2004年国基金青年项目中标申请书 ω3多不饱和脂肪酸对树突状细胞成熟及其细胞内信号传导通路影响的研究.doc

国家自然科学基金申请书申请代码：受理部门： 收件日期：受理编号：第 13 页 版本1.005.544国家自然科学基金您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:"中" 方法: Word菜单->工具->宏->安全性->安全级,设置为"中" (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了申 请 书资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 者： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮件： 申报日期： 2004年3月12日国家自然科学基金委员会基本信息yoKWWfXs申 请 者 信 息姓名性别男出生年月1971年1月民族汉族学位博士职称主治医师主要研究领域营养及移植免疫 电话025-80860962 电子邮件wanghao0349sina.com.cn 传真 个人网页 工作单位中国人民解放军南京军区南京总医院 /普通外科研究所在研项目批准号 依托单位信息名称代 码21000290 联系人郑均 电子邮件zhjjzh163.com 电话025482680858225 网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明青年科学基金项目 附注说明 申请代码C03010301:营养学C03020504:移植免疫学基地类别 预计研究年限2004年4月 2006年4月研究属性基础研究 摘 要项目研究内容和意义简介（限400字）：本课题以人外周血单核细胞来源的树突状细胞为研究对象,从细胞膜结构组成，细胞免疫表型,抗原提呈功能以及相关细胞因子的表达等多方面观察-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞功能的影响,并对树突状细胞内p38 SAP激酶信号通路的影响进行初步探讨。以明确-3 PUFAs对树突状细胞的抑制作用及其可能机制。从而为树突状细胞寻求一种简单有效的抑制性物质。以期为-3多不饱和脂肪酸在临床器官移植领域的应用提供理论依据。关 键 词(用分号分开，最多5个)-3多不饱和脂肪酸；树突状细胞;信号传导 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏)编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）11973-4-13 女主治医师博士中国人民解放军南京军区南京总医院 025-80860452 haoqun0290sina.com.cn 细胞培养 5 21968-12-19 男副主任医师博士中国人民解放军南京军区南京总医院 025-80860064 yubaojun1219sohu.com northern杂交 4 31967-12-12 男主治医师博士中国人民解放军南京军区南京总医院 025-80860962 anyiqiao1997sohu.com western杂交 5 41956-5-12 女副主任技师其他中国人民解放军南京军区南京总医院 025-80860064 liufnsohu.com 脂肪酸的检测 3 56789总人数高级中级初级博士后博士生硕士生5212说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费18.50001.科研业务费3.5000（1）测试/计算/分析费1.5000（2）能源/动力费0.5000（3）会议费/差旅费0.5000（4）出版物/文献/信息传播费0.5000（5）其它0.50002.实验材料费13.0000（1）原材料/试剂/药品购置费12.5000（2）其它0.50003.仪器设备费0.5000（1）购置0.5000（2）试制4.实验室改装费1.00005.协作费0.5000二.国际合作与交流费1.00001.项目组成员出国合作交流1.00002.境外专家来华合作交流三.劳务费0.5000四.管理费0.5000合 计20.5000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费0.0000其他经费资助（含部门匹配）0.0000其他经费来源合计0.0000 国家自然科学基金申请书报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1、 项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。移植排斥反应是目前器官移植领域所面临的一大难题 ,诱导移植耐受是人们在器官移植中的追求目标。近年来 ,随着移植免疫反应机制研究的逐步深入 ,人们发现树突状细胞（Dendritic cells,DCs）的成熟状态是机体诱导移植排斥反应或是诱导移植耐受的关键环节1。树突状细胞是机体的专职抗原提成细胞，其在外周组织遭遇供体器官来源的抗原后，将其吞噬并提呈于细胞表面，并通过引流淋巴管移行至次级淋巴组织。