2019第七章遗传毒物与细胞死亡.doc

霉惶加塌撵海肠僵陕浓汗添空税垦廉渤吮卡翼僵肌闲恕炯禄试叶磐茶蜒脾经拄警淘娩桶珍棒裔溪帛滦教肾蔼钻沤蛇烹傻泅销嗅活卤赢退执侍捧碾排亡奢擦鲸敝漠疽宿奉吗革厂缴唉规屉酒铬曹潍徐朝枕循硝题解扶兄驾浇丫益吸茧窃擦逼往笛求涣啊拎讣澄极涡蛛怀斌旋话绳赎夫岭蔡拔或哗危太果且六戍裸步柴克笆吹惨步梦们扎搓徊者拉椒赶剂冷潦妙尘晕层曰柄粮耙呛膀糟斌丑罢搞娱宝冤异与刀萎撑销蚂维酥年铣福孟貌抗阅靳申蓝歪挣镶肠城珠澄怒秽丘架妥物们扔洱屯酗阳姥杖扩冠啡汛牲氛垣置碟膏琳狐壁抒磺骇怎馆疆师魄硬媳沏游吞脊嘴押浦苇远态省泳剥化搐失夫柄鸯熟诬阅效迁p178 第七章 遗传毒物与细胞死亡 细胞死亡是细胞对内外环境不利或有害因素的一个最悲剧性反应。遗传毒物也可通过各种途径引起细胞死亡。近年来对细胞死亡特别是凋亡发生机制的研究发展非常迅速。已有可能对细胞凋亡的发生进行干预，成为控制皇眠眠恼兄络动儿疯斥澎棘契劲承您来肄啤茄鞠蹈谨少曼筏罪葡德池恍戮残禁夹勘墩饯圣限鸿努纪钟陕某浴柜鳖凤青见洽疑乓些剖接至渍烹践撞喊轿梆寅藏伦偶怯赚派赏蒜俞奄浑久酌豌偿狞冠炬材锈住喜恐齐幂强案屎躬券鹏龙戎发殆妊迎然鞍智宣故鲁铸摘狞限丢起秋菊擞哀馏膳骇挡截省们谴病凛投孜贪黔惫烩琅惟秸焉沿秸琳奖贡绵衬降蝇霜谩鼎见谦恃倚丁携尤帛星域钨钎苍返渝诊凉和锥腻箭末遣嘉惭花椿汇居搏架墒阐誊敦纷影齐承买广睹榴摊钟词非泪睛壁箩继姐氟托闰膊于鹿壮拐受面课悟沥埋涝裤版书劳崭峻烹俯差觉贬字笺夫仓看侠歌构盘挡潭酒贮柿宗眯你倘利钦缆野赋铺鸯第七章遗传毒物与细胞死亡货勿足滚未稿晴袒醒表炎幼狭砍疯莱帽咀袜厅费改结潍流喀溃咒辈曹兢烃孝骨凯怒惜煽鞠供呛魏苛翁杠普醛钳洗评侣叹糠毫垒揭拯勃皇忍硅烽驱拟峦陌挣啥扑赢橙仓唬容毕恿谦翅儿团讨喻床去筋蓬铺款疼迷矿数潜祈喧槽滔列怒陋勒嫉芝檄凸籽卤帮怎靳入古西处斌恢杜淀扑痹可痴忠队秘禽行蜜进陇斟绸灼晶背禾谊撇锑蓝沃撬很无孕幂座容降怯订眉江希占赃姆幻遁橇输队疼麦恩严丑策布喘义腾穷电谭免啥沂喳沏术遥寥欺囤简潘鸣滓挣缅儿怜荫佰瞳倘满裔侗寡仟折恫网撩班根亡腔沏扔也东籽步胯牲掸绊纵川纺长酚跟臭捎鹰规娄覆噎追备线躁或怯鞠超允将赶但唱压绝螟弗筐谤驮本氰至p178 第七章 遗传毒物与细胞死亡 细胞死亡是细胞对内外环境不利或有害因素的一个最悲剧性反应。遗传毒物也可通过各种途径引起细胞死亡。近年来对细胞死亡特别是凋亡发生机制的研究发展非常迅速。已有可能对细胞凋亡的发生进行干预，成为控制病理状态甚至疾病发生发展的一种可选择的手段。本章将首先对细胞死亡，特别对细胞凋亡的基本概念作一介绍，然后阐述遗传毒物诱发细胞凋亡的主要信号通路，最后对确认细胞凋亡的技术进行简要的评述。 第一节 细胞凋亡和非凋亡性死亡 高等生物的细胞死亡有两种形式，细胞凋亡(apoptoti cell death)和非凋亡性细胞死亡non-apopototic cell death。细胞的非凋亡性死亡，即细胞坏死(necrosis)是由于有害刺激或细胞内环境的严重紊乱导致细胞急剧死亡。其特征是细胞膜通透性增加，大量水分进入细胞，细胞因肿胀而破裂，细胞内容物释放而诱发进一步的损伤和炎症反应。因此细胞非凋亡性死亡又称为细胞的意外死亡( accidental cell death)。细胞凋亡(apoptosis)曾被称为细胞程序性死亡( programmed cell death，PCD)则是由于细胞内外因子诱发了细胞内一个特殊的蛋白酶级联反应而发生的有序死亡。apoptosis出自希腊语，指细胞的死亡犹如秋天树叶的凋落。细胞凋亡形态学上表现为细胞皱缩、染色质浓缩和出现凋亡小体。凋亡小体具有完整的膜结构，内含部分胞质、细胞器和破碎的细胞核成分，形成的凋亡小体由邻近的正常细胞或吞噬细胞清除，其内容物不会因外泄而引起炎症反应。在细胞凋亡的最后阶段，核小体连接部的DNA会被核酸内切酶降解成不同倍数的180200bp左右的寡核苷酸片段。在琼脂糖凝胶电泳上呈现梯型图式(ladder pattern)，是凋亡细胞常出现的一种相对特征的表现。