第四生药的显微鉴定技术.ppt

,生药的鉴定,兰州大学药学院,目的要求： 1、掌握生药鉴定的目的，鉴定的标准，鉴定的一般程序，基原鉴定和性状鉴定的概念和一般步骤。 2、熟悉性状和基原鉴定的主要特点。 教学时数： 2学时。 教学难点：生药鉴定的标准和一般程序。 教具：生药学教学课件,复习题： 1 、掌握生药鉴定的目的意义、标准和一般程序是什么？ 2、基原鉴定和性状鉴定的概念、一般步骤是什么？ 3 、基原鉴定及性状鉴定的特点是什么？,生药鉴定的概念：,就是依据国家药典、有关资料规定或有关专著对生药作真实性、纯度及品质优良度的鉴定。,生药鉴定的意义：,发掘中医药学遗产，整理中药品种。尽量做到一药一名，互不混淆，保证生药品种的真实性、疗效和用药安全。,制订生药质量标准，促进生药标准化。,寻找和利用新药资源，发展中药事业。,生药鉴定的一般程序：,检品登记： 按规定取样： 杂质检查： 品种鉴定： 品质鉴定： 写出鉴定报告：,真实性鉴定的意义,同名异物：如各地区使用的商品白头翁主要基源的有：蔷薇科植物委陵菜、翻白草；毛茛科植物野棉花、打破碗花花；菊科植物毛大丁草、山荻、 火绒草、漏芦、羊耳菊；石竹科植物白鼓钉；玄参科植物鹿茸草；唇形科植物白毛夏枯草等 在不同地区被当作白头翁使用。,白头翁Pulsatilla chinensis,根入药, 清热解毒,凉血止痢.,白鼓钉,委陵菜,白头翁,学名：I. lanceolatum A.C.Smith,英文名：Poisonous Eightangle,莽草,八角茴香,学名：Illicium verum Hook,英文名：Star Anise Fruit,木通科木通,木通 Akebia quinata (Thunb.) Decne.,三叶木通 Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz.,小木通Clematis armandii Franch. 绣球藤Clematis montana Buch.-Ham.,毛茛科川木通,马兜铃科关木通,东北马兜铃 Aristolochia manshuriensis Kom.,真实性鉴定的手段,性状鉴定macroscopical identification 显微鉴定microscopical identification 理化鉴定physico-chemical identification DNA分子标记鉴定DNA molecular identification,一、性状鉴定,生药性状鉴定是运用人体的感官看、摸、闻、尝及水试、火试等直观的方法，对生药的性状，包括形态、大小、色泽、表面、质地、断面、气味等特征作为依据而进行鉴别的方法。 观察对象：完整的生药及饮片,一、性状鉴定,形状(shape) 大小(size) 色泽(coluor) 表面(surface) 质地(texture) 断面(fracture) 气(odour) 味 (taste) 水试 (water-based test) 火试 (fire-based test),看、摸、闻、尝,山参-短横体或横灵体 马蹄大黄 味连鸡爪形 马尾当归 雅连蚕形 鸡骨常山 云连钩状形如蝎尾 剑骨乌梢蛇 乌头、马兜铃、钩藤,长短 粗细 宽窄 薄厚,玄参要黑 茜草要红 黄连要黄 绵马贯众根茎、叶柄基部断面变为棕黑色× 枸杞子、牛膝变黑不可用,生药鉴定常用方法：,基原鉴定（分类学鉴定）： 概念：利用分类学的知识，对生药的来源进行鉴定，确定学名和药用部分 步骤：实地调查和采集标本 观察、记录植物形态 核对文献进行鉴定：中国植物志、中国高等植物科属检索表、中国经济植物志、中国药用植物图鉴、中国高等植物图鉴、中药志、中药大辞典、新华本草、植物分类学报等。 