第二部分细菌感染实验诊断.ppt

第二章细菌感染实验诊断,疾病的种类不断发生变迁，传染病如 鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌 引起的内源性感染却明显增多。同时，新 的病原菌不断出现，原有的病原菌因变异、 耐药等又重新流行。,目前，临床遇到主要是条件致病菌， 引起的感染。正常菌群与病原菌的致病 性是相对的，因此，既不要轻易认为分 离出的非致病菌是污染菌，也不要轻易 认为所发现的细菌就是该感染的病原菌， 必须结合临床进行进一步的诊断。,第一节 临床感染性疾病 实验诊断要求,一、诊断的目的 1.以疾病的病原学诊断为目的,只需鉴 定到细菌的种。 2.为提供治疗方案为目的，要进行临 床标本的直接药物敏感试验。,3.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。 4.以了解细菌与感染的关系为目的,应 该做细致的鉴定。,二、诊断试验的选择,1.选择有鉴定价值的试验。 2.选择简易、快速、方便的试验，达 到目的即可。,3.综合考虑试验的敏感性和特异性。 敏感性=阳性结果数/感染病人数，越高假阴性就越少。 特异性=阴性结果数/未感染病人数，越高假阳性就越少。,三、常用诊断流程,1.双歧索引 用于相互区别比较容易,有特征的细菌，如革兰阴性杆菌初步分群；对于相互区别较难的细菌，鉴定项目较多,用起来不太方便。,2.表解法： 将各种细菌及其多种特性列成矩阵表 格，使相互的区别点十分明显，便于 分析比较。此法对于相互区别比较复 杂的细菌，如肠杆菌科的初步分属。,3.数字编码鉴定法,将所得生化反应模式转化成数学模式，可把细菌生化反应结果转化成数字，经检索手册又可将转化成细菌名称。与电脑分析软件配套，形成了半自动或全自动细菌分析系统。,第二节 临床标本的采集 与处理,一、标本采集的一般原则 1.病程早期、急性期或症状典型时， 使用抗生素前。 2.无菌采集 应无污染，严格进行无 菌操作。,3.根据目的菌的特性用不同的方法采集 适量标本，采集量不应过少。 4.注意在不同病程采集不同部位标本。 5.采集标本时要防止传播和自身感染。,二、标本的处理,1.标本保存在4环境中，在2h之内送检。 脑脊液则要在25 保存，用于细菌培 养的标本保存时间不应超过24h。对环 境敏感的细菌应保温并立即送检。,2.标本中可能含有致病菌，必须注意安全 防护。切勿污染环境。对于烈性传染病 标本运送时更要由专人运送，严格按规 定包装。,3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管 内运送，有时可直接用抽取标本的注射 器运送。,第三节 细菌形态学检查,一、显 微 镜 1.普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌 均能清 楚看到。 2.暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋 体的形态及运动观察。 3.相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态 及某些内部结构。,4.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用 于免疫荧光技术中。 5.电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显 微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后 者适于对细菌表面结构及附件观察。,二、不染色细菌标本检查,1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。可对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。 2.螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。,三、细菌染色标本的检查,细菌标本经染色后，除能清楚看 到细菌的形态、大小、排列方式外， 还可根据染色反应将细菌进行分类。,(一)常用染料,分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。 1碱性染料 电离后显色离子带正电荷， 易与带负电荷的被染物结合。由于细菌 均带负电荷，易与染料结合而着色。常 用的有碱性复红、结晶紫、美蓝等。,2酸性染料 电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。,3复合染料(中性染料)及荧光染料 复合染料是碱性染料和酸性染料的 复合物，如瑞氏染料(伊红美蓝)、 姬姆萨染料(伊红天青)等；荧光染 料如荧光标记的抗体，荧光素常用 异硫氢基荧光素。这些染色常用于 某些特殊的染色技术中。,（二）常用的染色方法,在细菌感染标本的检查中，临床上常 用的染色方法有革兰染色、抗酸染色 和荧光染色。,1革兰染色,最经典、最常用的染色方法。在分离 培养前都要进行革兰染色、镜检。通 过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G- 菌两大类，可初步识别细菌，有助于 进一步鉴定。,结合细菌特殊结构及排列方式，对病 原菌可进行鉴定，其结果为临床早期诊断 及治疗提供了依据。 革兰染色可为临床选择用药提供参考， 帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为 G+菌和G-菌对抗生素敏感性不同，且致病 物质 及其作用机理也不同。,2抗酸染色,将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两 大类。因为大多数病原菌为非抗酸性，所 以抗酸染色不作为常规检查项目。 只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴 定结果。对疾病的诊断和治疗具有重要参 考价值。,3荧光染色 敏感性强，效率高而且容易观察结果，在 临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于 结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌 及痢疾志贺菌等的检测。 此外还有： 鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量， 在细菌鉴定中很重要。 异染颗粒染色镜检异染颗粒，为临床早期诊断 白喉提供依据。,第四节细菌分离培养与接种技术,绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。,（一）细菌室的符合条件,1细菌室必须安装严密的门窗，以防室 内环境受到外界的污染。且室内禁用 风扇，避免细菌的播散。 2细菌室必须安装供空气消毒的紫外线 灯，置于操作台上面lm处，每天开始 工作前照射 20min。对其消毒效果要 定期检查，及时更换失效的灯管。