同时，在炎症因子或内毒素LPS等因素的作用下，树突状细胞逐渐成熟并高表达MHC分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86等，成熟树突状细胞通过MHC分子及共刺激分子分别向T细胞提供第一信号和第二信号,并通过IL-12的分泌共同导致抗原特异性初始型Th细胞的激活 ,并发育为效应性T细胞及记忆性T细胞。由此 ,淋巴结内抗原特异性初始型T细胞 ,可以不需要直接与抗原物质接触 ,就被抗原特异性致敏。大量研究发现，采用非成熟DCs即阻断DCs共刺激信号的表达及IL-12的分泌，可以特异性诱导受体T细胞失活或无能，进而诱导对移植物的免疫耐受2，3。因此，寻求各种方法阻断DCs的成熟已成为诱导T细胞无能和免疫耐受的有效途径之一。-3多不饱和脂肪酸（-3 polyunsaturated fatty acids, -3 PUFAs）是人体的必需脂肪酸之一，主要包含二十碳五烯酸( eicosapetaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸 ( docosahexaeoic ，DHA) , 鱼油中富含EPA和DHA。在临床实践中人们发现，-3多不饱和脂肪酸作为人体的营养物质，不但可以在体内氧化供能，而且对类风湿性关节炎，溃疡性结肠炎等多种自体免疫性疾病具有一定的治疗作用，可以缓解上述疾病的病程进展 4。提示其可能与自体免疫反应的抑制有关。进一步的研究证实，-3 PUFAs可以在体内，体外对T细胞淋巴细胞产生明显抑制作用。-3多不饱和脂肪酸可以降低T细胞IL-2的分泌水平，抑制丝分裂素诱导的T细胞增殖和抗原特异性的迟发型过敏性反应5，6，-3 PUFAs融入到脂质双分子层，可以显著改变T淋巴细胞的细胞膜脂质的磷脂的组成，影响细胞膜的流动性，并发现这一结构上的改变可能是导致细胞内信号传导途径变化的原因7。以上结果提示-3 PUFAs是调节机体免疫功能的一种重要因子，有可能在抗免疫排斥反应中具有很大的应用潜能。-3 PUFAs对树突状细胞成熟及功能的确切影响目前还没有明确的结论。鉴于-3 PUFAs对T淋巴细胞功能的抑制及细胞膜脂质结构的影响，我们因此提出如下假设：-3 PUFAs对树突状细胞的成熟及功能也可能具有潜在的抑制作用,并且这种抑制作用与-3 PUFAs对树突状细胞的成熟过程中信号传导通路的干预有关。细胞的一切生命活动都与信号传导有关。在目前人们研究的数条细胞信号通路中，丝裂原活化蛋白激酶家族即MAPK信号通路参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，是细胞信号传导研究的热点领域。在真核细胞中 ,已确定出四条MAPK信号转导通路 ,即ERK通路、JNK通路、p38通路和ERK5通路。大量资料证实 ,细菌内毒素 (LPS)与其受体结合后可通过细胞内酪氨酸激酶或G蛋白耦联的信号途径激活细胞内MAPK激酶,最终导致各种转录因子的核转录。p38是 MAPK家族最重要的成员之一，是 LPS诱导细胞反应的重要信号环节。由于在人的许多细胞因子基因的启动子上存在多种转录因子的结合位点 ,而这些转录因子又是 p38的磷酸化作用底物 ,因此p38就是通过活化这些转录因子来调节细胞因子的基因转录。LPS刺激、生理应激等因素均可导致细胞内p38的迅速活化,进而诱导下游细胞因子的产生及各种细胞反应。已有研究表明，p38激酶在LPS、TNF-a或CD40配体诱导的树突状细胞的成熟过程中具有重要的作用。采用p38激酶特异性的阻滞剂SB203580孵育树突状细胞，可以显著的阻断由LPS或TNF-a诱导的细胞成熟，其CD80、CD86等共刺激分子的表达及T细胞刺激能力明显下降8，9。可以认为，p38激酶信号通路是树突状细胞成熟过程中最重要的一条信号通路，与树突状细胞的抗原提呈和T细胞刺激功能密切相关。近期已经有研究提示-3 PUFAs可以在细胞内信号传导水平干预T细胞的功能。但-3 PUFAs对细胞内p38激酶通路的影响尚无任何研究。因此，本课题拟以人外周血单核细胞来源的树突状细胞为研究对象,从细胞膜结构组成，细胞免疫表型,抗原提呈功能以及相关细胞因子的表达等多方面观察-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞功能的影响,并对其细胞内p38 SAP激酶信号通路的影响进行初步探讨。以明确-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞的抑制作用，以期为-3多不饱和脂肪酸在临床器官移植领域的应用提供理论依据。主要参考文献1.Gad M, Claesson MH, Pedersen AE et al. Dendritic cells in peripheral tolerance and immunity. APMIS. 2003,111(7-8):766-7752.Toungouz M, Donckier V, Goldman M. Tolerance induction in clinical transplantation: the pending questions. Transplantation. 2003,75(9):58-60. 