鉴定类实验xinkejian.ppt

鉴定类实验,还原性糖、脂肪、蛋白质、淀粉的鉴定,一、实验目的： 尝试用化学试剂检测生物组织中糖类、脂肪和蛋白质,思考1阅读课本P18，完成下列表格：,思考2试以葡萄糖为例写出相应方程式： 葡萄糖+ Cu ( OH ) 2 葡萄糖酸 + Cu 2O（砖红色）+ H 2O 思考3蛋白质检测的反应机制是什么？ 蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+结合成紫色的化合物。颜色深浅与蛋白质白质浓度成正比。,斐林试剂,砖红色沉淀,碘,蓝色,双缩脲试剂,紫色,苏丹染液/苏丹染液,橘黄色/红色,二、实验原理,三实验材料 思考4做可溶性还原性糖鉴定实验应选择什么样的实验材料？为什么？ 思考5做脂肪的鉴定实验应选择什么样的实验材料？ 思考6做蛋白质的鉴定实验应选择什么样的实验材料？,选用含糖较高，而且组织的颜色较浅，或近于白色的，如苹果、梨。避免干扰或影响实验结果的正常颜色。,应选富含脂肪的种子，以花生种子为最好，实验前一般要浸泡34小时（也可用蓖麻种子）。,可用富含蛋白质的黄豆或鸡蛋清。,四、实验试剂 斐林试剂（包括甲液：质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和乙液：质量浓度为0.05g/ mL CuSO4溶液）、苏丹或苏丹染液、双缩脲试剂（包括A液：质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和B液：质量浓度为0.01g/ mL CuSO4溶液）、体积分数为50%的酒精液，碘液、蒸馏水。,思考7斐林试剂与双缩脲试剂相同吗？为什么？,不同；虽然它们的成份都是NaOH溶液和CuSO4溶液配制而成，但它们的溶液浓度不同，使用的原理不同（斐林试剂实质是新配制的Cu ( OH ) 2与还原性糖发生反应，而双缩脲试剂实质是在碱性环境下的Cu2+与肽键发生反应），使用的方法也不同。,思考8上述的酒精溶液起作用？,洗去浮色,五、方法步骤： 1、还原糖检测和观察的操作方法： 制备组织样液（去皮、切块、研磨、过滤）取1支试管，向试管内注入2mL组织样液向试管内注入1mL新制的斐林试剂，振荡试管放在盛有50-650C温水的大烧杯中，加热约2分钟，观察到溶液颜色。,思考9为什么苹果或梨组织液必须临时制备？ 思考10实验中应将组成斐林试剂的甲液、乙液分别配制、储存，使用前才将甲、乙液等量混匀成斐林试剂，为什么？,因苹果多酚氧化酶含量高，组织液很易被氧化成褐色，将产生的颜色掩盖。,斐林试剂很不稳定，甲、乙液混合保存时，生成的Cu ( OH ) 2在70900C下分解成黑色CuO和水；,思考11实验中能否将甲液、乙液分别加入苹果组织样液中进行检测？为什么？ 思考12还原糖溶液检测过程中出现的颜色变化过程是怎样的？,不能；因为甲、乙液分别加入时可能会与组织样液发生反应，无Cu ( OH ) 2生成，影响实验结果。,浅蓝色 棕色 砖红色（沉淀）,2、脂肪检测和观察的操作方法： 方法一：向待测组织液中滴加3滴苏丹染液，观察样液被染色的情况； 方法二：取材切片制片观察 思考13为什么切片要尽可能薄些？ 思考14制片过程中为什么要洗去浮色？ 思考15制片过程中为什么要用吸水纸吸去花生子叶周围的酒精？ 思考16制片过程中为什么在盖上盖玻片前要滴加蒸馏水？,切片要尽可能薄些，便于观察。,不洗去浮色，会影响对橘黄色脂肪滴的观察。,酒精是脂溶性溶剂，可将花生细胞中的脂肪颗粒溶解成油滴。,滴上蒸馏水可防止盖盖玻片时产生气泡。,3、蛋白质检测和观察的操作方法： 制备组织样液（浸泡、去皮研磨、过滤）加样液约2ml于试管中加入双缩脲试剂A，摇匀再加入双缩脲试剂B液34滴，摇匀观察颜色变化。,思考17检测时为什么要先加双缩脲试剂A液后加B液，而不能同时加入？,先加NaOH溶液，为Cu2+与蛋白质反应提供一个碱性的环境。A、B液同时加入，会导致Cu2+变成Cu ( OH ) 2沉淀，而失效。,思考18检测时向试管内加双缩脲试剂B液4滴，为什么CuSO4溶液不能多加？,因为多加CuSO4溶液，Cu ( OH ) 2的蓝色会遮盖反应的真实颜色。,4、淀粉检测和观察的操作方法： 用试管取2ml待测组织样液 向试管内滴加2滴碘液 观察颜色变化。 注意：碘液不要滴太多，以免影响颜色观察。,六、应用： 例题1：安徽阜阳劣质奶粉事件曝光后，有关部门对收缴的劣质奶粉进行了化验，发现不法商人为了降低成本，在其中添加了大量糖类物质，让婴儿喜欢吃却无法得到足够的蛋白质营养。