应，导致细胞凋亡。,胰岛淀粉样多肽 lAPP为37氨基酸多肽，又称为胰淀素，是胰岛细胞的正常分泌产物，与胰岛素合成及分泌并行，其中第2029位氨基酸序列是lAPP形成淀粉样纤维蛋白沉积的结构基础。IAPP容易积存在细胞之间，或细胞和其他内分泌细胞之间，从而减少了有功能的细胞数目和分泌区域。,实验设计,寻找新的致病基因,一·实验目的 进一步寻找新的目的基因,二·实验原理 有方向：根据已有的方向进一步深入 无方向：用基因芯片的方法高通量筛选 科研的基本方法 伽利略：问题 提出猜想 设计实验方案 修正假说 结果对比 实验验证,（一）立题,提出问题：该往哪个方向研究？ 是围绕胰腺展开 直面疾病 还是舍而取其次转攻其他相关的器官？ 文献查询：胰腺 肾脏 原则： 实用性：有一定的临床研究价值 可行性：在实验中不超过现有的实验条件 科学性：尽量根据已有的一些研究成果缩小一下目标范围 先进性：采用交心的前沿的技术和方法，以较先进的理论 作为研究的指导,三 实验设计,根据一中筛选的可疑基因， 通过查询相关文献进一步去除已知的基因 筛选出新的可疑基因 再按可疑度的高低逐个依次研究 于是问题到这一步转化成了：如何确定找到一个可疑的基因是否为致病基因,1·比较该基因在不同物种之间的分布,原因：人和实验动物（如老鼠）毕竟是不同的， 有些基因实验动物有而人没有， 因此对人类而言也没有进一步的临床意义,人类有,Y,不同亲缘性动物对比,换下一个,关于如何符合：,可以分不同的层次展开 1·细胞水平：对人类某些组织细胞进行离体培养， 对某些基因进行操作（如基因的敲除、沉默、 低表达、过表达） 观察其对细胞的影响 2·个体水平：小鼠 猴子 猩猩,验证思路,不变 变,1· 基因 疾病,例：体外高糖培养小鼠肾小球足细胞 检测NICDI表达与肾小球足细胞凋亡关系，并了解信号通路是否介导高糖对NOTCH通路的激活,2· 疾病 基因,，,思路：（1）先做基因改变，再致病 （2）先致病，再做基因改变,实例：,1.材料： 2.细胞培养： 5% CO2 33摄氏度 3.细胞分组 4.western blotting 检测 NICIDI 的表达 5.统计学处理,展望：,分子生物学家： 在我心中，有一个梦，能用基因治疗所有的痛； 万千基因，谁是真的元凶，愿患者生命从此与过往不同； 分子魂，基因梦，魂牵梦萦是动力的泵。,Thank you!,Thank you!,please give some questions,
