2019国产球囊导管制作大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型及特性的研究.doc

DOC格式论文，方便您的复制修改删减国产球囊导管制作大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型及特性的研究（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 目的 探讨国产2.0 F球囊导管取代进口球囊导管致大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型的特点及可行性。方法 采用国产2.0 F球囊导管建立大鼠主动脉内皮剥脱模型，分别采用组织形态学和免疫组织化学方法，观察大鼠血管内皮剥脱后内膜增生情况及血管平滑肌细胞(VSMC)表型标志基因SM-肌动蛋白(SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)及型胶原(collagenI)的表达活性。结果 采用国产球囊导管反复3次剥脱大鼠胸腹主动脉，与假手术组作比较，术后7 d模型组血管内膜增生不明显，SM-actin及PCNA表达也均不明显；术后14 d内膜增生较明显，SM-actin及PCNA表达均明显增强；术后21 d内膜呈进行性弥漫性增生，SM-actin表达仍明显增高，但PCNA表达不明显。模型组7、14、21 d collagen表达与假手术组比较，差异均无显著性意义(P0.05)。结论 国产2.0 F球囊导管致大鼠主动脉损伤后，术后1421 d出现明显的血管内膜增生引起血管再狭窄，其内膜增生主要是由于血管平滑肌细胞增殖所致。表明国产2.0 F球囊导管损伤血管后可取得与进口2F Fogarty球囊导管同样的效果。 【关键词】 球囊导管；血管平滑肌细胞；形态计量学；SM-肌动蛋白；增殖细胞核抗原；型胶原；大鼠 To investigate the characteristics and feasibilities of intimal hyperplasia model induced by domestic-made 2.0 balloon catheter in place of imported balloon catheter in rats with aortal lesion. Methods The rat model of aortal endothelial denudation was established with domestic balloon catheter; and the intimal hyperplasia after vessel endothelial denudation and the active expression of SM-actin, PCNA and Collagen were analyzed with immunohistochemistry and histomophorlogical methods respectively. Results Compared with sham operated group, the intimal hyperplasia in the group redenuded arterial endothelium by domestic balloon catheter was not obvious and the expressions of SM-actin and PCNA were also not obvious after 7 days; then, hyperplasia began to be observed obviously, and the expression of both SM-actin and PCNA were obvious very much after 14 days; and the diffuse hyperplasia was progressive but the expression of SM-actin was still not obvious after 21 daysThe difference of Collagenexpression between model group and sham operated group was not statistic significance（P0.05）. Conclusions The vessel restenosis is caused after de-endothelialization from 14 to 21 days, in which the hyperplasia is mainly resulted by proliferation of vascular 经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)能明显减轻心血管疾病的症状，给患者带来福音。但术后的再狭窄(restenosis, RS)发生率仍然居高不下，影响了PTCA的远期疗效。球囊扩张后再狭窄的发生机制包括血管弹性回缩，损伤部位血栓形成，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖、迁移和细胞外基质积聚等1，这些都是PTCA后再狭窄重要的病理生理学基础。目前，有关防治PTCA后再狭窄的发生发展是心血管疾病领域的热点问题。