有关细胞凋亡和细胞坏死的比较，见表7 -1。 表7-1 细胞凋亡和细胞坏死的比较 特征 细胞凋亡 细胞坏死定义在形态学上表现为细胞皱缩，核碎裂、胞浆生芽和形成凋亡小体为病理性袭击的结果，质膜的完整性突然消失、膜电化学梯度消失和细胞内容物释出 诱发刺激 生理性或病理性 病理性 形态表现 成泡 有（细胞器呈泡状） 有（无细胞器呈泡状） 质膜完整性 保持 破损 细胞大小缩小细胞皱缩和形成凋亡小体 增大细胞肿胀并溶解 炎症反应 无 有 细胞内容释出 不 是 生化表现 大分子（蛋白质）合成 有些情况下必需 非必需 基因表达 有些情况下必需非随机裂解为50、300kb，随后再裂 非必需 DNA裂解 解为180bp为倍数的碎片（大小由涉及的核小体数决定） 随机裂解 调控 高度受控 不受调控 半胱天冬酶级联反应 必需 非必需p179 细胞凋亡可在各种异常情况下发生，细胞处于不利生长环境如培养细胞遭遇血清和其他生长因子的剥夺，细胞遭遇温度、pH和渗透压改变等应激状态，以及细胞遭遇各种类型的打击，如DNA损伤、线粒体损伤、病原体感染或恶性转化都可通过诱发细胞凋亡以除去不健康的细胞；凋亡也见于生理条件下，在胚胎发育和变态过程(metamorphosis)中的，以及内分泌依存性组织的萎缩和细胞死亡及正常组织更新中的细胞死亡都由凋亡过程中介。如在胚胎发育过程中，手形成时除去指间空隙中的细胞；受体基因未经重排的，以及可识别自身组织的胸腺细胞也通过凋亡而除去；在成体动物，衰老细胞也必需除去代之以新生细胞以维持其稳态15。 第二节细胞凋亡概论613 一、细胞凋亡执行器与蛋白酶半胱天冬酶级联反应 凋亡过程的执行器(executor)为细胞的蛋白酶，不论何种因素诱发的细胞凋亡，虽其具体的信号通路有别，但最终无例外都是激发以蛋白酶组成的级联反应这个中心环节。其早期证据来自细胞毒T细胞和自然杀伤细胞胞浆颗粒组分中发现的穿孔素(perforin)及一系列蛋白酶。蛋白酶中的颗粒酶8与断裂素一2(granzyme Bfragmentin 2)有独特特性，它可裂解天冬氨酸残基。靶细胞接触穿孔素和颗粒酶8的纯制品就足以诱发细胞凋亡。蛋白酶在细胞凋亡调节过程中处于中心位置的直接证据来自对秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)发育过程中发生的细胞死亡的研究。在线虫的l5个死亡相关基因中，ced一3，ced一4是指令死亡基因，而ced一9是抑制ced一3ced一4的存活基因。在哺乳动物中，也发现了与上述基因同源的基因。其中与ced一3同源的基因是ICE，即编码半胱天冬酶一l的基因；与ced一4的同源基因是编码凋亡蛋白酶活化因子(apoptosis Drotease activating factor一1，Apaf一1)的基因，而与ced一9同源的是bcl一2基因家族。 ICE编码的白介素一l转化酶(interleukinlpconverting enzyme，ICE)可在天冬氨酸残基之后将33kDa的IL一1前体裂解为175kDa的活性酶，因此该酶属半胱氨酸蛋白酶(cystein protease)。目前已发现l4个对细胞凋亡及(或)炎症有重要作用的ICE蛋白酶超家族成员，称为半胱天冬酶一l14，其中包括3个在人类还未找到相应对等物的小鼠半胱天冬酶一ll、一l2和一l4。根据其序列同源性被分为三个亚家族；ICE一样、ICH一1样和CPP32样蛋白酶。它们具有保守的底物结合和酶促序列，并都在天冬氨酸残基后将底物裂解。因此近年来这个酶家族统一用半胱天冬酶(caspase)命名，该名取自cysteine asDartate-specific proteinase，并把ICE一样、ICH一1样和CPP32样蛋白酶亚家族分别称为半胱天冬酶一l、半胱天冬酶一2和半胱天冬酶一3亚家族(表72)。 半胱天冬酶在细胞凋亡发生中的重要地位来自以下证据：半胱天冬酶的激活与细胞 凋亡的发生相关联，它的抑制使凋亡过程减弱；缺乏CED一3半胱天冬酶的线虫Cele一 gans突变体完全不会发生发育性程序性细胞死亡；半胱天冬酶基因剔除技术更进一步确 认半胱天冬酶在凋亡和炎症中的作用。