酶工程研究及应用.doc

酶工程研究及应用陈红霞山东济宁职业技术学院生物化学工程系 济宁 272037摘要：酶工程是现代生物技术的重要组成部分，它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。介绍了酶固定化、基因工程菌（细胞）的固定化、植物细胞培养产酶、酶的化学修饰、核酸酶、抗体酶、酶标药物的理论和技术研究的最新进展以及酶工程在各工业中的应用，对酶工程的发展前景进行了探讨。关键词：酶工程；酶的固定化；核酸酶；抗体酶，应用Research and Application of Enzyme Engineering CHEN Hong-xiaBiology chemistry Department of Jinning Vocational and Technological College Jinning 272037Abstract：Enzyme engineering is an important composing part of modern biotechnologies，it will take great effect in industry as a new technologyThe new advance in enzyme engineering research includes such as enzyme immobilizatio ，immobilizatio of genetically engineered microorganism（cell），enzyme production by plant cell culture，chemical modification of enzymes，ribozyme ，abzyme ，enzyme labelling drug and the application of enzyme engineering in industryThe prospects of enzyme engineering are also exploredKey words：enzyme engineering；enzyme immobilizatio； ribozyme；abzyme；application1酶工程技术1.1固定化酶和固定化细胞固定化酶是指将可溶的自然酶束缚在特定的支持物上或固定在局限的空间，并能发挥催化作用，而固定含酶的细胞则形成固定化细胞。我国研制过的固定化酶或细胞已有五十种左右，可以分为下述三种类型：固定化单酶或含特定酶的细胞；固定化双酶，将两种酶共固定在一种载体上或分别固定后串联在一起使用；固定化各类激酶构成ATP再生系统。目前已有多种固定化生物催化剂用于医药工业化生产。与天然酶相比，固定化酶和固定化细胞有酶稳定性高，可长期反复使用，利用效率高；反应后酶与产物易分离，可装柱进行反应，实现连续化操作及自动控制，设备小型化，节约能源和人力；转化液中产物浓度高，副产物少，产品易纯化，产品收率和质量高，成本低；绿化生产，无三废污染；可与溶菌酶共固定化或向反应液中加入抑菌剂，抗微生物污染能力强等生产优点。固定化的方法主要有吸附、共价结合、包埋和选择性热变性等。固定化过程必须使用水不溶性固体支持物（载体）。载体要有良好的稳定性，对酸碱和温度有一定耐受性及亲水性，有一定的疏松网状结构和机械强度，颗粒均匀，能耐受酶和微生物作用，共价结合时有可活化基团，廉价易得。吸附法是利用吸附剂、表面作用力或离子交换剂电性作用将酶（细胞）定位于载体表面的技术，当底物或产物为大分子或水溶性较差的小分子物质时，常采用此法制备固定化生物催化剂。常用载体有活性炭、氧化铝、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、石英砂、Amberlite IRA、AmberliteIR、DEAE-纤维素、CMC、DEAE-Sephadex等，如硅皂土或膨润土吸附青霉素酰化酶和DEAE-Sephadex A25吸附氨基酰化酶等1。共价结合法是将酶（细胞）与载体之间通过共价健结合而固定的技术，酶（细胞）与载体结合牢固，不易脱落。常用的载体有纤维素、琼脂、对氨基苯磺酰（ABSE）-纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、对氨基苯纤维素及苯胺多孔玻璃等，如ABSE-纤维素与5-磷酸二酯酶或多核苷酸磷酸化酶的共价结合物、纤维素与葡萄糖氧化酶的共价结合物等。包埋法是将酶（细胞）限制于凝胶网格内或微囊中的技术，如底物及产物为易溶于水的小分子时，可采用此法制备固定化生物催化剂。载体有聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶、琼脂、血纤维、胶原蛋白、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酸高聚物等，如聚丙烯酰胺凝胶包埋D-果糖二磷酸醛缩酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和卡拉胶包埋黄色短杆菌、E.coli等。