由于进口的球囊导管价格十分昂贵，且很难匹配应用于小动物模型，为建立可靠、价廉的方法，我们采用国产2.0 F球囊导管取代进口的球囊导管，建立大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型，并对该模型的特点及可行性进行了研究。 1 材料与方法 11 材料 111 动物 健康雄性SD大鼠18只，体质量300350 g，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供，合格证号：医动字第20010号； 112 球囊导管 球囊由天津中拓乳胶科技发展有限公司提供；导管（51/2注射针改装）由河北医科大学基础医学研究所生物化学室温进坤教授、韩梅教授惠赠。国产2.0 F球囊导管由球囊和导管组装而成：将2 cm长的球囊套在导管一端，在导管出水孔的上下两个楔形槽分别用细丝线扎紧；导管另一端连接16号注射针并固定好。球囊导管准备好后，在尾端注入生理盐水充盈球囊(黄豆大小)，回缩自如即可(见图1)。 113 试剂 增殖细胞核抗原(The proliferating cell nuclear antigen，PCNA)免疫组化染色试剂盒、兔抗大鼠型胶原多克隆抗体、兔抗大鼠SM-actin多克隆抗体、DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供， SP-9001免疫组化染色试剂盒、多聚赖氨酸由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，其他试剂为进口或国产分析纯。 1.2 方法 12.1 动物模型的建立方法及分组 SD大鼠以水合氯醛麻醉后，作颈部正中切口，手术暴露及游离左颈总动脉11.5 cm，远心端结扎，在左颈总动脉近心端用动脉夹阻断后，于颈总动脉远心端剪一“V”形切口，插入国产2.0 F球囊导管，仔细操纵导管越过主动脉弓入胸，下至腹主动脉，深度约为67 cm。自导管尾端注入生理盐水0.40.6 mL充盈球囊，使球囊膨胀至回拉时有较明显的阻力感，保持阻力一致回拉导管至主动脉弓处，如此重复3次，旋转180°使球囊转至血管腔的另一面，依上法再重复3次，充分剥脱内皮。完成后撤出导管，结扎左颈总动脉近心端血管以止血，逐层缝合肌肉、皮下层及皮肤层。术后腹腔注射青霉素(PNC)20万单位消炎抗菌，连用3 d。将动物随机分为假手术组、模型7 d组、模型14 d组和模型21 d组。假手术组只进行手术操作，不插入球囊损伤。分别于术后不同时间点取损伤部位胸主动脉段进行形态学观察及SM-actin、PCNA及collagen免疫组化检测。 1.22 形态学及血管形态学计量指标的测定 大鼠麻醉后，放血处死，打开胸腔，在内皮剥脱段相同部位取血管1 cm，4多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡垂直定向包埋，每段血管间断均匀切片810张后，常规HE染色。每只大鼠标本不同时间点各随机取3片进行光镜观察、照相和图像分析。按组织学划分，内弹力膜以内为内膜，内弹力膜与外弹力膜之间为中膜。以MIAS医学图像分析系统分别测量外弹力膜内面积、内弹力膜内面积、管腔面积、外弹力膜周径、内弹力膜周径以及管腔周径。并在此基础上计算出中膜面积(外弹力膜内面积-内弹力膜内面积)、内膜面积(内弹力膜内面积-管腔面积)、中膜厚度(外弹力膜周径-内弹力膜周径)/2、内膜厚度(内弹力膜周径-管腔周径)/2、内膜面积增生比率内膜面积/(内膜面积+中膜面积)×100、内膜厚度增生比率内膜厚度/(内膜厚度+中膜厚度)×100、内膜中膜面积比、内膜中膜厚度比。 12.3 免疫组织化学检测 分别对SM-actin、 PCNA及collagen进行免疫组织化学染色，镜下观察相关抗原的表达变化，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达信号。每个指标在假手术组、模型7 d组、模型14 d组和模型21 d组都设立一个阴性对照(阴性对照以PBS替代一抗)。用图像分析系统对表达信号进行分析。结果以灰度值表示，灰度值越小，表示相关的抗原表达越强。 13 统计学分析 应用SPSS11.5统计学软件进行分析，实验结果所有数据均采用均数±标准差(±)表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用DunnettT3检验。 2 结果 21 国产球囊致大鼠主动脉损伤内皮剥脱后光镜下血管形态学变化情况 假手术组大鼠主动脉壁各层结构完整，管腔面积无缩小，内膜光滑无增生，中膜VSMC排列整齐。手术后7 d模型组增生不明显；14 d内膜有增厚，管腔面积有缩小；21 d内膜呈进行性弥漫性增厚，管腔面积明显缩小，增厚的内膜中以VSMC为主，中膜细胞排列紊乱，表明内皮剥脱后21 d已形成典型的血管再狭窄动物模型（见图2）。 22 血管形态学计量指标比较 各组中膜面积和中膜厚度差异均无统计学意义(P0.05)。模型7 d组内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比与假手术组比较，差异均无统计学意义(P0.05)。模型14 d组上述各指标均有所增加，但与假手术组和模型7 d组比较，差异均无统计学意义(P0.05)。模型21 d组内膜显著增生，其内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比均显著高于假手术组和模型7、14 d组(P0.01)。见表1。 23 各组PCNA表达的比较 假手术组未见到阳性细胞；模型7 d组仅可见到极少量的阳性细胞；模型14 d组可见到大量的阳性细胞，PCNA表达非常明显，分布在新生内膜和中膜中；模型21 d组仍可见到较多的阳性细胞，但不及模型14 d组显著(见图3)。