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,第二章 植物细胞形态建成 主讲: 秦改花 邓盾 园艺教研室 躬行楼1-301,本章主要内容,一、植物细胞全能性 二、愈伤组织的诱导 三、继代培养 四、器官建成 五、体细胞胚胎建成,第一节 植物细胞全能性,植物组织培养的理论基础。植物细胞全能性是指植物体细胞或性细胞，在人为控制的条件下具有再生为新个体的潜能。,1937年，荷兰植物学家温特（Went）发现B族维生素和生长素对植物根的生长具有促进作用。 19371938年，法国科学家高特里特（Gautheret）和诺比考特（Nobercourt）几乎同时离体培养了胡萝卜组织，并使细胞成功增殖。因此，温特（Went）、高特里特（Gautheret）和诺比考特（Nobercourt）一起成为植物组织培养的奠基人。 1958年，史都华德（Steward）和赖纳特（Reinert）发现胡萝卜的体细胞可以分化成体细胞胚，这成为植物组织培养领域的一个重大突破，也进一步验证了细胞全能性学说 1973年，古谷树里（Furuya）等通过培养人参细胞生产人参皂苷，开创了植物活性物质生产的新途径,胡萝卜再生体系的建立,第二节 愈伤组织的诱导,愈伤组织（Callus）原指植物组织受到伤害后表面形成的保护组织。 愈伤组织:在组织培养中,是指在培养基上由外植体长出来的一团活跃生长的薄壁细胞。 用途：愈伤组织可以通过液体悬浮培养产生单细胞，也可以在适当的培养条件下再生出完整的植株。,切取,接种,愈伤组织的形成,试管苗的形成,培养室,移栽,2.1 愈伤组织的诱导,2.1.1 外植体的选择 大小要适宜,不宜太小 同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。通常植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织； 不同物种相同部位的外植体其分化能力可能大不一样。一般以幼嫩的组织或器官为宜。,2.1.2 愈伤组织诱导的条件,一般认为，诱导愈伤组织成败的关键主要在于培养的条件，其中，植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。 植物生长调节剂主要包括：生长素，如2,4-D , IAA ，6-BA和NAA , 所需浓度在0.0110mg/L 范围内；细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA ，使用的浓度范围在0.110mg/L,生长素和细胞分裂素的作用,生长素：启动细胞分裂的重要激素，是植物细胞脱分化、形成愈伤组织过程中不可缺少的物质。 细胞分裂素：能够使已脱分化的细胞，或细胞团保持持续有丝分裂 生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。,2.1.3 愈伤组织诱导过程,起动期 又称为诱导期，是愈伤组织形成的起点。这时在外观上虽然未见明显变化，但实际上细胞内一些大分子代谢动态已发生明显的改变，细胞正积极为下一步分裂进行准备。 分裂期 外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。这时组织细胞代谢十分活跃，发生了一系列生理生化及形态的变化。 形成期 是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期。这个时期特征是细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的分裂逐渐减慢和停止，接着内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加。,愈伤组织的诱导过程,2.1.4 愈伤组织的形态特征,质地不同的愈伤组织之间有时是可以互换的，有时则是不可逆的。 不同类型之间的愈伤组织互换主要通过改变激素浓度的方法来实现。培养基中加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆；反之，减少或去除生长物质，则使松脆的愈伤组织转变为坚实的愈伤组织。,2.2 愈伤组织的继代培养,愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一次培养基称为一代继代培养(subculture) 。,Subcultures are usually performed every 3 to 6 weeks!,为什么要进行继代培养？ 培养基中的养分大量消耗； 培养基中的水分散失； 琼脂培养基褐化或发黑(因为植物组织在培养前几周有时会产生毒素物质，这些物质会扩散进入培养基); 由于植物材料的原因使培养基pH降低，导致培养基液化； 生长物已充满培养瓶，培养物扩繁的需要；,半夏是一味中药，具有燥湿化痰，和胃止呕的作用，在对半夏细胞培养的研究中发现，其生长曲线呈S型。15天左右时生长速度减缓，生长至21天时，达到平台期，有抑制其生长的因素。通过分析pH的变化可以看出15天左右时，pH急剧下降。,法国百里香愈伤组织培养基中电导率变化,愈伤组织褐化,第三节 器官建成,形态建成，又叫形态发生，指有机体生长发育中组织结构和生理功能发生一系列变化，形成或再生成特定结构和器官的过程。 器官建成：又叫器官发生，指培养细胞在适宜的诱导培养条件下产生不定芽和不定根等器官的过程。,3.1 器官发生,在适合的激素浓度和配比以及温光条件下，愈伤组织细胞会发生生理代谢上的改变，促使细胞分裂部位和方向改变，首先出现分生细胞，经细胞分裂逐渐形成分生细胞团和分生组织，进一步再分化形成维管结节直至分化成芽和根等器官。