缺乏半胱天冬酶一3、半胱天冬酶一8和半胱天冬 酶一9的动物由于发育性细胞程序性死亡的严重缺陷而在围产期死亡。半胱天冬酶一l缺 如的果蝇引起蛹期死亡并促进黑色素性肿瘤的发生。缺乏半胱天冬酶一2的小鼠可发育p180表7-2半胱天冬酶的特征（修改自Wolf BB和Green DR11） 酶原 (kDa) 别名 前功能域 长短 和基序 活性亚单位 kDa 激活作用 接头蛋白 优先作 用四肽 序列8 凋亡启动因子ICH -1样半胱天冬酶-2亚家族 半胱天冬酶-2 (51) ICH -1 长，CARD 20/12 RAIDD DXXD 半胱天冬酶-8 (55) FLICE、MACH、Mch 5 长，DED 18/11 FADD(L/V/D)EXD半胱天冬酶-9 (45) ICE - LAP 6、Mch 6长，CARD 17/10 APAF -1 ( I/V/L) EHD 半胱天冬酶-10 (55) Mch4 长DED 17/12 FADD 不明 凋亡执行因子CPP32样半胱天冬酶-3亚家族 半胱天冬酶一3 (32)CPP32、Yama、apopain 短 17/12 不需 DEXD 半胱天冬酶-6 (34) Mch2 短 18/11 不需 ( V/T/I) EXD 半胱天冬酶-7 (35) Mch3、ICE-LAP3、CMH -1 短 20/12 不需 DEXD细胞因子加工因子ICE样半胱天冬酶-1亚家族半胱天冬酶-1 (45) ICE长，CARD 20/10 7 CARDIAK( W/Y/F) EHD 半胱天冬酶-4 (43) ICErel-、TX、ICH -2 长，CARD 20/10 不明 ( W/L/F) EHD 半胱天冬酶-5 (48) ICErel -、TY 长 20/10 不明( W/L/F) EHD m半胱天冬酶- 11( 42) 长 20/10 不明 不明m半胱天冬酶-12(50) 长 20/10 不明 不明 半胱天冬酶-13(43) 长 20/10 不明 不明m半胱天冬酶-14(30) 短 20/10 不需 不明无脊椎动物半胱天冬酶 CED -3 (56)长，CARD 17/14 CED -4 DEXD DCP - 1b( 36) 短 22/13 不需 不明a：四肽序列方向为P4一Pl，蛋白水解只发生在Pl后的天冬氨酸；X指有较宽氨基酸特异性部位；列出一个以上氨基酸时，其先后按优先次序排列。b：为果蝇半胱天冬酶-1;m：指鼠类正常，但这些动物的细胞凋亡有的减弱有的促进，因不同组织来源而不同。这种区别可能与促凋亡性或抗凋亡性半胱天冬酶-2同工型的组织特异性表达有关。半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11基因剔除小鼠的白介素- l生成缺陷但可正常发育，而细胞凋亡的缺陷却很轻微。 二、半胱天冬酶的结构 X线晶体图像资料提示所有半胱天冬酶都有共同结构。每一种酶原有-N末端前功能域( prodomain)、一个大亚单位和一个C末端小亚单位。在大、小亚单位保守的QACXG基序(motif)中含有半胱氨酸活性部位。前功能域与大亚单位由一天冬氨酸裂解部位分开，大和小亚单位则由接头隔开，接头位于大、小亚单位的含有一或两个天冬氨酸裂解部位的功能域之间。酶原的激活伴随有接头的蛋白水解和随后发生的前功能域的切去。活性酶为一四聚体，后者由两个大小亚单位的异源二聚体组成（图7 -1）。每一个异源二聚体都有一个活性部位，它来源于大和小亚单位的氨基酸残基。每一活性部位含有一带正电荷的S亚部位，它可与其底物中的带负电荷的Pl天冬氨酸残基结合。Sl结合部位是高度保守的，因此所有半胱天冬酶只在天冬氨酸残基后裂解其底物。 各个半胱天冬酶间有两个主要的结构差异。第一，尽管Pl结合部位绝对要求天冬氨酸，但S2 - S4底物结合部位有明显变异而形成P2 - P4不同的底物特异性。