3. Steinman RM, Hawiger D, Nussenzweig MC. Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2003,21:685-711. 4. Cleland LG, James MJ and Proudman SM. The role of fish oils in the treatment of rheumatoid arthritis. Drugs. 2003;63(9):845-853.5.Arrington JL, McMurray DN, Switzer KC et al. Docosahexaenoic Acid Suppresses Function of the CD28 Costimulatory Membrane Receptor in Primary Murine and Jurkat T Cells. J Nutr. 2001,131:1147-1153.6. Pompos LJ and Fritsche KL. Antigen-driven murine CD4+ T lymphocyte proliferation and interleukin-2 production are diminished by dietary (n-3) polyunsaturated fatty acids. J Nutr. 2002 ,132(11):3293-3300.7. Fan YY, McMurray DN, Ly LH et al. Dietary (n-3) polyunsaturated fatty acids remodel mouse T-cell lipid raftsJ. J Nutr. 2003 ,133(6):1913-1920.8. Kirit M. Ardeshna, Arnold R et al. The PI3 kinase, p38 SAP kinase, and NF-Kb signal transduction pathways are involved in the survival and maturation of lipopolysaccharide -stimulated human monocyte-derived dendritic cells. Blood, 2000, 96 (3):1039-10469. Amaya PK, Miguel R, Oskar FC et al. Extracellular signal-regulated protein kinase signaling pathway negatively regulates the phenotypic and functional maturation of monocyte-derived human dendritic cells. Blood, 2001, 98(7): 2175-2182 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。主要研究内容：第一部分 人外周血单核细胞来源的DCs细胞的诱导，培养及鉴定。 外周全血分离白膜，GM-CSF，IL-4,LPS诱导分化DC,流式细胞术鉴定其细胞表型。第二部分 -3多不饱和脂肪酸对DCs细胞膜脂质组成结构的影响 观察-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA，）对DCs细胞细胞膜脂质成分变化的影响。（气相色谱法）,探讨DCs体外培养条件下, -3多不饱和脂肪酸是否可以直接改变细胞膜脂质的构成。第三部分 -3多不饱和脂肪酸对DCs表型，抗原提呈功能及细胞因子分泌的影响: 1. 研究-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）对DCs抗原提呈能力变化的影响。（混合淋巴细胞反应H3法）2.观察-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）对DCs细胞免疫表型CD1a、CD40、CD80、CD83 、CD86及HLA-DR表达率的影响,以期明确对DCs成熟和抗原提呈功能起重要作用的相关免疫因子的表达情况.（流式细胞术检测）3.研究-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）对DCs细胞分泌IL-12，IL-10及TNF-a的影响。（northern blot及 ELISA）,观察多不饱和脂肪酸是否可能通过对相关细胞因子的分泌影响了T细胞的Th1/ Th2平衡，这一平衡是机体细胞免疫增强或减弱的重要原因。第四部分 -3多不饱和脂肪酸对LPS诱导的DCs成熟过程中p38 SAP激酶信号传导通路的干预作用:研究-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）对DCs细胞内p38 SAP激酶的影响（western blot）。p38 SAP信号通路参与了LPS诱导的DCs的成熟，p38 SAP的激活可以导致许多重要的细胞因子和趋化因子基因的转录。