原始文献 核对标本：对有疑问的生药进行最后鉴定 特点：是生药鉴定和一切研究工作（生药生产、资源开发、新药研制）的基础，鉴定比较准确，但采集标本较难。,生药鉴定常用方法：,性状鉴定： 概念：利用眼看、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等十分简便的方法对生药的外观性状进行鉴定，确定生药真伪优劣的方法。 内容包括：形状、大小、颜色、表面特征、质地、断面特征、气、味，水试、火试。党参的“狮子盘头”，松贝的“怀中抱月”，海马的“马头蛇尾瓦愣身”，野山参的“雁脖芦，圆肩膀,枣核丁，铁线纹，珍珠须”，何首乌的“云锦纹”，黄芪断面的“菊花心”，苍术断面的“朱砂点”。 特点：简便易行，不需要特殊的仪器设备，但需要有一定的工作经验,同时难以对粉末类生药及中成药进行鉴定。,一些常用的术语： 根类外形：常用头（根、根茎的上端）、芦 （根端短缩的根茎）、身（主根部分）、 梢（根下部或支根）、须（须根或小 根）、纹、皱、槽、沟、连珠（根、根 茎膨大部分成连珠状）等描述。 断面特征：常用心（中心部）、菊花纹、车轮 纹、云锦纹、网纹（均指断面呈现的各种 纹形）、朱砂点（指红色油室）、粉尘 （指淀粉）、霜（指析出的结晶）等词形 容。,川芎性状鉴别,不规则结节状拳形团块； 表面深褐色，有多数隆起的环状轮节，并有多数瘤状突起的茎痕； 纵切片边缘不整齐，形似蝴蝶（习称蝴蝶片），切片类黄色，可见黄色油点（油室）散在； 香气浓郁特异； 稍有麻舌感，微回甜。,川芎遍体疙瘩疣，切面花纹蝴蝶形， 表皮黄褐香气窜，活血祛瘀散风痛。,来源鉴定,性状鉴定,显微鉴定,理化鉴定,四大鉴定,生药鉴定,性状鉴定的内容,1.看形状,3.看表面,4.验质地,5.看断面,6.嗅气尝味,2.,量大小,黄芪,黄芩,三棱,(圆柱形),(圆锥形),(扁卵状圆锥形),半夏,类球形,麦冬,纺锤形,桃仁,扁长卵形,不规则块状,熟地,厚朴,卷筒状,黄柏,板片状,芦长碗密枣核艼，紧皮细纹珍珠须,防风根茎“蚯蚓头”,海 马,石决明,夏枯草,味 连,雅 连,云 连,鸡骨常山,狗贴耳（鱼腥草）,蓝（胆矾）,黄（蒲黄）,红（西红花）,白（僵蚕）,黑（熟地）,在描述复合色的药材 时，应以后一种为主,黄绿色（荆芥穗）,红棕色（何首乌）,黄白色（川贝母）,毛茸（辛夷）,钩刺（苍耳子）,纵皱纹（桔梗）,环纹（防风）,光滑（相思子）,莪术,大血藤,槟榔,鸡血藤,何首乌,大黄,嗅气尝味,取样要有代表性 口尝时咀嚼1分钟 有刺激性和剧毒的药材，口尝小心，以免中毒,一般术语,角质：泛指含大量淀粉的药材蒸、煮加工后糊化呈半透明状，且质地坚硬。如郁金、天麻。也指叶片或其他器官表面被有的一层蜡质物质。 松泡：指药材质地疏松且有空洞，捏之下陷，称松泡，如南沙参。,菊花心：指药材横切面上维管束与较窄的射线排列形成的细密放射状纹理，状似开放的菊花，如甘草，黄芪等。,金钱环：指果实药材顶端花柱基痕周围的一圈环纹，如作枳实药用的香圆的果实。,吐脂：又称起霜。指苍术饮片暴露稍久后，所含桉油醇成分析出的结晶，因呈毛状，色白如脂霜，而称吐脂或起霜。,一般术语,油润：药材质地柔软，含油而润泽，谓之油润。 