选择性热变性技术是将酶限制于细胞内，但细胞内酶不变性的技术，如将白色链球菌于60加热10min即成为具有葡萄糖异构酶活性的固定化白色链球菌。在制药工业中包埋法应用较多，其次是吸附法。由于底物和产物性质、酶的性能反应特点及所有反应器类型的差异，要采用不同物理形状的生物催化剂。目前已用的生物催化剂有酶膜、酶片、酶块、酶纤维、酶珠、酶管和酶微囊等形状。固定化细胞包括微生物细胞、动物细胞和植物细胞，目前更多地注重活细胞和增殖细胞的固定化。利用固定化细胞可进行但酶催化反应、多酶催化反应，还可以进行细胞的生长与繁殖，从而制造各种复杂的生化物质。植物细胞固定化大多采用包埋法，处于静止生长期的植物细胞用琼脂、琼脂糖、海藻酸钙或角叉菜胶固定，可获得较高活力的酶制剂。也可用聚氨酯、尼龙或聚丙烯酰胺在有细胞存在时聚合成胶。通常细胞以低密度包埋在颗粒中，经培养成高密度和组织化，创造一定梯度的微环境。如海藻钙包埋的常青花细胞（Catharauthus roseus）不仅可从色胺和开环马钱子碱合成西萝芙木碱，还能从蔗糖经多步酶反应合成西萝芙木碱和蛇根碱；聚氨酯包埋的辣椒细胞合成的辣椒素比游离细胞多2-3个数量级，至今已报道了固定化南洋金花、烟草、胡萝卜等十多种细胞的研究，固定化植物细胞生产生物碱和色素的应用研究尚处于初级阶段。植物细胞固定化技术在进行中药有效成分的生产应用的研究有更好的前景。动物细胞形态大，无细胞壁，成倍时间长，细胞密度、产物浓度和生产率都远低于微生物，只有吸附和包埋法得以成功。目前动物细胞微囊化法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）法，细胞生长密度可达108109。微囊化细胞主要有两方面的应用：培养微囊化动物细胞生产一些药物；作为药物直接用于治疗或作为药物筛选之用。如用来生产单克隆抗体、干扰素、组织纤溶酶原激活剂TPA、白细胞介素、胰岛素生长因子和乙肝病毒表面抗原等。未来将有一大批具有生物活性的蛋白质可依赖固定化细胞在生物体外大规模的合成。1.2固定化酶反应器现代酶工程中，用于转化反应的核心设备称酶反应器。目前医药工业应用的固定化酶反应器型号、规格及种类较多，依进出料方式可分为批量反应器（BSTR）和连续液流反应器（CFTR）。BSTR简单，有单层与多层之分；CFTR有连续搅拌罐（CSTR）及填充床反应器（PFR）两大类。膜反应器（MR）属于PFR；搅拌罐-超滤组合反应器（CSTR-UF）和循环反应器（RCR）是CSTR衍生形式。流化床反应器（FBR）又是CSTR与PFR组合形式。在选择反应器时，除考虑固定酶形状和稳定性、底物和产物性质及载体性质外，还要考虑生产成本、操作方式和反应器应用可塑性等因素。生产量小时选用BSTR；产量大时，为实现自动控制和连续化生产，选择连续流反应器；底物或产物为大分子，溶液黏度大而反应过程需控制温度和pH值时，选择CSTR；当底物溶液黏度大且所用催化剂为酶粉时，选择FBR最佳。反应器的选择应根据经验和具体实验数据而决定。生产时必须确定最佳反应条件，常以定容产率、转化率和产物浓度作为衡量反应条件的指标。欲求最佳转化效果，反应过程需考虑温度、时间、pH值、离子种类及强度、底物及产物浓度和酶活力等综合因素。1.3基因工程菌（细胞）的固定化 生物细胞合成的酶量由于机体生命活动平衡调节的需要，一般不会表达出很高的浓度,从而限制了直接利用天然酶来解决更多化学反应的可能性，基因工程技术的进展和实用为此开辟了有效途径。应用基因重组技术将生物细胞中存在的极少的催化某一生化反应的酶通过基因扩增和增强表达，建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞，从而进一步构建成固定化工程菌或固定化工程细胞的新一代催化剂。如德国BM公司应用蛋白质工程技术对表达青霉素酰化的基因进行点突变改造，重建了青霉素酰化酶工程菌，从而大大延长了固定化青霉素酰化酶的使用半衰期，其酶柱可连续使用700天以上2。应用DAN重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸，反应液中色氨酸浓度可达200g/L3。应用PCR法从E.Coli K12中克隆苯丙氨酸转氨酶基因，构建了生产苯丙氨酸的转氨酶工程菌，并展开了固定化研究和应用。1.4植物细胞培养产酶是20世纪80年代发展起来的新技术。首先选择适宜的植物外植体，经诱导、选育得到优良的植物细胞，再在人工控制条件的生物反应器中培养植物细胞，以生产色素、香精和药物等次级代谢物。植物细胞培养不受地理环境和气候条件等的影响，具有生产周期短、产率高等显著特点，已经发展成为生物工程研究和开发的重要领域。郭勇等人3先后进行了植物细胞培养生产次级代谢物的研究，选育出了优良的木瓜细胞、大蒜细胞、鼠尾草细胞、玫瑰茄细胞、黄花蒿细胞、胡萝卜细胞、巴戟天细胞和银杏细胞等，分别用于生产木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等药用酶以及色素、药物等次级代谢物。