请回答： (1) 长期以劣质奶粉为主食的婴儿会成为“大头娃娃”，这是由于缺乏蛋白质导致血浆渗透压下降，血浆中的大量水分进入 造成的。 (2) 有些劣质奶粉中含有大量还原糖，如果用斐林试剂鉴定，则该试剂与待测样液在试管中混合均匀后，还必须经过 处理；预计试管内混合液的颜色变化是 。 (3) 如果用双缩脲试剂鉴定劣质奶粉是否含有蛋白质，那么，将待测样液注入试管之后，注入试剂的顺序应该是 。 (4) 如果劣质奶粉含有大量脂肪，则用苏丹染液鉴定时，预计染液与待测样液混合后的颜色是 。,织液(或组织间组隙),将试管放进盛有热水的烧杯中加热煮沸(12min)； 由蓝色变为砖红色,由蓝色变为砖红色,先注入双缩脲试剂A(或01gmLNaOH溶液)，再注入双缩脲试剂B(或001gmLCuS04溶液),例题2：胰高血糖素对小白鼠和人具有相同的生理作用。为了验证“胰高血糖素具有升高血糖的生理作用”，请以小鼠为实验对象设计实验步骤，预测和解释实验应出现的结果，并写出实验结论。 （一）实验材料和用具： 正常实验小白鼠只，生理盐水，用生理盐水配制的适宜浓度的胰高血糖素溶液，斐林试剂，注射器，试管等。 （二）实验步骤： （实验提示：采用腹腔注射给药，给药剂量不作实验设计要求；给药小时后，用注射器在小鼠膀胱处穿刺取尿液。）,（1）确定一只鼠为实验鼠，腹腔注射胰高血糖素溶液；另一只鼠为对照鼠，腹腔注射等量生理盐水 。 （2）将两支试管分别编号为1号和2号，各加入等量的斐林试剂 。 （3）给药1小时后，对两只小白鼠采尿液，实验鼠尿液放入1号试管内，对照鼠尿液放入2号试管内 。 （4）将两支试管摇匀后，放入盛有开水的烧杯内加热煮沸，观察两支试管溶液颜色的变化。,（三）实验结果的预测、解释和结论：,1号试管中应该出现砖红沉淀，说明实验鼠尿液中有葡萄糖；2号试管中仍为蓝色溶液，表明对照鼠尿液中无葡萄糖。实验结论：实验鼠血糖升高，超过一定数值而出现糖尿，是胰高血糖素具有升高血糖的生理作用所引起的。,叶绿体色素的提取和分离（必修一P97一 一实验目的： 思考题 1尝试用 方法提取叶绿体中的色素和用 法分离提取到的色素。 2分析实验结果，探究叶绿体中有几种色素，以及各自所呈现的颜色。 二实验原理： 1叶绿体中的色素是有机物，不溶于水，易溶于丙酮等有机溶剂中，所以用丙酮、乙醇等能提取色素。 2叶绿体色素在层析液中的溶解度不同，溶解度 随层析液在滤纸上扩散得快，溶解度 随层析液在滤纸上扩散得慢。）,过滤,纸层析,高的,低的,三、实验材料：幼嫩、鲜绿的菠菜叶 四、实验步骤： 1提取色素：5克绿叶剪碎，放入研钵，加少量SiO2、CaCO3和无水乙醇，迅速、充分研磨。 加SiO2、加CaCO3的目的是什么？,加SiO2为了研磨得更充分；加CaCO3防止研磨时叶绿素受到破坏。,2收集滤液：漏斗基部放一单层尼龙布，研磨倒入漏斗内挤压，将滤液收集到小试管中，用棉花塞塞住试管口。 3制备滤纸条：将干燥的滤纸，顺着纸纹剪成长10cm，宽1cm的纸条，一端剪去二个角，并在距这一端1cm处划一铅笔线。,将干燥的滤纸的一端剪去二个角的目的是什么？ 。 4画滤液细线：用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线划出细、齐、直的一条滤液细线，干后重复三次。 思考题为什么滤液细线越细、越齐越好？ 为什么画滤液细线需要重复三次？,可使层析液同时到达滤液细线，层析时，色素分离效果好,为了防止色素带之间部分重叠。,为了增加色素在滤纸上的附着量，实验结果更明显。,5分离绿叶中的色素 将3mL层析液倒入烧杯中，将滤纸条（划线一端朝下）插入层析液中，用培养皿盖盖上烧杯。注意：层析液不能没及滤纸条的滤液细线，烧杯要盖培养皿盖。 为什么烧杯要盖培养皿盖？ 6观察实验结果 请在右图中标示出相应的色素及其颜色： 提取和分离叶绿体色素的关键是什么？,层析液中的苯、丙酮、石油醚易挥发,提取叶绿体色素的关键是：叶片要新鲜、浓绿；研磨要迅速、充分；滤液收集后，要及时用棉塞将试管口塞紧。分离叶绿体色素的关键是：一是滤液细线要细且直，而且要重复划几次；二是层析液不能没及滤液线。,DNA的粗提取与鉴定（选修IP54） 一、实验目的：初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。 二、实验原理： 1DNA的溶解性： 思考题1：DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？ 思考题2：利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开？