,3室内应备有消毒剂，用于试验中发生 菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还 应备有供工作人员浸手用的盛有消毒 剂的水盆、肥皂及自来水源等。 4室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地 面至少一周用消毒剂擦洗1次。,5对接收的标本、无菌器具、用过的物 品等应明显分开井放在指定位置。同 时要对用过的物品及时进行灭菌处理。 6细菌室应有当地的气温特点的消防设 备。,(二)无菌实验室,1无菌室应完全封闭，人员出入应 有两道门，其间应隔有 缓冲区。 2用前应以紫外线消毒30min，定期 用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。,3在无菌室中一般仅限于分装无菌的 培养基及传染性强的细菌的接种， 不进行有菌标本的分离及其他操作。 4无菌室内应仅限操作人员进人，而且 进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操 作时戴口罩，随时保证室内的无菌状 态。,5条件有限的实验室，可用超净工作台 代替无菌实验室进行相应的操作。超 净工作台应选择垂直气流通风方式。 6无菌室应配备空调设备，保证不因室 温而影响工作。,(三)基本设备和器具,用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧 培养设备； 用于观察细菌形态及标本直接镜检的显 微镜； 用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤 箱；,用于储存培养基、诊断用血清、抗生素 及菌种等的冰箱和冷藏柜； 用于挑取标本、接种等的接种器具，包 括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计； 用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯； 还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器 皿，以及离心机、天平等。,二、培 养 基,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖 使用的混合营养物制品。 适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、 传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、 生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和 必不可少的手段。,(一)培养基的组成成分,1.营养物质: (1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖类；(5)血液；(6)无机盐类； (7)鸡蛋和动物血清；(8)生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，还有生长因子。 2.凝固物质 制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半乳糖胶，98以上时可溶于水，在45 以下则凝固成凝胶状态。 3.抑制剂和指示剂 用于选择、鉴定及判断结果。,(二)培养基种类,1基础培养基 含有生长所需的基本营 养成分，称肉汤，用于增菌、检验， 是制备其他培养基的基础成分。 2营养培养基 在基础培养基中可加入 葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分， 供营养要求较高的细菌和须要特殊生 长因子的细菌生长。最常用的是血平 板等。,3鉴别培养基 利用细菌分解能力及代 谢产物的不同，在培养基中加入特定 的作用底物和指示剂，观察细菌生长 过程中分解底物所释放的不同产物， 通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。 如糖发酵培养基。,4选择培养基 在培养基中加入抑制剂而 抑制杂菌生长，有助于对所选择的细菌 生长。 5特殊培养基包括厌氧培养基和细菌L型 培养基等。,(三)分离培养基的选择,依据卫生部临床检验中心推荐，应备有 如下分离培养基： 1血平板 适于各类细菌的生长。 2巧克力血平板 其中含有V和X因子， 适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的 标本。,3中国蓝平板或伊红美蓝平板 有选择地 促进G_菌生长，是较好的弱选择性培养 基。 4麦康凯平板 具中等强度选择性，是非 发酵菌鉴定的依据。 5SS琼脂 有较强的抑菌力，用于志贺菌 和沙门菌的分离。,6碱性琼脂 用于从粪便中分离霍乱弧菌 及其它弧菌。 7血液增菌培养基 用于从血液、骨髓中 分离常见病原菌。 8营养肉汤 用于标本及各类细菌的增菌。,三、细菌接种与分离技术,(一)平板划线分离法 1连续划线分离法 此法主要用于 杂菌不多的标本。 2分区划线分离法 本法适用于杂 菌量较多的标本。获得单个菌落。,(二)斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。 (三)液体接种法 多用于一些液体生化试验管的接种。 (四)穿刺接种法在试管内壁与液面交接处 的此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。,(五)倾注平板法 测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数 时常用此方法。 (六)涂布接种法 常用于纸片法药物敏感性测定，也可 用于被检标本中的细菌计数。,四、细菌培养方法,(一)需氧培养法 最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。,(二)二氧化碳培养法 常以下列方法供给 C02。 1二氧化碳培养箱 是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。 此法适于大型实验室应用。,2烛缸法 将已接种好的培养基置 干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5-10，然后将干燥器放入35 温箱内培养。,3化学法 按每升容积加入碳酸氢钠04g和浓盐 酸035ml的比例，分别置于容器内。将容 器连同接种好的培养基都放人干燥器内， 盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与 碳酸氢钠接触生成CO2。 (三)厌氧培养法,第五节细菌产物的检测及鉴定,一、细菌毒素的检测 (一)内毒素的测定 主要用于诊断病人是否发生革兰阴性 细菌感染。另外，还可用于检测注射用液 和生物制品有无内毒素污染。,1细菌内毒素的致热作用 常以家兔作为实验动物，家兔正常体温385 40 。