车轮纹：指根或茎类药材横切面上维管束与较宽的射线相间排列成稀疏整齐的放射状纹理，状如木制车轮，如广防己、关木通等。,朱砂点：药材断面上棕红色麻点，色如朱砂，如苍术、白芷、木香等。,云锦花纹 又称云纹。指何首乌的块根横切面皮层中出多个异型维管束组成的云朵状花纹。,粉性：药材富含淀粉粒，折断时有粉尘飞出。如天花粉、山药、贝母等。,性状鉴定小结,1.性状鉴定的内容： 看形状：形状是指干燥药材形态 量大小：大小是药材的长短、粗细和厚薄 看表面：表面是指药材个子货的最外层或饮片未经刀切的部分 验质地：质地是指药材的软硬、疏松、致密、粘性或粉性等特征 看断面：断面是指药材的折断面、切断面和碎断面 嗅气尝味：注意有强烈刺激性和剧毒的药材，口尝时要特别小 心，以免中毒,2.观察性状的原则是：先整体后局部。局部则先上后下，先外后内。,3.性状鉴定的优点：简单、易行、迅速,显微鉴定,（一）定义： 通过利用显微镜来观察生药内部的组织构造、细胞形状及细胞后含物的特征，来鉴定生药真伪优劣的方法。 （二）适用范围： 外观性状相似不易识别的生药 破碎的生药 粉末类生药或以粉末生药制成的中成药（丸、散、锭、丹）。,（三）步骤： 制片： 临时制片：徒手切片、表片装片、 粉末制片、解离组织片； 永久制片：石蜡切片（横切片和纵切片） 观察、测量。（注意及时记录） 绘图、照相。 核对有关标准和资料。 写出鉴定报告。,显微鉴定的内容,（一）组织鉴定（histological identification) 通过观察植（动）物器官的各种切片，以生药的组织构造、细胞形状和内含物形态等特征来鉴定生药的真伪。 （二）粉末鉴定（powder identification) 通过生药的粉末制片，观察细胞、内含物的形态特征来鉴定生药的真伪。 （三）显微化学反应（micro-chemical reaction) 显微化化学反应是将生药的干粉、手切片或浸出液少量，置于载玻片上，滴加某些化学试剂使产生沉淀或结晶，在显微镜下观察反应结果；或产生特殊的颜色，从而进行鉴定。,1.细胞壁性质鉴定 （1）木质化细胞壁 装片中加间苯三酚试液及浓盐酸显红色或紫红色。 （2）木栓化或角质化细胞壁 装片中加苏丹试液，呈橘红色至红色。 （3）纤维素细胞壁 装片中加氯化锌碘试液或先加碘试液再加硫酸溶液显蓝色或紫色。 （4）硅质化细胞壁 装片中加入硫酸无变化。,2.生药组织切片或粉末中的后含物的鉴定 （1）淀粉粒：甘油醋酸试液或蒸馏水装片观察,用偏光显微镜观察未糊化淀粉粒的偏光现象；加碘试液，显蓝色或蓝紫色； （2）糊粉粒：用甘油装片观察;加碘试液，显棕色或黄棕色，加硝酸汞试液显砖红色； （3）脂肪油、挥发油或树脂：加苏丹试液呈橘红色、红色或紫红色；加乙醇脂肪油不溶解，挥发油测溶解； （4）菊糖：乙醇装片或水合氯醛液装片不加热立即观察。加10萘酚的乙醇溶液，再加硫酸，显紫红色并很快溶解； （5）粘液：加钌红试液显红色； （6）草酸钙结晶：加硫酸溶液逐渐溶解，并析出针状硫酸钙结晶； （7）碳酸钙（钟乳体）：稀盐酸溶解，有气泡产生； （8）硅质：加硫酸不溶解。,3.细胞内化学成分的鉴定 黄连粉末+稀盐酸针簇状小檗碱盐酸结晶析出 +30%硝酸针状小檗碱硝酸盐结晶析出。 肉桂粉末+氯仿23滴，略浸渍，+2%盐酸苯肼1滴， 黄色针状或杆状结晶（示桂皮醛反应）。 槟榔粉末酸性水滤液+碘化铋钾试液发生浑浊，放置后可见石榴红色球形或方形结晶（示槟榔碱反应）。 番木鳖胚乳薄片置白磁板上 +1%钒酸铵的硫酸溶液1滴，显紫色（示番木鳖碱）； +发烟硝酸1滴，显橙红色（示马钱子碱）。 