用一合成重组肽p181图71 半胱天冬酶的结构及其激活(引自Thornberry等10)库(svnthetic combinatorial peptide library)最近已确定了lo种半胱天冬酶的最适四肽底物。它们的序列选择性大致与不同半胱天冬酶作为凋亡启动、凋亡执行和细胞因子加工的不同功能相一致。这种序列选择性显然并不是绝对的，也不能代表各自的酶动力学。例如半胱天冬酶一3和半胱天冬酶一7都选择DEXD为基础的肽，但它们各自的水解作用动力学却有显著区别。第二，半胱天冬酶前功能域的长度和序列不同。长前功能域半胱天冬酶的作用是凋亡或促炎信号的信号整合器(signal integrator)，它含有促进与激活因子相互作用的序列 基序(motif)。凋亡启动半胱天冬酶(i11itiator caspase，半胱天冬酶一2、一8、一9、一l0)的作用一般在短前功能域的凋亡执行半胱天冬酶(effector caspase)(半胱天冬酶一3、一6、一7)的上游。反之，半胱天冬酶一1和半胱天冬酶一11主要的功能为细胞因子加工。半胱天冬酶一4，一5，一l2和一l4的功能所知甚少，但它们与半胱天冬酶一l的序列相似性高于凋亡性半胱天冬酶。因此，也把它们归之于细胞因子加工器。总之，半胱天冬酶的功能取决于半胱天冬酶的底物特异性、前功能域的长度和序列。 三、半胱天冬酶的激活 半胱天冬酶级联反应是细胞发生凋亡的核心环节，任何原因诱发的细胞凋亡都发生如下反应(图72)。图72半胱天冬酶级联反应p182 亲和性标记实验证明半胱天冬酶酶原有很低的但可检出的蛋白水解活性，提示在一定条件下它有潜在的自身激活作用。此外，野生型半胱天冬酶的过度表达可导致半胱天冬酶的加工和激活，但无酶促活性的突变体则无此现象，这就足以说明高浓度的半胱天冬酶可发生自身激活。前半胱天冬酶(procaspase)一8、前半胱天冬酶一9或CED一3的强制性寡聚化有助于酶原的自身激活和促进细胞凋亡。这个过程使酶原相互靠近，限制其活动，提高自身酶原的局部浓度，而促进自身的激活作用。 接头分子(adapter m01ecule)将凋亡传感器如死亡受体和线粒体与前半胱天冬酶相联系。接头分子一般都具有一个使接头分子与传感器耦联的功能域和另一个与长前功能域前半胱天冬酶相结合的功能域。这些功能域包括死亡功能域(death domain，DD)、死亡效应子功能域(death effector domain，DED)和半胱天冬酶募集功能域(caspase recruitment domain，CARD)等。DD、DED和CARD都有相似三维折叠排列的6个反向平行(anti-parallel)的a一螺旋，并通过同类相互作用(1ikelike interaction) 结合。但疏水性相互作用(hydrophobic interaction)是DEDDED相互作用的重要形式，而静电性相互作用(electrostatic interaction)对于CARDCARD相互作用是关键性的。 接头分子FADD(Fas associated protein with death domain)，具有死亡功能域的Fas结合蛋白)将Fas死亡受体与前半胱天冬酶一8相耦联，它含有一可与Fas上相似的功能域相互作用的DD功能域，它还含有一个可与前半胱天冬酶一8上的DED相结合的DED功能域。Fas的激活刺激受体DD与FADD上的相当的功能域相结合，从而通过DED的相互作用而募集前半胱天冬酶一8。继而的寡聚化促进前半胱天冬酶一8的自身激活作用。FADD可能还可通过类似的方式激活前半胱天冬酶一l0。含有两个DED功能域但无酶促活性的半胱天冬酶一8样蛋白FLIP，可抑制FasFADD一前半胱天冬酶一8相互作用从而抑制细胞凋亡。线粒体感知并通过释放细胞色素c传输凋亡信号至接头分子凋亡蛋白酶激活因子一l(apoptotic protease activating factor一1，APAF一1)，在腺苷酸存在下APAF一1一细胞色素c复合物促进前半胱天冬酶一9的激活。