抽取被检物注入家兔耳静脉，记录体温变化情况，分析实验结果。,2鲎试验 鲎血液的有核变形细胞内含凝 固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。 本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可检查出0005 00005gml内毒素。且操作简便，速度快，在2h内即可得出结论。,(二)外毒素的测定,1体内毒力试验 细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。,2体外毒力试验 外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。如白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定。 ELISA法 如葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定。,二、细菌生化反应鉴定,不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。,(一)碳水化合物的代谢试验,1糖(醇、苷)类发酵试验 (1)原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有的能分解，有的仅能分解1-2种，还有的不能分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利用鉴别细菌。,(2)培养基：在培养基中加入0.5-1的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)。可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 (3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数h小时至2w后，观察结果。,(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象;若不分解，除有细菌生长外，无任何变化。 (5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要 。,2氧化一发酵试验(OF试验),(1)原理：细菌分解葡萄糖必须有分子氧参加的称为氧化型；进行无氧降解的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。 (2)培养基HL：Hugh-Leifson二氏培养基。,(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm。将培养基于35 培养48h或更长。 (4)结果：两支培养基均无变化为产碱型或小分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 (5)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别型或产碱型。也呵用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,3-半乳糖苷酶试验,(1)原理：有的细菌可产生 ·半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚· -D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。,(2)试剂：O75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液(69g NaH 2PO4溶于45ml蒸馏水中，用30NaOH调控pH为7.0，再加水至50ml)5ml，置4冰箱中保存。,（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37 水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min3小时观察结果。,(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在2030min内显色。 (5)应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,4七叶苷水解试验,(1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。 (2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。,(3)方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。 (4)结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。 (5)应用：主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。,5甲基红试验,(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至45以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则pH 62以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。,(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。 (3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2-4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。 (4)结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。,(5)应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属则为阴性。,6V-P试验,(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性。 (2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。,(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35 培养48h后加入甲液(6n·萘酚酒精溶液)和乙液(40KOH溶液)，振摇。 (4)结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35 4h后仍如故者即为阴性。 (5)应用：常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。,