北柴胡横切片+1滴无水乙醇-浓硫酸(1:1)液木栓层，栓内层和皮层显黄绿色蓝绿色，示此柴胡的有效成分柴胡皂甙存在于以上部位。,4.微量升华 定义：利用生药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其形状、颜色以及化学反应作为鉴别特征。 茶叶的升华物，为白色针状结晶（咖啡碱）。加浓盐酸1滴溶解升华物，再加氯化金试液，得黄色针状结晶（咖啡碱氯化金络盐）。 大黄的升华物为黄色针状或羽状结晶（蒽醌化合物），加碱液溶解并显红色。 牡丹皮、徐长卿根的升华物为长柱状或针状、羽状结晶（牡丹酚）。 薄荷的升华物为无色针簇状结晶（薄荷脑）；加浓硫酸2滴及香荚兰醛结晶少许，显橙黄色，再加蒸馏水1滴即变紫红色。 斑蝥的升华物在130140为白色柱状或小片状结晶（斑蝥素）；加碱溶解，再加酸又析出结晶。,中成药显微鉴别,中药丸散锭丹等成方制剂，大多直接用各种粉末生药及生药浸膏配制而成。 显微鉴定是鉴定中成药丸散锭丹和制定品质标志的科学方法之一，对保证中成药的质量，有一定的科学意义和应用价值。,生药的粉末鉴定研究对于中成药的科学鉴定有重要作用。 1了解组方生药、剂型和制法 熟悉处方中组成药物的显微特征是中成药鉴别的基础。 中成药的显微鉴别要比中药材粉末鉴别复杂得多，制备方法及辅料等会产生一定的影响和干扰。,2. 根据处方明确专属特征 中成药显微鉴定，一般根据处方，对各组成生药粉末特征作分析比较，选取各药具专属性的显微特征，作为鉴别依据。,六味地黄丸,【处方】 熟地黄 160g 山茱萸(制) 80g 山药 80g 茯苓 60g 泽泻 60g 牡丹皮 60g 【制法】 以上六味，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末加炼蜜3550g与适量的水，泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜80110g制成小蜜丸或大蜜丸，即得。 【性状】 本品为棕黑色的水蜜丸、黑褐色的小蜜丸或大蜜丸；味甜而酸。 【功能主治】滋阴补肾。用于头晕耳鸣，腰膝酸软，遗精盗汗。,熟地黄,【功能主治】 滋阴补血，益精填髓。用于肝肾阴虚，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，内热消渴，血虚萎黄，心悸怔忡，月经不调，崩漏下血，眩晕耳鸣，须发早白。,熟地黄,熟地黄粉末：灰黑色。 薄壁组织：淡灰棕色或黑棕色，细胞类多角形，含灰棕色核状物。 分泌细胞：含橙黄色或橘红色油滴及分泌物（以水合氯醛液装置，不加热）。 导管：具缘纹孔及网纹 木栓细胞：棕黑色 草酸钙小方晶：少数,山 茱 萸,【性味】 性微温，味酸、涩。具有补益肝肾、涩精固脱之功能。 【功用】 用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴。,2 粉末特征： 外果皮细胞：淡橙黄色，表面观类多角形或稍长，垂周壁念珠状增厚，细胞排列紧密，胞腔内偶见黄色块状物， 中果皮薄壁细胞：甚多，橙棕色，大多皱缩，界限不明显； 草酸钙簇晶：直径733m； 菊糖：类圆形 石细胞：通常单个散在，纹孔多而密，孔沟明显，胞腔大，有时含淡棕色物； 导管：多见螺纹和环纹 纤维：少数,山 药,【性味】 性平，味甘。具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精之功能。 