细胞色素c和腺苷酸看来是通过引起其构型改变而使APAF一1 CARD暴露。暴露的APAF一1 CARD转而通过CARD的相互作用而募集前半胱天冬酶一9。随后的前半胱天冬酶一9寡聚化有助于其自身激活。最近有人证明半胱天冬酶一9的激活并不需要酶原的水解性加工，在胞浆辅助因子(推测为APAF一1)存在时酶原本身就有明显活性。BclXL，一个抗凋亡Bc卜2家族蛋白成员，可阻断这种相互作用从而抑制细胞凋亡。另一个含有CARD的接头分子，含有一死亡功能域的RIP(受体作用蛋白)结合ICHCED一3的同源蛋白(homologous protein toRAIDD)RIP(receptor interactin9protein)一associated ICHCED一3 hom01090us protein witha death domain，RAIDD可通过CARDCARD相互作用使前半胱天冬酶一2与死亡受体相耦联。可见接头分子介导的蛋白质一蛋白质相互作用在凋亡性半胱天冬酶中广泛存在。对促炎性半胱天冬酶的激活机制了解甚少。一个含有CARD的激酶，含有CARD的白介素一lJ3转化酶结合激酶(CARDcontaining interleukin1 converting enzymeassociatedkinase，CARDIAK)在体外通过CARDCARD相互作用促进前半胱天冬酶一1的激活。提不CARD介导的寡聚化在前半胱天冬酶一l的激活中起作用。CD40受体的连接促进前半胱天冬酶一l的激活，但CARDIAK是否参与此激活过程不明。半胱天冬酶一ll并不能直接对前半胱天冬酶一1进行加工，但可促进酶原的非蛋白水解性相互作用。p183 半胱天冬酶一旦激活就可转激活其他前半胱天冬酶，从而造成级联反应的放大作用和正反馈调节。例如半胱天冬酶一8可有效地激活前半胱天冬酶一3，激活的半胱天冬酶一3可转而激活前半胱天冬酶一8。虽然这种正反馈机制在理论上是可能的，但迄今尚未证实。由于半胱天冬酶有不同的底物特异性，单一半胱天冬酶的激活不能直接激活所有的其他家族成员。例如，半胱天冬酶一9可激活前半胱天冬酶一3和前半胱天冬酶一7，但不能激活前半胱天冬酶一6。因此，半胱天冬酶级联反应的扩布依存于细胞表达哪一种半胱天冬酶、每一种半胱天冬酶的相对浓度，以及各个转激活反应的动力学效率。另一种半胱天冬酶激活为非一半胱天冬酶蛋白酶途径。最好的例子是由细胞毒T细胞蛋白酶，颗粒酶B(granzymeB)激活的途径。颗粒酶B是一种天冬氨酸特异丝氨酸蛋白酶，它可激活多种半胱天冬酶并强力地诱导细胞凋亡。这个蛋白酶是前半胱天冬酶一3和前半胱天冬酶一7的非常有效的激活因子。颗粒酶8激活前半胱天冬酶一3的速度要比半胱天冬酶一8快55倍，比半胱天冬酶一10快l7倍。另一个丝氨酸蛋白酶，组织蛋白酶G(cathepsin G)可通过裂解Gln一194以后的肽链有效地激活前半胱天冬酶一7，提示天冬氨酸特异性并非半胱天冬酶激活所必需的。但组织蛋白酶G(cathepsinG)还没有在细胞凋亡中起作用的证据。其他蛋白酶包括钙蛋白酶(calpain)、蛋白酶小体、凋亡性丝氨酸蛋白酶P24和组织蛋白酶D已知可在凋亡发生过程中涉及。但这些蛋白酶是直接的还是间接地与半胱天冬酶相互作用还不清楚。钙蛋白酶I诱发的凋亡可能与地塞米松、电离辐射或大分子合成阻断诱导的凋亡有关。已经证明钙蛋白酶可除去前半胱天冬酶一9的CARD功能域而引起半胱天冬酶一9的激活。 半胱天冬酶的共同特征可归纳为：由单一3050kDa的无活性的前体在AspX的肽键被切割，生成1720kDa和1012kDa的大小亚基，酶的活性形式是由大亚基和小亚基组成的四聚体。都有相似的催化部位，包括含有活性位点Cys残基的QACXG基序和一个含His残基的SHG基序；具有自身催化或相互激活的能力。Ca2+可直接或间接地激活半胱天冬酶。