,DNA在氯化钠溶液中的溶解度，随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为014mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；,DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步地分离。,2DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 3细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和细胞核膜的破裂，据此可得到含有核DNA的溶液。 4DNA的鉴定： 思考题3：依据什么原理来鉴定DNA？,DNA遇二苯胺（沸水浴）被染成蓝色，所以可用二苯胺作鉴定。,三、实验材料：鸡血细胞液 思考题4：生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，他们能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？,不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。,四、实验步骤： 1制备鸡血细胞液：在鸡血中加入质量浓度为01g/mL的柠檬酸钠溶液，离心处理； 2提取鸡血细胞的细胞核物质：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤； 思考题5：加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？ 3溶解细胞核内的DNA：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态； 4析出含DNA的黏稠物：加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌； 思考题6：此时加入蒸馏水的目的是什么？,加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。,使氯化钠溶液浓度接近014mol/L，使DNA最大限度地析出。,5滤取含DNA的黏稠物：过滤； 思考题7：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？ 6将DNA的黏稠物再溶解：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态； 7过滤含有DNA的氯化钠溶液：过滤； 思考题8：这一步骤的目的是什么？ 思考题9：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,不一样；这次过滤是为了去除不溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。,除去含有DNA滤液中的杂质；,用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,8提取含杂质较少的DNA：加入冷却的95%的酒精，搅拌； 思考题10：这一步骤的目的是什么？ 思考题11：为什么加入的酒精需要冷却的？ 9DNA的鉴定：取两支试管，各加入0015mol/L的氯化钠溶液5mL，一支加入提取的DNA，两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。 思考题12：为什么要设置对照组？实验中能观察到什么现象？,去除溶于酒精的杂质；,可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。,确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应；实验组试管中可看到溶液变蓝色。,实验三DNA的粗提取与鉴定,1、三次过滤 2、两次加蒸馏水 3、两次沉淀的析出 4、DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线 5、鉴定试剂,三次过滤,两次加蒸馏水,2 两次沉淀析出,实验三DNA的粗提取与鉴定,4 DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线,实验三DNA的粗提取与鉴定,溶解度,某些物质的鉴定 ：,斐林试剂,双缩脲试剂,苏丹、苏丹,二苯胺,先混匀再加入、水浴加热,先加入A液，再加入B液,染色,混匀水浴加热,砖红色沉淀,紫色物质,橘黄色、红色,蓝色,