【功用】 用于脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳、肾虚遗精、带下、尿频、虚热消渴。炒山药补脾健胃，用于脾虚食少、泄泻便溏、白带过多。,粉末：类白色。 淀粉粒：单粒多扁卵形，也有类圆形、三角状卵形或矩圆形，直径835m，长至48m，脐点点状、人字状、十字状或短缝状，位于较小端，层纹明显；复粒稀少，由23分粒组成。 草酸钙针晶束：甚大，存在于粘液细胞中 具缘纹孔、网纹、螺纹及环纹导管,牡丹皮,【性味与归经】 性寒，味苦、辛.归心、肝、肾经。 【功能主治】 清热凉血，活血行瘀。用于温毒发斑、吐、衄、便血，骨蒸劳热，经闭痛经，痈肿疮毒，跌扑伤痛。,牡丹皮粉末： 1. 淀粉粒：单粒类球形 2. 草酸钙簇晶：含晶细胞有时数个连接，簇晶排列成行；也有一个薄壁细胞中含数个簇晶。 3. 木栓细胞：壁稍厚，浅红色。,茯 苓,【性味与归经】 甘、淡，平。歸心、肺、脾、腎經。 【功效】 利水滲濕，健脾，化痰，寧心安神,泽 泻,【性味】 性寒，味甘。 【功能主治】 利尿，清热。用于小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、高血脂症。,粉末(去外皮）：米黄色， 淀粉粒： 薄壁细胞：可见多数椭圆形纹孔集成的纹孔域。 导管：螺纹、梯纹、网纹、孔纹等 内皮层细胞：表面观垂周壁波状弯曲，稍厚，木化，有纤细的孔沟。 纤维：壁厚、木化。 油室：大多已破碎，完整者类圆形。,【鉴别】 取本品，置显微镜下观察： 1.淀粉粒三角状卵形或矩圆形，直径24 40m,脐点短缝状或人字状。 2.不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛液溶化；菌丝无色， 直径46m。 3.薄壁组织灰棕色至黑棕色，细胞多皱缩，内含棕色核状物。 4.草酸钙簇晶 存在于无色薄壁细胞中，有时数个排列成行。 5.果皮表皮细胞橙黄色，表面观类多角形， 垂周壁略连珠状增厚。 6.薄壁细胞类圆形，有椭圆形纹孔，集成纹孔群。,显微鉴定应注意的问题,（1）保护组织的类型和细胞形状。表皮有无毛茸，气孔的形式等。 （2）维管束的排列方式，有无异常构造，异常构造发生的部位。 （3）分泌组织（腺毛、分泌腔、分泌道、乳汁管）的有无、形状和存在部位。 （4）厚壁组织存在的部位、排列方式，细胞形状、壁的薄厚、木化程度、壁孔形状等。 （5）导管或管胞的形状、木化程度和纹孔形态。 （6）细胞内含物的性质、形态和大小，如淀粉粒的形状、大小、脐点和层纹的有无等；草酸钙结晶的形状和大小；特有内含物的显微化学反应等。 （7）花粉粒或种子的形状、大小和表面雕纹的特征。,思考题： 1.何为显微鉴定？适用范围？ 2.水合氯醛液装片透化的目的？ 3.生药组织切片或粉末中常见的后含物及鉴别方法？ 4.举例说明生药中常见的细胞壁特化及鉴别方法？ 5.以六味地黄丸为例，说明中成药显微鉴别要点 ？,三 显微鉴定 (microscopic identification),利用显微技术对药材进行显微分析，以确定其品种和质量的一种鉴定方法。包括：组织鉴定用于完整药材或粉末特征相似的同属药材鉴定；粉末鉴定用于破碎、粉末状药材和中成药鉴定。,制片方法： 首先要根据显微观察的不同目的制作不同的制片，例如要： 观察组织构造：通常使用的切片方法有：徒手切片法：通常将选择好的材料两端切齐，以左手持材料，右手持刀片，从左前向右后水平切割材料（切片时随时以水湿润刀口），将切片以毛笔扫入盛水的平皿中，然后从切片中挑选较好者制片，以备显微观察。