酶底物法(科立得)产品培训.ppt
水中微生物检测的全球领导者 叶卫军 电话：13929538576,水中微生物检测（新国标方法）,总大肠菌群/大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群 固定底物技术酶底物法介绍,总大肠菌群 / 大肠埃希氏菌 及耐热(粪)大肠菌群 固定底物技术酶底物法,微生物检测的重要性,地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所污染，特别是粪便污染，如水体中含有肠道病原菌株，并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株可引起急性腹泻。 通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。,指示菌的方法学定义,总大肠菌群（Total Coliforms) 大肠菌群系指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。 耐热大肠菌群(Thermotolerant Coliforms) ，原名：粪大肠菌群（Fecal Coliforms ) 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。 大肠埃希氏菌（大肠杆菌，E.Coli.) 大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。,背景知识 大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌,耐热大肠菌群,大肠埃希氏菌,大肠菌群,目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。 有关文献报道的试验结果表明, 有15%的阳性耐热粪大肠菌群实际上属于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中，而非来源于人畜粪便，因此与人类疾病的产生也没有绝对的关联。 同时，（用上述方法检测）会有10%的假阴性结果，是因为大肠埃希氏菌属有10不会产气（注1）。 注1：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。,粪便污染指示菌比较,我国水质微生物指标(细菌),检测方法,多管发酵法（Multiple Tube Fermentation, MTF) 滤膜法（Membrane Filtration, MF ) 固定底物技术酶底物法(Defined Substrate Technology, DST) 酶底物法( Enzyme Substrate Test, EST),检测方法,多管发酵法（MTF）共需3-5天时间 以100mL水样中大肠菌最可能数(most probable number, MPN)表示 培养基制备试管培养（2226小时） 阴性结果（无产酸，产气） 产酸，产气 平板培养1824小时 革兰氏染色，镜检 观察菌落形态，挑取特征菌落 证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在 ）,检测方法,滤膜法（membrane filtration,MF ) 共需2-3天时间 用孔径为0.45的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数 ,计数单位为菌落形成单位CFU(colony forming unit) 储备培养基的制备过滤（需器械灭菌等）培养（22-24H） 阴性结果(无典型菌落） 革兰氏染色 镜检 观察菌落形态,挑取特征菌落 证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在）,酶底物法总大肠菌群 阳性反应原理,-半乳糖醛苷,-半乳糖苷酶,酶底物法大肠埃希氏菌 阳性反应原理,-葡萄糖醛酸酶,4-甲基-伞形葡萄糖苷酸,1, 方法 本标准方法采用固定底物技术酶底物法 Defined Substrate Technology, DST 2，培养基： 采用Minimal Medium ONPG-MUG，简称 MMO-MUG培养基 3, 优点 假阳性,假阴性底 操作简单,快速 定性,定量（51孔/97孔定量盘法） 50多个国家和组织认证 世界卫生组织WHO,美国EPA,水与废水标准检验法.,生活饮用水标准检验方法对酶底物法定义,科立得 应用,饮用水 源水 瓶装水 再生水,废水 食品水 畜牧用水 医疗用水,收录于“标准测试法”内 APHA(美国公共卫生协会), US EPA, AOAC, US NCIMS, UK DWI , IBWA ,WHO,假阳性比较： vs 滤膜法,假阳性比较：vs 滤膜法,* Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,报告者：英国泰晤士水务 样品来源：泰晤士河，样品数450个,假阳性比较 vs 滤膜法,* Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,产生的原因 传统方法培养基非选择性,会产生相似结果引起假阳性反应 培养基污染 样品交叉污染 操作误差 结论 试验证明可以用Colilert取代滤膜法进行大肠菌群和大肠埃希氏菌，还证明了ColilertDST酶底物法是不受化学、外力等外界因素变化而变化的。,假阴性比较： vs 滤膜法及多管法,* Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,假阴性率产生的原因 由于是非特异培养基所以会有杂菌干扰 清洁剂、盐、 抗生素、毒素、温度等原因会造成抑制反应 非发酵大肠菌 膜过滤法的问题 过滤膜的损坏,*Jacobs et al, AEM,1986. * Fricker et al, Water Res., 1997,实验步骤：Colilert 对比滤 膜 法,滤膜法 72步,科立得:5步,实验步骤：97孔定量盘法 vs 多管发酵,测试时间比较表,经济成本分析,定性检测操作示范 2步法,加入科立得试剂， 摇晃至溶解,36C培养24小时，判断结果: 1,无颜色变化阴性 2,黄色总大肠菌群阳性 3，黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性 44.5 培养24小时,判断结果： 1、无颜色变化阴性 2、黄色粪大肠菌群阳性,定量检测（51孔定量盘） 5步法,加入科立得试剂后， 摇晃至溶解,将Colilert溶液倒入 51孔（或97孔）定量盘Quanti-Tray®内,将定量盘Quanti-Tray®放入 程控定量封口机Sealer封口,36 或44.5 培养24后，计算呈阳性 反应的格子，然后对照MPN表 计数,定量检测（51孔定量盘） 5步法,固定底物技术酶底物法 科立得 所需试剂及设备,定性 科立得试剂 取样瓶（可用玻璃瓶替代）,定量 科立得试剂 取样瓶（可用玻璃瓶替代） 51孔/97孔定量盘 程控定量封口机,Colilert 使用总结,科立得市场占有率,美国的市场占有率为95% 欧洲的市场占有率为90% 全国有20余家环境监测站（如北京、上海、四川、厦门、郑州、沈阳等） 、40余家自来水公司、35家省市级疾病预防控制中心及水文站,应用案例,2004年非典爱德士捐赠科立得试剂给中国CDC及上海CDC抗拒非典 2008年汶川地震爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四川省CDC及环境监测站 2008年奥运会协助北京自来水及北京CDC完成奥运安全供水任务 与中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站做了对比实验,案例分析,2004年非典爱德士捐赠科立得试剂给中国疾病预防控制中心及上海中国疾病预防控制中心抗拒非典,案例分析 2008年汶川地震爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四川省CDC及环境监测站第一家捐赠试剂到灾区的厂家,案例分析 2008年奥运会协助北京自来水及北京CDC完成奥运安全供水任务,多管发酵法与科立得在检测粪大肠菌群的比较 中国环境监测站、上海环境监测站及厦门环境监测站检测几百组数据的结果 此文章发表在中国环境监测杂志2008年第4期,定性检测配置单,准确性,通过美国EPA认证 通过生活饮用水卫生标准认证 避免试剂直接加入时散落污染环境及操作员本身，同时也避免由于试剂加入不完全造成结果的不准确。,谢 谢 ！,