,第二种方式为先根后芽;,第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根， 再通过维管组织的联系形成完整植株。,第一种方式是先芽后根;,3.2 植株再生的方式,实例：非洲紫罗兰的组织培养,6,5,4,3,2,1,柑橘组织培养再生植株,3.3 影响器官建成的因素,器官建成假说 激素学说 拟分生组织学说 位置效应理论 胞间信息传递假说,影响器官建成的因素1外植体,物种、种、甚至品种间再生能力是不同的 同一植株不同器官或同一器官不同部位的外植体，其再生能力不同； 外植体在原植物体上所达到的发育程度和结构与功能对器官离体再生也有较大差异； 取材时间（季节）不同再生能力不同； 外植体的大小对再生也有较大影响。,沙棘通过叶片和根实现再建,不同基因型矮牵牛和迷你矮牵牛分化率,影响器官建成的因素2培养基成分,植物激素的浓度、比例 乙烯 碳源的种类和浓度,影响器官建成的因素3培养环境条件,培养基的物理状态液固状态、渗透压 培养基的化学性质pH 光照光照时间、光照强度、光照周期（连续/间隔）、光质 温度,第四节 体细胞胚胎建成,体细胞胚胎建成：又叫体细胞胚胎发生，指诱导体细胞形成体细胞胚 ，并进一步再生出完整植株的过程。,4.1 胚状体(embryoid )的概念,胚状体(体细胞胚, Somatic embyo)：离体培养中，没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程形成的胚的类似物。,4.2 体细胞胚的发生途径,1、从外植体直接发生 2、经胚性愈伤组织发生 3、悬浮培养细胞发生,4.3 体细胞胚的发生过程:,4.3 体细胞胚的发育,一个正常胚的发育一般要经过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最后发育成完整的小植株。但有些植物如柑橘胚培养胚状体的发育可能缺乏某一形态时期，这种胚状体有时称为畸形胚。,又叫胚状体，是组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构 。 从胚状体的这个概念可以看出： 胚状体不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合的产物； 胚状体不同于孤雌胚或孤雄胚，因为它不是无融合生殖的产物； 胚状体不同于组织培养中通过器官发生途径形成的茎芽和根，因为它的形成须经历与合子胚相似的发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性结构。,体细胞胚,体细胞胚发育再生成植株有两个明显的特点：,一是体细胞胚具有双极性（double polarity）；,二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系 较少，即出现所谓的生理隔离（physiological isolation）现象。,4.4 影响体细胞胚发生的因素,1、生长素（2,4-D）有利于诱导体细胞胚的形成，但是抑制体细胞胚的发育。 2、培养基中的氮源影响体细胞胚的发生频率。 3、不同基因型间体细胞胚的形成能力有差异。,4.4.1 影响体细胞胚胎发生和发育的因素 外植体,物种、种、甚至品种间 外植体的年龄 幼龄状态的组织比老龄组织易于诱导产生胚状体 愈伤组织的继代次数、时间,4.4.2 影响体细胞胚胎发生和发育的因素 培养基成分,金属离子K+ 、Fe2+ 、Zn 2+ 、Cu 2+ 、Co 2+ 、Mn 2+ 等对胚状体的发生或发育有促进作用 。 氮素氮含量、氮源形态，搭配使用NH4-和NO3-较为方便 、有效。 生长素生长素的存在可能对体细胞胚的形成有抑制作用。 以胡萝卜体细胞胚的诱导为例。,4.4.3 影响体细胞胚胎发生和发育的因素 培养的环境条件,培养基的渗透压 pH 光照 温度 培养瓶内气体成分（O2、CO2等）,第五节 人工种子,植物组织培养再生植株的途径,5.1 人工种子的概念,将植物离体培养产生的体细胞胚包埋于含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。（Kamada,1985） 任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均或称之为人工种子。 （陈正华等，1998）,5.2 人工种子的优点,1.建立高效快速的植物无性繁殖方法（无性繁殖植物）。 2.对于制种困难的优异杂种种子可以快速获得大量种子。 3.用于快速繁殖不能正常产生种子的特殊植物材料。 4.与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制。 5.与利用试管苗相比，可避免移栽困难，实现机械化操作，便于储藏和运输。,5.3 人工种子的生产流程,1、繁殖体的人工诱导与生产增殖,2、繁殖体的筛选和预处理,胚状体； 微芽； 原球茎,后熟培养； 人工筛选； 脱水干燥,3、人工种子的包埋,繁殖体的预处理,人工胚乳：,人工种皮:海藻酸钠 明胶果胶酸钠等,繁殖体的包埋,Artificial seed production from encapsulated PLBs regenerated from leaf base of Vanda coerulea,人工种子生产中的问题,1、能够产生胚状体的植物较少。目前约200多种。 2、还不能够直接播种，因为没有合适的种皮“材料”。 3、海藻酸钠作为包埋剂的缺点是渗透性强。,THE END,
