抗原与抗体的相互作用及免疫学检测.ppt
第七章 抗原与抗体的相互作用及免疫学检测,体液免疫的基础是抗原和抗体分子的结合，这种结合可以是游离形式的，也可以结合在细胞表面。 通过抗原抗体的结合继发出各种生理效应，如：溶细胞效应、促吞噬作用、凝集作用、沉淀作用、调节作用等，形成一整套机体体液免疫功能。 抗原决定簇与抗体结合部位的结合，要求分子结构有互补性，也因此具有高度的特异性。,第一节 抗原与抗体反应的特点,一、特异性 抗原与抗体相互结合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。抗原抗体的结合并没有共价键形成，而是由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。,抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以下几种： 1、盐键（离子键） 2、范德华力 3、疏水作用 4、氢键,二、抗原与抗体结合的可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应 Ab+Ag Ab:Ag 由于抗原抗体结合的可逆性，可利用亲和层析法分离纯化抗原或抗体；利用待测抗原和标准抗原与抗体的竞争结合，进行抗原或抗体的定量测定，如放免检测法、酶联免疫吸附法等,三、抗原与抗体反应中量的关系 当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。这些可见现象的出现是以抗原与抗体反应特异性和亲和力为基础的，同时也是抗原抗体反应的继发过程。 当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。,在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比例。只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。,抗原抗体凝集（沉淀）反应形成的特点：,1、抗原结合价必须在2价以上； 2、抗体结合价也必须是2价或2价以上； 3、抗原抗体能形成复合物但不一定能形成沉淀； 4、抗原抗体结合形成大分子凝集物的前提是要求其结合价彼此饱和； 5、当抗原大大过量时，只有溶解状态的抗原抗体复合物，而无沉淀出现，在免疫检测中称为前带现象。,第二节 抗血清的制备和抗体的纯化,抗体产生的特异免疫应答是指机体受外源物质刺激后，产生体液免疫和细胞免疫的过程。在这一免疫应答过程中，除依赖于抗原物质有特定的化学结构外，还依赖于动物机体的免疫应答能力。机体免疫应答能力又受遗传因素的控制及机体的生理状况、抗原物质进入机体的途径和佐剂的使用等因素的影响。 由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同种动物、同种不同品系甚至不同个体，产生免疫应答的强弱是不同的。因此，在进行动物免疫时，必须选择对该抗原敏感的动物，而且必须是年轻的、健康的。常用的动物有马、羊、兔、鼠和豚鼠。,当抗原初次进入具有应答能力的动物体内后，经过一段较长的潜伏期才出现抗体，又经过一段高峰期后，抗体量逐渐下降直至消失。这段时间总的抗体量是较低的，主要成分是IgM，此为机体对抗原的初次反应。但当抗原再次进入该机体时，血清中抗体很快出现，含量也远高于初次反应，其抗体成分主要是IgG，此为再次反应。,佐剂在抗血清制备中的作用： 由于佐剂有吸附和包埋抗原的“储藏所”作用，延长了抗原在体内的存留时间，便于抗原较长时间的、不间断的刺激机体免疫系统，使初次反应与再次反应结合在一起，其免疫效果更为理想。另外，在佐剂中含有激活巨噬细胞等生理功能的卡介苗类物质，可提高抗原的免疫原性，因此要获得高效价的抗血清，常使用各种类型的佐剂。,动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴结、脾脏、足掌、眼睑结膜等是反应敏感部位，也是免疫动物的常用部位。,一、动物的免疫,1、抗原用量：0.5mg/kg 2、佐剂：弗氏佐剂 弗氏佐剂的成分和使用 3、免疫方法：淋巴结注射、腹部皮下注射、四足掌皮内注射。 4、免疫次数：每隔7-10天免疫一次，共需3-4次。第二次免疫后开始测效价。,二、抗血清制备和抗体效价测定,1、采血方法：兔颈动脉放血、兔心脏取血、兔耳缘静脉放血、鼠心脏取血、剪尾采血、眼窝采血。 2、抗血清制备：血液室温放置1-2h或冰箱内4度过夜，血清便可充分析出，用滴管吸出或离心分离取得。分离好的血清加入0.02%叠氮化钠，在4度冰箱内保存可长达半年。 3、效价测定：用免疫动物时的抗原浓度作抗体效价测定的抗原浓度。以出现沉淀反应的抗血清的最大稀释倍数来表示抗血清的效价。,三、免疫球蛋白的纯化,由于抗原抗体的结合具有高度的特异性，在免疫检测中常常直接运用抗血清进行，而无需对抗体进行纯化。 随着免疫检测技术的发展，如用铁蛋白、胶体金等标记抗体作免疫电镜观测，用荧光素、酶、同位素标记抗体作组织细胞染色，或对抗原进行定量测定，就必须对抗体进行纯化，但这类的纯化多数是类别的纯化。