了解-3多不饱和脂肪酸对p38 SAP信号通路的影响将使我们能够从机制上解释-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞潜在的抑制性作用。研究目标：通过本课题研究，希望了解-3多不饱和脂肪酸是否能够改变DCs细胞的免疫表型和抗原提呈功能，并明确这种改变是否和DCs胞膜上脂质成分的改变以及细胞内信号转导途径p38 SAP激酶的参与有关。从而确定-3多不饱和脂肪酸对DCs 的免疫功能的影响及可能的机制.本项目的完成，将进一步明确-3多不饱和脂肪酸对机体免疫系统的影响，使器官移植的术后营养支持的使用更有针对性，并可能为将来使用免疫营养制剂替代或部分替代目前价格昂贵,副作用明显的免疫抑制药物提供了可能.重点解决问题：1.树突状细胞细胞膜脂质成分的分离，提取及各种脂肪酸含量的分析；2.树突状细胞非成熟状态及成熟状态的诱导，维持及鉴定标准；3.细胞内p38 SAP激酶磷酸化的检测。3、 拟采取的研究方案及可行性分析。研究步骤第一部分 人外周血单核细胞来源的DCs细胞的诱导，培养及鉴定。 外周全血分离白膜，帖壁法获取单核细胞，加入GM-CSF，IL-4诱导DCs的形成,培养第7天加入LPS诱导DCs的成熟,流式细胞术鉴定其细胞表型。第二部分 -3多不饱和脂肪酸对DCs细胞膜脂质组成结构的影响分为EPA、DHA、硬脂酸及空白对照四个组，将以上物质分别于细胞培养第五天加入细胞培养液，作用48小时后再加入LPS诱导DCs的成熟，然后获取细胞膜，气相色谱法分析-3多不饱和脂肪酸及其他脂肪酸的组成含量。第三部分 -3多不饱和脂肪酸对DCs表型，抗原提呈及T细胞刺激能力功能的影响。细胞分组及处理同第二部分。收获细胞后，采用流式细胞术检测-3干预组和对照组之间DCs细胞表型CD1a、CD40、CD80、CD83 、CD86及HLA-DR表达情况。采用northern blot及 ELISA分别检测IL-12、IL-10及TNF-a的细胞内基因水平及细胞外分泌能力。采用混合淋巴细胞反应H3法检测DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力。第四部分-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA）对DCs细胞内p38 SAP信号通路的影响分为EPA、DHA、硬脂酸、空白对照及SB203580（p38 SAP阻滞剂）五个组，于细胞培养第五天将以上物质分别加入细胞培养液，作用48小时后再加入LPS诱导DCs的成熟后提取细胞蛋白，采用抗p38 SAP抗体和抗磷酸化的p38 SAP抗体分别检测p38 SAP激酶和磷酸化的p38 SAP激酶的含量。技术路线树突状细胞的诱导，培养及鉴定细胞培养液中分别加入EPA，DHA或对照 检测DCs 细胞因子的分泌能力观察DCs表型和抗原提呈能力检测细胞膜脂质组成成分检测p38激酶的磷酸化结论研究可行性分析： 项目申请者长期致力于树突状细胞的临床、科研研究，熟悉该领域的研究基础及发展动态，并已经在该领域以第一作者撰写和发表多篇论文。项目组成员均接受过比较正规及全面的科研训练，熟练掌握实验所必需的细胞生物学及分子生物学实验技术；本研究所为全军普通外科研究所和普通外科国家重点实验室，在营养支持治疗和小肠移植方面具有丰富的临床积累，治疗效果显著，实验室设备先进、齐全，能满足该研究所需要的设备条件，部分指标在校内其他实验室均可完成检测；以上条件可以保证该研究的顺利进行。4、 本项目的特色与创新之处。树突状细胞的成熟状态是机体诱导移植排斥反应或是诱导移植耐受的关键环节。该课题研究-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞成熟和功能的影响并试图阐明其可能作用机制，这一结果可能为我们提供一条通过抑制树突状细胞诱导移植耐受的新方法。这一课题的研究将有助人们进一步理解-3 PUFAs造成免疫抑制的原因,从而为-3 PUFAs在临床免疫移植排斥反应中的应用提供理论依据。该课题所涉及的领域也是当前移植免疫研究中的重点和前沿，从小分子物质-3 PUFAs的角度来探讨其对树突状细胞成熟的影响，并对其相关信号转导机制进行研究具有一定的原始创新性，在该领域的国内外研究中尚未见报道。5、年度研究计划及预期研究结果。2004.042004.05 订购试剂、相关试验条件准备 2004.062004.08 外周血DC分离、诱导培养及鉴定；2004.082005.01 DCs细胞膜脂质组成结构的检测；2005.012005.06 -3多不饱和脂肪酸对DCs表型，抗原提呈及T细胞刺激能力功能的影响的检测；2005.72005.12 DCs细胞内p38 SAP信号通路的分析。2006.012006.04 试验数据的整理、统计分析；试验结题报告、研究论文的书写及交流、投稿预期结果：-3 PUFAs在多方面抑制了树突状细胞的成熟和功能，这种抑制作用与-3 PUFAs对细胞膜脂质成分的改变和细胞内信号通路p38激酶的参与有关。（二）研究基础与工作条件1、 工作基础 项目申请者长期从事树突状细胞的临床应用及基础研究,熟悉树突状细胞的研究方法,对相关研究的国内外最新动态能近快了解.能够熟练的进行DCs的体外诱导和培养,掌握流式细胞检测技术，northern杂交技术,western杂交等常用实验技术。