,显微鉴定的常用方法,此法适合较幼嫩的地下器官、嫩茎、较粗的叶柄、较幼嫩的果实、种子等器官。也可用两片双面刀片并齐，在桌面上或硬的支撑物上下切，可获得薄厚理想的切片（适合薄的材料，如叶片、花的各部等）。,滑走切片法:利用滑走切片机代替徒手切片的一种方法。适合较坚硬、较粗大的材料。通常将选择好的材料固定于切片机上，调整好厚薄（050微米）就可以切片。同样将切片置于水中，挑选较薄的进行制片观察。 石蜡制片法；,附页：,石蜡制片技术： 石蜡制片又叫永久制片，是观察植物组织构造常用的制片方法之一。其优点主要是适合各种植物组织的制片，切片的厚薄易于控制（最薄可达0.5微米），清晰度很好，亦适合作细胞学研究，并能够制成连续切片，制片易于长久保存，易于交流等。但制片周期较长，易受条件限制，制片中使用化学试剂较多，对人有一定毒害，易使材料变脆、变硬或变形，某些内含物易于消失，常使组织变小，甚至使组织扭转变形，细胞所含物质缩小而折光性增强，影响观察正确性，且制片成本较高等。虽然这样，但是石蜡制片仍不失为一种很好的制片方法，被人们常采用。,主要的基础理论和技术方法： 首先要明确,在这种条件下,植物的组织或部位不能直接用来切片,首先要按照该方法的要求,将材料进行程序化处理,终究要让所起填充作用的石蜡进入到材料的细胞中,然后带石蜡在切片机上进行切片,再染色、封藏。这样的程序中，中间过程是十分复杂的，往往随材料的不同，而方法有所不同，在实际工作中要不断地摸索,不断地总结,只有这样,才有可能做出好的片子。,选择切片材料是全部切片工作的第一步，如果选择的材料不适当或有错误，以后的工作将是没有意义的。选择材料时要注意具有代表性,植物的器官或器官的某一部位,其组织构造往往能够代表整个器官的基本情况,但不同部位,即便是同一器官,其组织构造,亦有一定的过渡差异,通常在选择材料时,要注意选择器官靠中间的部位作为试验材料,当然如果是作生长发育观察,则另当别论。因此选好试验材料，对于整个实验至关重要。,当选择好材料后，实验的主要过程有以下步骤： 材料的固定或软化冲洗脱水透明浸蜡包埋切片贴片烘片脱蜡 二重染色封片。,制片程序简介：,a.材料的固定或软化： 最好用新鲜的固定材料（新鲜材料可迅速杀死植物细胞，并可最大程度保持组织和细胞的自然状态，这就是所说的杀死和固定）。干材料可先行软化（常用温水浸泡，勤换水，勿使材料腐烂）。,一种固定液兼有杀死和固定双重作用，固定液能否迅速渗透于组织中，既与固定液本身的穿透能力有关，也因组织的致密程度有关，因此要根据材料的情况选择固定液，一般的固定液中，FAA固定液的作用较快（叶类材料至少4小时，或824小时、木类材料3天到一周），而含有铬酸的固定液作用较慢（叶类材料至少8小时，木类材料一周以上，期间最好更换一项固定液）。组织细胞的杀死和固定是同时发生的。,所谓杀死是指在很短的时间内终止细胞的生命力；固定是指在杀死的同时，保存了组织细胞的构造基本上没有改变，其目的有以下几点：防止组织细胞中细菌和酶的活动而引起霉烂。减少组织细胞在以后程序中的收缩和变形。植物细胞在生活状态下，有些结构模糊不清，经固定使各部分结构清晰可辨。 经过固定的材料，组织细胞容易着色。,b.冲洗： 若为固定的材料，制片前用流水冲洗直至固定液被彻底置换干净。