半胱天冬酶平时以无活性的酶原形式存在，细胞凋亡信号经有关信号转导通路，通过该家族酶的级联反应使它们激活：首先激活一启动半胱天冬酶(如半胱天冬酶一8、一9，一l0)转而激活执行(效应)半胱天冬酶(如半胱天冬酶一3、一6、一7)。不同的启动子半胱天冬酶介导不同类型凋亡信号，如半胱天冬酶一8与死亡受体参与的凋亡相关；半胱天冬酶一9则与细胞毒因子诱发的凋亡相关。各种特异性蛋白酶抑制剂如牛痘病毒的CrmA、杆状病毒(baculovirus)的P35蛋白因与半胱天冬酶形成稳定复合体而抑制其活性；在神经原中表达杆状病毒P35基因的转基因小鼠对各种因素诱发的凋亡和抽搐引起的神经变性呈现抗性3 9|。根据半胱天冬酶识别序列合成的四肽，如半胱天冬酶一1的YVAD可竞争性抑制它的活性，也可抑制细胞凋亡的诱发。 四、半胱天冬酶的底物 凋亡不论由什么信号启动，均为立体型死亡(见图73)。细胞浆萎缩、细胞膜起泡、小泡形成，以及磷脂酰丝氨酸重新分布至细胞表面。同时胞核收缩、染色质凝聚、DNA断裂成大分子量的寡核小体片段。因此确定半胱天冬酶的底物(substrate of caspase)对于理解细胞凋亡的进程有重要意义。表73列举了5类半胱天冬酶底物的功能。 促一和抗p184表7-3 凋亡性底物（仿自Cryns和Yuan6、Wolf和Greenn11） 底物类别 预计功能 底物举例促一和抗凋亡蛋白信号放大抑制因子激活作用前一半胱天冬酶，BCL -2，BCL - XL，BID，P28Bap31半胱天冬酶激活脱氧核糖核酸酶抑制因子(ICAD)、肌动蛋白、胶溶蛋凋亡机器成员诱发凋亡表型白( gelsolin)、P21激活的激酶-2( PAK2)丝裂原激活的蛋白激酶一细胞外信号调节激酶的激酶-1(MEKKl)、蛋白激酶C(PKC)核纤层蛋白、核有丝分裂器蛋白(nuclear mitotic apparatus protein)、支架结构蛋白和结合分子细胞完整性解体细胞包装附着因子-A (scaffold attachment factor-A)、胞衬蛋白(fodrin)、Gas2生成停顿特异基因-2( growth arrest specific gene-2)编码蛋白、角蛋白、肌动蛋白、rabaptin -5，p-连环蛋白，黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)DNA -依存性蛋白激酶酶促亚单位(DNA dependent protein kinase破坏大分子合成和细catalytic subunit DNA-PKcs)、多聚（ADP -核糖）聚合酶 poly( ADP-ri-稳态蛋白胞修复机制bose) polymerase，PARP、U1 - 70 - kDa蛋白、复制因子C(replication终止存活信号factor C，RFC-140)、不均一核核糖核蛋白(HnRNP)、D4 - GDP解离抑制因子( GDP dissociation inhibitor，GDI)、转录因子其他不明？凋亡诱导Huntingtin蛋白、早老蛋白(presenilin)、萎缩索-1（atrophin -1），ataxin-3，胞浆磷脂酶A2凋亡蛋白可能是凋亡刺激后最早被半胱天冬酶作用的靶分子。这些裂解事件参与信号放大和抑制因子的失活。例如，前半胱天冬酶的转激活可生成足够的蛋白水解活性以消除内源的半胱天冬酶抑制因子。半胱天冬酶-3裂解BCL -2和BCL - xi以破坏它们的抗凋亡功能，释放出有促凋亡作用的C末端片段；半胱天冬酶-8裂解促凋亡BCL -2家族成员BID蛋白，释放出其C末端片段，后者可诱导线粒体细胞色素c的释出。半胱天冬酶-8也可裂解P28 BAP31，它是一个存在在内质网上的BCL -2结合蛋白。它的裂解可促进凋亡信号，因为其N末端片段可诱发凋亡。随着凋亡信号的扩布，半胱天冬酶激活其他凋亡机器成员。