南京军区总医院普通外科研究所是国家卫生部临床药理基地（营养支持专业），全军器官移植重点实验室，江苏省代谢与营养重点实验室。学术带头人为著名普通外科专家黎介寿院士。长期从事肠内肠外营养的临床应用。本所先后获得全国科学大会奖、全军专业技术重大贡献奖、国家科技进步二等奖、军队科技进步一等奖、军队医疗成果一等奖、军队科技进步二等奖、国家教委与省级科技进步二等奖等各种奖励25项。2、 工作条件本研究所涉及的细胞培养, 流式细胞检测等相关仪器（超净台，孵箱，PCR扩增仪，稳压稳流电泳仪 ，凝胶摄像分析系统 ，高速冷冻离心机，紫外-可见分光光度计，流式细胞检测等相关仪）已基本到位。 northern杂交所需相关器材可以进一步购买添置.分析脂质成分的高效气相色谱仪有专人操作,技术上有一定保证。实验所需各种单抗,荧光抗体,试剂盒,各种细胞因子,酶类均可从各试剂公司购买获得。诱导DCs所需健康成人外周血可从我院血库购买获得.3、 申请人简历汪灏，男，33岁。 临床医学（普通外科）专业，博士后。1994年毕业于第一军医大学医疗系。2001年获第三军医大学普通外科专业博士学位。现任南京军区南京总医院普通外科主治医师。研究生阶段分别主持完成了“肿瘤细胞对树突状细胞功能影响的研究” 及“树突状细胞疫苗抗胃癌作用的临床应用研究”等科研项目。自2000年至今以第一作者发表或投稿论文9篇，其中英文论著2篇。2003年获王宽成教育基金博士后奖学金一项。目前已投稿或发表的文章:1.汪灏.树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用. 免疫学杂志 2000.08 128-130 2.汪灏 郝群. DC疫苗在肿瘤临床治疗中的应用进展. 中国肿瘤临床 2003.12 901-9043.汪灏 余佩武 曾冬竹等. 临床用DC疫苗的制备及检测. 第三军医大学学报 2004. 9 4.汪灏 余佩武 王月禾等. 树突状细胞疫苗对胃癌术外周血IL-12及 Th1/Th2平衡的影响.中华普通外科杂5.汪灏 余佩武 张 坤 等. 树突状细胞疫苗对胃癌患者术后疗效的初步观察. 中华胃肠外科杂志6.汪灏 余佩武 曾冬竹等. 树突状细胞疫苗治疗胃癌患者后肿瘤特异性免疫反应的诱导. 中华肿瘤杂志7.汪灏 郝 群 曾冬竹等. 肿瘤细胞培养上清对DC细胞凋亡诱导的研究. 重庆医学.8. Wang hao, hao qun，yu peiwu. Induction of Tumor Specific Immune Response in Patients With Gastric Carcinoma After Vaccination With Tumor Antigen Pulsed Dendritic Cells. Chinese Journal of Medicine 9. Wang hao, hao qun, yu peiwu. Clinical and immunological effects of dendritic cells vaccine on patients with gastric cancer. World Journal of Gastrointential.郝群 ，女，汉族， 医学博士。1994年毕业于徐州医学院临床医学系获学士学位。2003年毕业于上海复旦大学医学院妇产科专业获博士学位。目前在南京军区南京总医院任主治医师。主要从事妇科免疫方面的研究工作。近年已发表论文十余篇。主要负责细胞流式检测工作。于宝军，男，汉族，医学博士。1993年毕业于第二军医大学，获学士学位，2001年毕业于第二军医大学获博士学位。2003年5月在南京军区南京总医院博士后工作站工作期满出站。现在南京军区南京总医院普通外科研究所，主要从事外科感染、脓毒症、移植免疫分子机制的研究工作。近年发表论文二十余篇。负责转染表达及蛋白印记分析工作。4、 承担科研项目情况研究生阶段完成了 “肿瘤细胞对树突状细胞功能影响的研究” 及“树突状细胞疫苗抗胃癌作用的临床应用研究”2项科研项目。目前正在参与国家973项目：小分子物质与移植物慢性失功的研究。 国家自然科学基金申请书签字和盖章页(此页不用填写!) 申 请 者：汪灏 依托单位：中国人民解放军南京军区南京总医院 项目名称：-3多不饱和脂肪酸对树突状细胞成熟及其细胞内信号传导通路的影响 资助类别：面上项目 亚类说明：青年科学基金项目 附注说明： 申请者承诺： 我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 项目组主要成员承诺： 我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。编号姓 名工作单位名称项目分工每年工作时间(月)签 字1郝群 中国人民解放军南京军区南京总医院 细胞培养 5 2于宝军 中国人民解放军南京军区南京总医院 northern杂交 4 3乔安意 中国人民解放军南京军区南京总医院 western杂交 5 4刘放南 中国人民解放军南京军区南京总医院 脂肪酸的检测 3 56789依托单位及合作单位承诺： 已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。依托单位公章 合作单位公章1 合作单位公章2 日期： 日期： 日期：