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,疑难问题交流,杭州第七中学 生物组 孔彦平,限制性内切酶相关问题,重组DNA分子导入细胞的问题,PCR技术中的一些相关问题,(1)限制性内切酶能够识别和切割单链DNA，例如有些酶能够识别和切割非回文序列，但这种酶在基因工程应用不够广泛,（一）限制性内切酶能否切割单链？,(2)基因工程中的限制性内切酶主要是识别和 切割双链DNA，因为大多数限制内切酶是以 二聚体的形式与DNA结合，酶与DNA形成稳定 的化合物，产生反应，也有部分酶是以单体 的形式与DNA结合,（二）限制酶识别序列的方向性,05全国理综限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC， 限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶 的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶的切点。 请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。 请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。 在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的 黏性末端能否连接起来？为什么？,答案：,可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是 相同的（或是可以互补的）。,有人质疑：,此时得到的目的基因与质粒被限制酶切割后所形成的黏性 末端是无法进行碱基配对,这种情况根本不会出现,DNA分子的两条脱氧核苷酸长链是反向平行的，一条链是53方向，另一条是35方向。在一般表示DNA分子碱基序列的图中，上边一条链是53方向，下边一条是35方向。限制性内切酶的识别序列也是有方向性的，通常写出的限制酶的识别序列是专指53那条链上的碱基序列。在上面的例题中，限制性内切酶的识别序列和切点就是5GGATCC3，限制性内切酶的识别序列和切点是5GATC3。所以上图画的序列中，目的基因所在的DNA序列，只有左边具有一个限制性内切酶的识别序列和切点，右边的那个序列是5CTAG3，不能被限制性内切酶识别和切割，因此上述设想的那种情况不会出现。,下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是 ACTTAAG，切点在C和T之间 BCTTAAG，切点在G和A之间CGAATTC，切点在G和A之间 DCTTAAC，切点在C和T之间,C,CaCl2法制备感受态细胞及转化过程：细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形 ，制成感受态，经42短时间热冲击处理能提高转化的效率。,其中的钙离子的作用机理（假说）：,（1）改变了细胞壁的通透性（用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通性） ：使细胞壁局部原生质化，增加细胞壁的通透性,（2）改变了细胞膜的通透性,低温的CaCl2溶液中 ，（1）Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构 ，当42度热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。（2）促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，同时Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上,实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化 实验目的 通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作,以及如何提高转化效率的思路.本实验综合因素较多,难度较大,是分子生物学中的一个很关键的实验手段. 实验原理 转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA,而导致其原来的遗传性状发生改变,这种遗传性状包括遗传型和表型的改变. 感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态. 用CaCl2处理细菌,改变细胞膜的结构 ,使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞.然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌,转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落.,（1）利用PCR技术扩增特异性的片段，需要知道该片段两端的一小段序列。因为PCR过程中必须需要引物,（2）引物的长度一般在15-30bp之间16-24最佳， 不可超过38bp；可扩增的长度以200-500bp为宜， 特殊条件也可达到10kb以上；四种碱基随机分布， 但3末端避免出现A，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 成串排列；避免在引物内部出现二级结构（ 发卡结构），引物二聚体；在引物中可以添加酶切 位点，有利于目的基因和质粒的连接,PCR中的引物,谢谢！,