酶切和连接.doc

双酶切：载体大小为3000bp左右，在Sfi和BssH位点之间有370bp左右的片段存在。我想通过Sfi和BssH双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。我的酶切体系如下：质粒（载体老片段） 1ul（约100ng）(NEBlack Eye Sfi 1ul(NEBlack Eye BssH 1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul 水 14.8ul 总体积 20ul50度，2小时。切出了370bp左右的片段，回收载体。然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。50度3小时我试过，但是质粒有降解。酶量应该说是过量的。请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的'磷酸和'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端片段连接起来。一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的末端的浓度决定。不论末端位于同一分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体。在瓜作用的底物。如果反应中浓度低，则配对的两个末端同一分子的机会较大（因为分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同分子的末端的概率）。这倦，在浓度低时，质粒重新环化将卓有成效。如果连接反应中浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个分子的末端碰到另一分子末端的可能性也有所增大。因此在浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第、期合刊）从理论上探讨了浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的呈随机卷曲。这样，j与分子的长度成反比（因为越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的分子来说是一个常数，与深度无关。j3/(3lb0)3/2其中l是长度，以cm计，b是随机卷曲的区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响的刚度。i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里o是阿佛伽德罗常数，是的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需浓度之间关系（ugaiczyk等，1985）。 现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源末端的相对浓度的影响。当i是j的倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源末端浓度的倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40都是由单体质粒与外源所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒的连接反应应包含：）足量的载体，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体为20-60g/ml。）未端浓度等于或稍高于载体的外源，如外源浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。(二）粘端连接）用适当的限制酶消化质粒和外源。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。）按如下所述设立连接反应混合物：a将0.1l载体转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源。b加水至7.5l，于45加温分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到。c加入：10xT4噬菌体连接酶缓冲液 l噬菌体连接酶 0.1Weiss单位mmol/L ATP 1l于16温育小时10xT4噬菌体连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500g/ml牛血清白蛋白（组分.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于20。另外，再设立两个对照反应，其中含有（）只有质粒载体；（）只有外源片段。如果外源量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒，并尽可能多加外源，同时保持连接反应体积不超过10l。可用至少种不同方法来测定噬菌体连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，1968)对该酶进行标化。个Weiss单位是指在37下20分钏内催化mmol32P从焦磷酸根置换到,-32PATP所需酶时，个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如ew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015eiss单位的噬菌体连接酶在16下30分钟内可使50的噬菌体Hind片段（5g）得以连接。在本书中，噬菌体连接酶一律用Weiss单位表示。par 目前提供的噬菌体连接酶均为浓溶液（1-5单位/l），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500g/ml牛血清白蛋白、50甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的噬体连接酶于-20保存个月可保持稳定。）每个样品各取l转化大肠杆菌感受态细胞。（三）平端连接噬菌体连接酶不同于大肠杆菌连接酶，它可以催化平端片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下个条件：）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。）不存在亚精胺一类的多胺。）极高浓度的连接酶（50Weiss单位ml）。）高浓度的平端。凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT arrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：）它们可使平端的连接速率加大个数量级，因此可使连接反应在酶浓度不高的条件下进行。）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的浓度下，所有的产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。（）聚乙二醇（PEG8000）用去离子水配制的8000贮存液（40）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和噬菌体连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20进行温育。）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或gCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。）浓度为15的PEG 8000可刺激带粘端的分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。）PEG 8000可刺激短至个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。（）氯化六氨合高钴）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5mol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状将点尽优势。）与 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。连接时的比例：至于PCR产物、酶切产物和质粒浓度的估计，可取一定体积的回收的PCR产物、酶切产物和质粒等与DNA Marker一起跑电泳。由于DNA Marker的浓度已知，应此就知道DNA Marker的上样量。将PCR产物、酶切产物、质粒电泳条带与DNA Marker的条带（最接近PCR产物、酶切产物和质粒条带的那一条）进行对比，就可以大概估计出它们的量，然后再根据PCR产物、酶切产物、质粒的分子量及上样体积，就可以计算出它们的摩尔浓度，从而可确定连接时的用量。也可以根据PCR产物、酶切产物和质粒等的片段大小来确定连接时的用量。比如，根据片段的亮度估计酶切回收后PCR产物的浓度为60 ng/微升、质粒的浓度为180 ng/微升；PCR产物的大小为1000 bp，质粒的大小为6000 bp。质粒的大小是PCR产物的6倍，那么其分子量也差不多是PCR产物的6倍，而每微升质粒的ng数却只是PCR产物的3倍，可见PCR产物的摩尔浓度应比质粒的摩尔浓度高，是质粒摩尔浓度的2倍。这样在连接时，如果质粒的用量为1微升，而又要求PCR产物与质粒的摩尔数之比为3:1，那PCR产物的用量就应该为1.5微升。