水溶性固定液要用水洗，特别是含有铬酸的固定液应用流水冲洗，醇溶性固定液，应以固定液中酒精浓度相等或相近的酒精洗涤。,流水冲洗时以慢速流水进行冲洗，切忌流速太快使材料上下翻飞而使材料损坏；用酒精混合固定液固定的材料，用同浓度的酒精溶液更换洗涤；固定液中含有苦味酸，无论它是水溶性还是酒精溶液，一定要用酒精溶液洗涤；含有铬酸或其它金属离子的材料可流水冲洗424小时，以彻底清除金属离子。,c.脱水： 经过冲洗或软化的材料，因组织内含有大量的水分，在以下的步骤中会有干扰，故须将水脱干净。通常预先配制好从10%100%的梯度酒精溶液，在一定时间范围内逐级置换. 注：梯度、时间要视材料的性质而定，不能一概而论，直至到达100%的酒精两次。,梯度酒精脱水时间可按材料的大小、质地情况而定，如较幼嫩的根及根茎、茎、叶等材料，在70以下浓度的酒精，一般2小时更换一次，70以上的酒精约在4小时以上更换一次。在一般情况下，材料应在70酒精中过夜；坚硬的木质材料，每级度酒精需48小时；材料进入70酒精以上时，每级度酒精要更换12次。,d.透明： 因以下的步骤是使用脂溶性很强的石蜡，但以上最末步骤的纯酒精，亦不会与此相溶，因此本步骤的关键是选择一个界于二者之间的溶媒，以实现自然过渡。通常选择二甲苯，与无水酒精配成梯度并在一定时间范围内逐级置换，直至达纯二甲苯两次。,e.浸蜡： 使组织细胞内浸入石蜡，以填充组织间隙和细胞内，是以下各步骤的关键所在。以上步骤所选择的二甲苯可以和石蜡相溶，因此将二者配置成不同的梯度，并在一定的时间范围内逐级更换（注：本步骤可在恒温箱中进行），直至纯石蜡两次。,f.包埋：,将材料与熔融的石蜡凝固在一起,叫包埋。这个过程要求动作要娴熟、快速、到位，通常所用的工具有镊子、酒精灯、包埋模具（金属或用纸自己折叠）、冷水等。在此过程中，要注意材料在蜡块中的位置，这与以后的各过程好坏有一定关系。,g.切片 将包埋好的蜡块修理成梯形（中央有材料），再将蜡块熔粘在特制的木块上，然后固定在旋转切片机上进行切片。将切下的蜡片用镊子摆放在深色的纸上（靠刀口面朝下）。若蜡带不直，则要修正蜡块的几个边，使之规则后再切；若连不成带状，说明蜡质过硬或室温过低；若卷片，说明刀口角度不适或刀钝感。,h.贴片：将切好的蜡片按需要分割成一定长短，用镊子夹放在预先准备好的温水上（水温以不会使蜡片熔散但要使蜡片充分展开为度），贴于预先清洗洁净的玻片上，用吸水纸吸去周围的水分，摆放在平盒中。,i.烘片：将贴好的片子连同平盒放于温箱中（温度以低于石蜡熔点约5度），以蜡片下水分充分蒸发，蜡片充分紧贴于玻片上为度。 j.脱蜡：将烘好的蜡片放置于纯二甲苯溶液中脱蜡（此为染片的第一步，在染色缸中进行），以材料周围洁净、清晰为度。,k.染色：脱蜡后，将片子转移至下一步。其步骤大致如下：片子（无蜡片）二甲苯：纯酒精（1：1）纯酒精各级酒精番红水溶液染色水清洗（除去多余的染料）各级酒精（脱水至95%酒精）95%的酒精亮绿溶液二重染色（亦可用龙胆紫染色）洗涤与脱水（95%纯酒精）透明（纯酒精：二甲苯1：1至2：1至纯二甲苯）封藏（以加拿大树脂胶或光学树脂胶的二甲苯溶胶液封片）烘片（在温箱中以低温约35度烘干或自然干燥）贴签。,观察表面特征：有些幼嫩的器官其表面具有丰富的显微特征，由于横切片角度的关系，其表面的特征观察不全面，因此，可以通过表面片进行观察，效果就比较理想。,（一）表面制片方法：系将表皮组织制成显微观察片的一种方法。适用于观察叶片、花瓣、花萼及果实或草本植物茎表皮组织的形状、气孔类型、毛茸特征和类型、角质层的纹理以及各种细胞内含物等的显微特征。 