第四部分基因工程GeneEngineering教学课件.ppt
第四节 基因工程 Gene Engineering,基因工程定义,基因工程：指通过人工方法将目的基因与载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞，从而使受体细胞获得新的遗传性状的一种崭新的育种措施.,第一节 基因工程概述,一、基因工程的发展历史 （一）理论上的三大发现： （二）技术上的三大发明： （三）基因工程的诞生 （四）基因工程的几个方面,3、60年代，Nirenbery等科学家确定了遗传信息的传递方式：DNARNA蛋白质的中心法则。,（一）理论上的三大发现 1、1944年Avery的转化实验 证明了核酸是遗传的物质基础,2、1953年Watson和Crick弄清了生物遗传物质的分子机制： 阐明了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。,3、基因工程的载体（质粒）的发现： 从1946年起，LEDERBERG开始研究细菌的性因子-F因子，经过50年代和60年代，相继发现其它质粒，如抗药因子（R因子），到1973年COHEN将质粒作为基因工程的载体使用,（二）技术上的三大发明 1、DNA的特异切割 1970年Smith和Wilcox等人从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制酶。从而为人们随意切割DNA提供了一把利剪。,2、DNA连接酶的发现 1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。,（三）基因工程的诞生 1973年，Cohen等实现了细菌间性状的转移。 这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。,（四）基因工程的几个方面 1、基因工程技术的“神奇”所在 2、“多利”的克隆 3、基因工程技术与我们,1、基因工程技术的神奇所在？,而通过基因工程技术现在只要用10L发酵液就可获得同样的产量。,实例1 胰岛素的提取：100000胰脏只能提取34克，,而用“工程菌”进行发酵生产，则只要几升发酵液就可取得同样数量的产品。,实例2 生长激素释放因子（一种十四肽，能抑制其他激素的释放和治疗糖尿病）：它原来要从羊的脑下垂体中提取，宰50万头羊也只能提取5毫克的产品，,1962约翰·格登宣布他用一个成年细胞克隆出一只蝌蚪,1984斯蒂恩·威拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊,1996用成年哺乳动物细胞克隆出的个体克隆羊Dolly出世,2000美国科学家用无性繁殖技术成功地克隆出一只猴子,2001年美、意科学家联手展开克隆人的工作,1996-2000欧美日俄中国等多国科学家成功克隆多种动物,上世纪50年代科学家成功无性繁育出非洲爪蟾,2、“多利”的克隆,体细胞克隆技术Dolly诞生记,生产小羊,从克隆过程看“多利“,克隆羊“多利”没有父亲，但却有着三个母亲,三个母亲中，后两个只是形式上的母亲,“多利”实际上是第一个母亲的百分之百的“复制品”,“多利”的这一发生过程就叫“无性繁殖“,体细胞克隆成功率低,将434个体细胞的核移植至434个去核卵中，产生的融合细胞为277个，成功率为63.8,将277个移植卵移到输卵管成功者247个,成功率为89.2,在输卵管能够发育到胚胎阶段者29个，成功率为117,将29个胚胎移植至13只代理母羊子宫中获得成功者为1个,妊娠率7.7,总的成功率为1：434,即用434个含体细胞核的卵移植入去核卵内,经过种种阶段,最后只产生出一只克隆羊。,在一定条件下，已经分化过程的体细胞仍然是具有全能性的,结论,禁止“克隆”人被各国立法并已成联合国公约,3、基因工程技术与我们,第二节 基因工程原理,一、基因工程工具酶 二、核酸的提取操作和检测技术 三、基因工程操作步骤,一、基因工程工具酶 限制性内切酶,2、命名和分类 命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示。 如：EcoRI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出的酶。,1、定义：是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。,3、限制性内切酶的基本特性,（1）形成粘性末端（cohesive end / sticky end) （2）形成平末端(blunt end),常用限制酶的种类 及切割方式,切点出现的频率及片断大小,部分消化和完全消化,DNA限制酶分析,其它工具酶,连接酶 T4 DNA Ligase 1967 修补工具酶 DNA聚合酶I 大片断 Klenow 1971 末端加工酶 S1核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶 末端转移酶 人工加polyA 或polyT 尾 反转录酶,二、核酸的提取操作和检测技术 1、质粒DNA的提取 2、电泳和DNA紫外检测,M 1 2 3,Kb. 23.1 9.4 6.5 4.3 2.3 2.0,图6 质粒酶切及去磷 M Hindmarkers 1 pUC18 2,3 pUC18酶切,二、基因工程的基本操作步骤,1、目的基因的取得 2、 载体的选择 3、目的基因与载体DNA的体外重组 4、重组载体引入受体细胞 5、表达筛选,基因工程的操作步骤示意图,1、目的基因的取得,1） 从适当的供体细胞的DNA中分离。 2） 通过逆转录酶的作用由mRNA合成cDNA。 3） 由化学方法合成特定功能的基因。,M 1 2 3,Kb. 23.1 9.4 6.5 4.3 2.3 2.0,图3 不同酶切时间电泳图 M Hindmarkers 1 酶切10分钟 2 酶切20分钟 3 酶切5分钟,回收2-7Kb DNA,2、载体的选择 I,1）是一个有自我复制能力的复制子（replicon) 2) 能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率。 3） 载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。 4） 载体上必须有一种选择遗传标记，以便及时将“工程菌”选择出来。,载体的种类： 1、质粒载体 2、入噬菌体载体 3、柯斯质粒载体 4、M13噬菌体载体 5、真核细胞的克隆载体：酶母质粒载体、病毒载体 6、人工染色体,3、目的基因与载体DNA的体外重组,限制性内切酶的处理和人为在DNA的3末端加上polyA或polyT，两个DNA产生互补粘性末端，“退火”处理，双链重新形成，在外界连接酶的作用下形成一个完全有复制能力的环状重组载体。,4、重组载体引入受体细胞,重组载体引入受体细胞，使基因扩增和表达出供体基因所提供的部分遗传性状。,5、表达筛选,1、抗生素平板法 2、插入失活法 3、插入表达法 4、B-半乳糖苷酶显色反应法,1、抗生素平板法,2、插入失活法,无乳糖存在时,3、插入表达法,4、B-半乳糖苷酶显色反应法,培养基中含 X-gal 和IPTG X-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚B-D-半乳糖苷 IPTG：异丙醇B-D-硫代半乳糖苷 B-半乳糖苷酶可以把培养基中无色的X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，使菌落成蓝色,二、基因工程的应用,一、基因工程药物 ：胰岛素 二、转基因植物：转基因棉花 三、转基因动物：转基因猪、鱼等 四、基因治疗：向靶细胞中引入具有正常功能的基因。,基因治疗,例如在1971年，有人对人类半乳糖血症遗传病患者的成纤维细胞进行过离体培养，然后将E.coli的DNA作为供体基因，并通过病毒作载体进行转移，结果使这一细胞的遗传病得到了“治疗”，因而也能利用半乳糖了。,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,原理：优良的纯种；创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受到抑制，难以突变的环境条件： （1）定期移植保藏法 （2）液体石蜡保藏法 （3）沙管保藏法、土壤保藏法 （4）麸皮保藏法 （5）蒸馏水保藏法 （6）冷冻干燥保藏法,The end,