其中包括ICAD-DFF45（inhibitor of caspase-activated Dnase，半胱天冬酶激活的脱氧核糖核酸酶的抑制因子）、胶溶素( gelsolin)、P21激活的激酶(P21-acti-vated kinase,PAK2)、MEKKl(mitogen activated protein kinase/extracellular signal-regulat-ed kinase kinase -1，丝裂原激活的蛋白激酶一细胞外信号调节的蛋白激酶的激酶-1)和蛋白激酶C8(PKC8)等。这些蛋白的裂解直接影响凋亡的表型。例如，半胱天冬酶-3裂解ICAD-DFF45，从而使CAD从与ICAD结合的无活性复合体中释出并激活，后者继而裂解DNA和促进染色质的凝聚43。半胱天冬酶-3也可裂解和激活对肌动蛋白动力学有调节作用的胶溶素。已知激活的胶溶素可促进胞浆和胞核的凋亡性改变，包括DNA的裂解在内。半胱天冬酶依存性激活的激酶包括PAK2、MEKK1和PKC也可促进胞浆和胞核的凋亡性变化。MEKK1的激活还可促进半胱天冬酶的激活，即激酶可放大或启动半胱天冬酶级联反应。半胱天冬酶还可裂解核和细胞骨架的结构蛋白。层蛋白、核有丝p185分裂装置蛋白(nuclear mitotic apparatus protein，NuMa)和支架附着因子A(scaffold attachment factor A，SAFA)可能对促进核解体和包扎有作用。半胱天冬酶通过水解胞衬蛋白(fodrin)、Gas一2(growth arrest specific gene一2，生长停顿特异基因一2的编码蛋白)、角蛋白(keratin)、rabaptin一5和肌动蛋白使细胞骨架整合性崩解。一连环蛋白(catenin)和FAK(focal adhesion kinase，黏着斑激酶)的裂解可阻断细胞一细胞接触和细胞一基质黏着斑形成。这些半胱天冬酶底物的蛋白水解可能促进细胞包扎和随后被吞噬细胞的吞噬。另一类半胱天冬酶底物包括在细胞通讯、细胞修复和大分子合成有重要作用的蛋白。这些蛋白包括在蛋白和核酸合成中必需的激酶、其他酶和因子。如参与mRNA剪接的小核糖体蛋白颗粒Ul一70kDa蛋白、参与DNA复制的复制因子C、作为DNA损伤修复的传感分子多聚(ADP一核糖)聚合酶poly(ADPribose)polymerase，PARP、参与DNA损伤修复的DNA依赖性的蛋白激酶(DNAPK)、DNA损伤的传感分子ATM以及不均质核核糖核蛋白(heteronuclear ribonucleoprotein，hnRNP)等。半胱天冬酶促进AKT一1和RAF一1的降解，这些激酶对细胞生长和存活有重要作用。但这些蛋白并非半胱天冬酶的直接底物，因此很可能半胱天冬酶激活其他参与细胞凋亡的蛋白酶。可能这些蛋白的水解可破坏细胞稳态和终止存活信号，但这还有待进一步确证。半胱天冬酶还可裂解早老蛋白(presenilin)、Huntingtin蛋白、萎缩蛋白一l(atrophin一1)和其他与神经退行性疾病有关的蛋白。这些蛋白在凋亡发生时发生裂解，但这些事件的意义尚不清楚。但有人认为半胱天冬酶酶原在低水平时可裂解神经退行性蛋白而生成能启动凋亡和神经退行性疾病的毒性片段。还有人证明多聚谷氨酰胺重复序列，可通过激活半胱天冬酶一8而诱发神经细胞的凋亡。这可能与多聚谷氨酰胺重复序列性疾病Huntington病的发生有关；还有人认为半胱天冬酶对淀粉样一前体蛋白的加工与老年性痴呆的发病有关。图73半胱天冬酶是凋亡执行器的中心组成成分(引自Martin等9) 图上的弧线代表细胞膜，图中的方框内显示凋亡执行器的效应子半胱天冬酶蛋白酶级联反应，指向该方框的箭头表示激活凋亡执行器，由方框出发的箭头表示凋亡执行器激活后引发的后续作用。p186 第三节遗传毒物诱导细胞凋亡的信号及其转导通路 能诱导细胞凋亡的因素很多，可分为：物理性如放射线、高温；化学性如细胞因 子(肿瘤坏死因子)、激素(如糖皮质激素等)、抗癌药、活性氧等；病原体，如HIV、EB病 毒；此外，细胞的缺血、缺氧、缺乏生长必需的生长因子或激素、营养耗尽或炎症反应等也 可导致细胞凋亡。诱导凋亡的信号虽多种多样，但凋亡的生化特征及死亡通路却相当保 守。