表面制片的方法和步骤： 擦净玻片：用纱布或绸布将载玻片和盖玻片洗擦干净，要求玻片清洁、明亮、不留污迹。,通常用眼科镊子夹住叶片或果实等的表面，轻轻撕取其表皮层，约5mm2。若为干燥材料，可将材料用温水浸泡使表皮润湿和软化后，撕取表皮。 制片：将水合氯醛或醋酸甘油1-2滴滴于载玻片中央。取表皮组织，破损面朝下，放入试液中（一定要沉入试液之内），使表皮组织上下均有试液，并展平以不出现气泡为好（可用镊子的平面轻压赶出气泡），再用镊子夹住盖玻片的一边，使另一边先与试液接触，随试液流动慢慢地盖上盖玻片，有利于将气泡赶出。若盖玻片,内还留有少数气泡，可用镊子轻轻挤压赶出气泡或在盖玻片一边再加1滴试液，趁水流赶压出气泡。若片内气泡太多，尤其是标本上下均有气泡，必须揭起盖玻片加1-2滴试液，移动标本，赶出气泡再盖片，至片内无气泡为止。再用吸水纸吸去盖玻片周围多余试液，使盖玻片和标本不流动较固定为止。 检查：将制片放入显微镜下观察，若发现标本放反了（破损面朝上）或折叠较多或气泡太多，应重新制片。 清理制片：制片观察完毕后，必须将载玻片和盖玻片清洗擦干后，才能放回玻片盒内，不能不清洗擦干就放回，否则玻片粘连，无法再用，尤其是盖玻片。,组织解离法：为了观察植物组织中单个细胞的特征，通常使用组织解离（或叫细胞离体）法进行处理，就可以达到目的。通常使用的方法有： 氢氧化钾（钠）法：材料（柔软）+5KOH或NaOH(水浴加热)轻压即散封片。,硝铬酸法（常用）：10硝酸+10铬酸等量混合材料（浸泡）1-2天或更长。 浓硝酸氯酸钾法（较硬的材料）： 材料+硝酸沸水加热1min加氯酸钾加热材料成粉状冲洗制片观察。,粉末观察法：a.水装片 常用蒸馏水。在水的装置下，粘液质、树胶等被溶解，但水不能溶解多数细胞内含物，也不易浸透细胞壁，故细胞组织不透明，观察不够清楚。水装置大多用于观察生药中是否含有淀粉粒等多糖类物质，以及淀粉粒的形态，如再滴加稀碘液则更易观察清楚，但水往往容易引起淀粉粒膨胀变形，欲测定淀粉粒大小时不宜用（可改用醋酸甘油溶液）。为了防止水分蒸腾标本片干燥，可在蒸馏水中加少许稀甘油。甘油尚能溶解某些细胞内含物，使标本片较为透明。另外斯氏液（甘油醋酸液）为观察淀粉粒的最佳封藏剂，可使淀粉粒在较长的时间内保持原来的状态而不膨胀变形，便于测定其大小。,生药的显微鉴定技术（续）,2.稀甘油 用于观察糊粉粒、淀粉粒及其他多糖类物质，为显微制片中最常用的封藏剂。经水合氯醛透化的显微标本滴加稀甘油封藏可防止水合氯醛析出结晶干扰观察。此外，甘油酒精液作为封藏剂的适用范围同稀甘油，只不过其透明作用较强。,3.水合氯醛装片 以31至11的水溶液为常用。水合氯醛液为最优良的透明剂之一，除能溶解淀粉粒、蛋白质、挥发油、色素、油脂、树脂、叶绿素等物质外，尚具有迅速透入组织的作用，并能使因干燥而致收缩的细胞膨胀。水合氯醛装片通常分为不透化（不需加热）和透化（需加热）装片两种。透化装片时通常取粉末（或切片）少许，置于载玻片上，滴加水合氯醛溶液2-3滴，混匀后在小火焰上缓缓加热至近沸，加热过程用牙签不时搅动，然后离开火焰片刻，随时滴加适当溶液以免蒸干，如是视情况操作二三次，以促使加速透明，并可驱尽气泡，最后滴加适量稀甘油，加盖玻片，进行观察。,本法滴加稀甘油的目的主要有三个： 加入适量的稀甘油，防止水合氯醛在室温较低的情况下析出结晶，干扰观察； 保持一定的湿度，防止标本因封藏剂蒸发而干燥； 进一步使标本更加透明。,