各组定量比较见图6。模型14 d组与假手术组、模型7、21 d组比较差异有统计学意义(P0.01)。 24 各组SM-actin表达的比较 假手术组未见到阳性细胞；模型7 d组仅可见到极少量的阳性细胞；模型14 d组和21 d组均可见到大量的阳性细胞，SM-actin表达非常明显（见图4）。各组定量比较见图6。模型14、21 d组SM-actin表达显著高于假手术组和模型7 d组(P0.01)。 25 各组collagenI表达的比较 模型7、14、21 d组collagen表达与假手术组比较，差异无统计学意义(P0.05)，见图5。各组定量比较见图6。 3 讨论 内膜增生的动物模型主要有大鼠、兔、猪、狗和非人类灵长类。但迄今为止尚无一种模型能完整系统地模仿人类PTCA术后再狭窄的发生过程。由于大鼠模型复制简单，成功率高，实验周期短，廉价易得，且其颈总动脉段无侧枝血管，无周围血管内皮的迁徙，其胸主动脉管腔大小适中，中膜肌层较厚，可较好地模拟PTCA手术。加之大鼠一般对动脉粥样硬化具有抗性，进一步减少了影响VSMC增殖的干扰因素，便于机制的阐明，是初筛实验的首选模型2。由于进口的球囊导管价格十分昂贵，尤其它很难匹配应用在小动物模型之上，因此为建立可靠、价廉的方法，我们采用了国产2.0 F球囊导管，试图取代进口的球囊导管，建立大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型，并对其特点及可行性进行了初步研究。 实验中我们不仅从血管形态学方面进行了直观分析，而且通过免疫组化指标加以佐证。形态计量学结果表明国产球囊导管制作的大鼠胸主动脉损伤模型，血管内膜有增生，且增生比较明显的时间点在术后21 d。因此，术后21 d为较好的时间观察点。PCNA是脱氧核糖核酸(DNA)多聚酶的辅助蛋白，它参与DNA的合成，代表细胞的分裂增殖，是反映细胞增殖的一个特异性指标3。结果发现模型14 d可以见到大量阳性细胞，表明增殖活跃的细胞此时PCNA表达增加非常明显。SM-actin是VSMC的特异性抗体，VSMC只有从分化状态转变为去分化状态，才能获得增殖和合成能力，故VSMC表型转化是上述过程发生的前提条件，在血管再狭窄发病机制中占有重要地位。在血管损伤后的初始修复阶段，VSMC呈现活跃增殖，SM-actin含量减少；当病变逐步修复后，VSMC停止分裂增殖，SM-actin含量增加。模型7 d时仅见少量阳性细胞，模型14、21 d可以见到大量的阳性细胞。结合形态学结果和免疫组化PCNA结果，推断术后14、21 d增殖的VSMC渐趋或已恢复到分化状态。胶原是构成正常血管壁和新生内膜细胞外基质(ECM)的主要成分之一。已知的19种胶原中，I、型胶原分别占血管胶原总量的60和30。I型胶原具有促使VSMC由收缩型向合成型转变的作用，因此选用I型胶原能有效反映受损血管ECM的合成情况。然而，不同的粥样硬化斑块中胶原的情况可以有很大区别，即使在同一斑块中胶原的改变亦不均一，如在某一区域以I型及型胶原占优势，几乎没有型或型胶原；而另一区域可在内皮下有大量型胶原包裹的平滑肌细胞。多脂的斑块含有胶原较少，纤维斑块可以没有I型及型胶原而富含型及型胶原4。因此，这可能是实验中collagen表达无明显变化的原因之一。 目前，国际上比较常用的的模型是采用2F Fogarty球囊导管损伤动脉内膜，使血管内膜增生，导致管腔狭窄。与其相比，国产球囊导管简单实用，但造模损伤较轻，剥脱内皮不够均匀，内膜增殖厚度不一致，在短时间内达不到较好的效果。如果在实验具体操作中严格把握前后一致的球囊充盈量、保持始终如一的球囊剥脱摩擦感和进退一致的速度等，通过增加损伤次数，国产2.0 F球囊导管完全可以取得与进口2F Fogarty球囊导管同样的效果，从而使其能够广泛运用于实验之中。【参考文献】 1 Robert S, Schwarts MD. Pathophysiology of restenosis, interaction of thrombosis hyperplasia and/or remodelingJ. Am J Cardiol,1998,81(7A):14E-17E. 2 Mcewan J. Therapeutic approaches to the control of fibrocellular intimal hyperplasia after angioplastyJ. Br Heart J, 1993，（70）：1-3. 3 Takada M, Tanaka H, Yamada T, et al. Antibody to thrombin receptor inhibits neointimal smooth muscle cell accumulation without causing inhibition of platelet aggregation or altering hemostatic parameters after angioplasty in ratJ. Circ Res,1998,（18）：980-987. 4 温进坤，韩 梅.血管平滑肌细胞M.北京:科学出版社，2005:166-166.smooth muscle cell, which shows that domestic balloon catheter can be in place of imported 2F Forgarty one. balloon catheter; vascular smooth muscle cell; norphometry; smooth muscle -actin; proliferating cell nuclear antigen; collagen; rats