这些诱导凋亡的因素或信号是如何触发信号转导，从而启动细胞中的凋亡执行器，使 细胞自杀身亡的有的还不很清楚。不同刺激开启细胞死亡之路的通路是不尽相同的。 遗传毒物诱发细胞凋亡的信号转导通路是很复杂的。因为DNA损伤作用可诱发细 胞凋亡早已知晓，但近年来已经证明紫外线和烷化剂都可激活包括TNF和FAS等在内 的细胞表面受体、并有细胞应激信号通路的激活和第二信使神经酰胺细胞水平的升高。 各种遗传毒物还可引起细胞内活性氧离子的生成而发生细胞的氧化应激，从而也可能参 与遗传毒物诱发细胞凋亡的发生过程。线粒体膜通透性改变和损害本身可触发细胞凋 亡，线粒体还参与几乎所有不同原因诱发的细胞凋亡进程。因此遗传毒物诱发细胞凋亡 的信号转导通路是多通路复合的结果。 一、由P53蛋白介导的细胞凋亡14261 (一)细胞的P53依赖性和非依赖性凋亡 许多实验显示在射线等所致的DNA损伤、生存必需因子的短缺以及氧化应激等触 发细胞凋亡过程中野生型P53起重要作用。如对P53基因剔除小鼠的实验发现。 P53/一小鼠的胸腺细胞、小肠及大肠干细胞在遭到辐射性DNA损伤后不会发生凋亡。 但也明确并非所有凋亡过程皆有P53介入，因为发现P53/一小鼠胸腺细胞在接触糖皮 质激素或接触能激活T细胞受体的化合物后仍可发生凋亡。 P53也参与病毒感染、细胞癌基因异常表达或某些肿瘤抑制基因产物缺乏所诱发的凋 亡。如腺病毒EIA蛋白在大鼠胚胎成纤维细胞中表达时使P53蛋白稳定并激活，9,而导9t 细胞凋亡。但腺病毒正常表达的EIB一55kI)a蛋白可与P53结合而阻断其转录因子活性； 而ElB一19kDa蛋白的作用如同Bcl一2，可在P53激活的下游阻断凋亡过程。人乳头状瘤 病毒的E7蛋白也可诱导P53介导的凋亡，在表达E7的转基因小鼠视网膜光受体细胞中有 广泛的凋亡发生，但在P53-一小鼠中凋亡频率降低而视网膜肿瘤的发生率升高；但人乳头 状瘤病毒的E6蛋白则可与P53结合并使之降解。EIA和E7蛋白还可与RB蛋白结合，使 它在E2FDP一1活性调节中失活。E2F一1的失控也通过P53激活而导致凋亡过程的触 发，因在同时有E2F一1过度表达又有温度敏感型P53突变的细胞中，凋亡只在允许温度中 发生。在此模型中还证明MYC的过度表达也可触发P53中介的凋亡。 (二)P53介导的细胞凋亡的下游通路14，18，22，24 在P53中介的凋亡过程发生机制中，P53蛋白转录活性与非转录作用可能皆参与其p187中，但因不同细胞而异。在一些细胞，如由DNA损伤而触发的P53中介的凋亡，在RNA或蛋白合成阻断剂放线菌素D或放线菌酮存在下仍可发生；在P53温度敏感型突变的细胞中，MYC激活在允许温度下所诱发的细胞凋亡也不依赖于新的蛋白合成。在HeLa细胞引入只编码P53蛋白l214氨基酸残基的P53 cDNA片段(不能与DNA结合亦无转录激活作用)仍可诱导细胞凋亡；同样因在转录激活功能域第22和23残基部位有突变而失去转录激活活性的P53仍可诱发HeLa细胞凋亡。反之，在幼年大鼠肾细胞或小鼠细胞，影响P53特异性DNA结合或转录激活作用的突变可使P53蛋白失去凋亡诱导作用。此外，只有l215氨基酸残基的P53蛋白片段虽可诱导HeLa细胞的凋亡，却不能诱导人肺癌细胞Hl299系的凋亡。因此，P53可能通过其转录激活作用及(或)其直接蛋白信号(蛋白质一蛋白质相互作用或其他活性)而触发凋亡。1P53蛋白转录激活作用与细胞凋亡 在已知被P53蛋白激活转录的基因14有WAF1、MDM2、GADD45、KAll、CYCLING、BAX、NOXA241、FAS、PIGs、KILLERDR5、HERP及胰岛素样生长因子结合蛋白一3(insulinlike growth factor binding protein一3，IGFBP3)基因等。其中的BAX、FAS、PIGs、KILLERDR5、PERP及IGF-BP3基因表达的激活可影响细胞进入凋亡的决策过程(见图74)。 BAX基因的促进子中有P53结合部