,抗体纯化的方法： 1、硫铵盐析法：简便、蛋白质变性较少，33%饱和度的硫铵可以沉淀所有各类免疫球蛋白；缺点是分离的纯度较差，对IgA类抗体来说，浓盐可使其形成二聚体，不宜采用。,2、Cohn冷酒精沉淀法：,IgA相对分子量160000，IgM相对分子量1000000，故可通过分子筛将两者分开而得到纯品。,3、硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法纯化IgG 在pH7.5的溶液中IgG带正电，其他血清蛋白带负电，因此阴离子交换剂DEAE-纤维素可以一次将IgG提纯到很高的纯度,4、IgM的纯化方法：18%饱和度硫铵沉淀+DEAE-纤维素柱层析法。,第三节 抗原与抗体反应-免疫检测法,抗原与抗体结合后，只有出现可见的反应，如凝集、溶血、沉淀实验等，或用荧光素、酶、放射性同位素等标记方法提高可测性，才便于在免疫检测中运用。可见性反应的出现，对抗原抗体分子合适比例的要求远比对彼此绝对量方面要高得多。这就是说，一方面在进行免疫检测时要注意抗原抗体的用量；另一方面只要提高可见度或可测性，便可大大提高免疫检测方法的灵敏度。,一、凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。,二、沉淀反应,当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成沉淀。 1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。 2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，37度保温10-20min，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。,3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。 沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。,双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。,抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。,4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量,另外还有其他众多的免疫检测技术和手段，其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。只不过其检测的对象和检测的目的各有不同。,三、补体结合试验,当抗体与细菌、红细胞等颗粒抗原结合并形成抗原抗体复合物后，可结合补体引起溶菌、溶血效应。用补体结合试验既可以测知患者血清中补体的总量，也可以检测未知抗原或抗体的量。 测定人血清补体总量的方法是以绵羊红血球的溶血为指示。当绵羊红血球与抗绵羊红血球结合后，加患者血清，观测溶血程度。,用于测定未知抗原/抗体时，采用两套系统，一套是待测的抗原抗体系统，称为检测系统，一套是包括绵羊红血球和抗绵羊红血球抗体的指示系统。待测系统中有无待测得抗原/抗体是利用指示系统中是否出现溶血来判断。 反应的过程是首先加待测得抗原/抗体，反应一段时间后加入补体，在反应一段时间后加指示系统。有待测抗原抗体结合时，必然结合补体，不会出现溶血，没有待测物质时出现溶血。,四、荧光抗体技术,免疫荧光法是将荧光素与特异性血清抗体以化学方式结合起来，然后将此荧光标记了的抗体作为一种试剂在特定条件下浸染标本，使与标本中相应的抗原产生结合反应，再在荧光显微镜下，以紫外光为光源进行观察。当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。 免疫荧光法有直接法和间接法两种。,第四节 免疫亲和层析,生物高分子具有能和某种相对应的专一分子可逆结合的特性，例如酶的活性中心或别构中心能和专一的底物、抑制剂、辅助因子效应剂通过某些次级键相结合，并在一定条件下又可以解离。抗体与抗原，激素及其受体，核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有类似的特性。这种高分子和配基之间形成专一的可解离的复合物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析就称为亲和层析。,亲和层析法的基本过程： 1、偶联：将欲分离的高分子物质的配基在不影响其生物功能的情况下与水不相溶性的载体结合，制成亲和吸附剂或免疫吸附剂。 2、装柱：在层析柱内装入固相化的配基 3、亲和层析：含有高分子物质的混合液在有利于配基和高分子之间形成复合物的条件下进入装有亲和吸附剂的层析柱。高分子物质结合留在柱内，其他杂质流出。 4、洗脱：改变条件，促使配基和高分子物质分离而释放出需要的物质。 5、再生：将亲和层析柱的充分洗涤再生，用于下一周期的纯化工作。,