超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，EC1.15.1.1 )简称SOD，是一种催化超氧负离子 (-2 )进行氧化还原反应，生成氧和双氧水的氧化还原酶 ，具有抗氧化、抗辐射和抗衰老的功效，是一种颇受关注的药用酶。目前SOD主要从动物血液中分离纯化得到，由于血液中含大量的杂蛋白，分离纯化工艺复杂，难以达到药用要求。从大蒜的外植体中诱导、选育得到优良的大蒜细胞，再通过大蒜细胞培养进行SOD生物合成及其调节控制的研究4.结果表明：大蒜细胞的培养周期为15，培养得到的细胞中SOD的含量超过大蒜蒜瓣中SOD的含量，大蒜细胞中SOD的合成受水杨酸和甲基紫精等物质的诱导，低温胁迫作用也可促进SOD的生成，果胶酶等生物刺激剂可明显提高SOD的生成率。这些结果从理论上阐明了大蒜细胞SOD生物合成的调控机制，为大蒜细胞SOD的工业化生产打下了基础。木瓜凝乳蛋白酶 (Chymopapain)是木瓜乳中含有的一种具凝乳特性的蛋白酶，对腰椎间盘突出等骨质增生疾病有显著疗效，并可用于血型的检测、肿瘤的辅助治疗和消炎等。郭勇等人4在国内外首次采用植物细胞培养技术，从木瓜的外植体中诱导、选育得到优良的木瓜细胞，经细胞培养生产木瓜凝乳蛋白酶。结果表明：细胞培养周期为 1 51 8，细胞中木瓜凝乳蛋白酶的含量超过木瓜果实中的含量，此成果为进一步的研究开发奠定了基础，该成果已申请中国发明专利。1.5酶的化学修饰酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某部分删除或置换，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的。随着基因工程、分子生物学、蛋白质工程、有机合成等技术的发展，酶的大分子物质化学修饰也发展起来，并且在修饰剂的选用和修饰方法上有较大进展。（1）修饰酶的功能基团如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团；由此发展起来的酰化法、烷基化法、丹磺酰氯法等，如抗白血病药物天冬酰胺酶5，经修饰后可使其在血浆中的稳定性提高数倍。（2）进行酶分子内或分子间交联，应用某些双功能试剂分子两端的功能基团如醛基等可使酶分子内或分子间肽链的两个游离氨基分别发生交联,主要有右旋糖苷溴化氰法、羰二亚胺法、戊二醛法等。例如交联后的人-半糖苷酶A，其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显增加6。(3)酶与高分子化合物结合，主要有聚乙烯醇法、聚顺丁烯二酸酐法等。酶与高分子化合物结合后,可以增加酶的稳定性和活力。例如抗白血病药物天冬酰的游离氨作用、酰化反应进行修饰后，该酶在血浆中的稳定性有很大提高；胰凝乳蛋白酶与水溶性大分子化合物右旋糖酐结合后，其催化活力提高4倍7。常用修饰剂主要有乙酸酐、氮芥类、磷氧酰氯、环氧丙烷、重氮盐类、羟胺等8。1.6核酸酶和抗体酶核酸类酶是一类由核糖核酸 (RNA)组成的酶，进一步的研究发现核酸酶不仅可以作用RNA和DNA，而且还作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶还同时具有信使编码功能和催化功能，实现遗传信息的复制、转录和翻译；核酸酶具有核酸序列的高度特异性，从而使核酸酶具有很大的应用价值，只要知道某种核酸酶的核苷酸序列，就可以设计合成催化其自我切割和断裂的核酸组成，根据这些基因组的全部序列，就可以设计并合成出防治有这些病毒引起的人、畜和植物病毒病的核酸酶，如能够防治流感、肝炎、艾滋病和烟草花叶病等。核酸酶也可以治疗某些遗传病和癌症，还可以用作研究核酸图谱和基因表达的工具7。抗体酶 (Abzyme)又称为催化性抗体，一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体酶可以采用诱导法和修饰法获得。修饰法是采用分子修饰技术，将抗体结合部位的结构改变成为酶分子的活性中心，从而产生有催化活性的抗体。诱导法可以采用某种酶为抗原，诱导生成该酶的抗体，再以该酶的抗体为抗原诱导抗抗体的产生。这样，抗体的结合部位与作为抗原的酶的活性中心具有相同的构象，就有可能筛选得到抗体酶。也可以采用某种化合物为半抗原，将它与蛋白质相结合后作为抗原，诱导抗体酶的产生3。抗体酶已经用于酶作用机理的研究、手性药物的合成和拆分、抗癌药物的制备7。1.7酶标药物近来，人们可以根据药物在生物体内可能的作用目标，如酶或受体来设计药物。由此获得的药物被称为。目前，这种设计方法已成为药物设计的主流，在新药设计中发挥了巨大作用。血管紧张素肽转换酶 (ACE)抑制剂是酶标药物的一个成功的实例。血管紧张素肽在人体内以前体形式分泌出来，经ACE水解后生成血管紧张素肽，从而引起血压升高。抑制ACE可以控制血管紧张素肽的释放，进而就能抑制血压升高，ACE抑制剂已经成为重要的、常用的降压药物。细菌对青霉素的耐药性，是由于在青霉素的诱导下大量合成青霉素酰胺酶，从而大大加快青霉素的水解造成的。人们已经能够利用青霉素酰胺酶除去青霉素分子中的苄基，代之以其他基团而获得能够抗青霉素酰胺酶的新青霉素。同时，人们正在努力设计能够抑制青霉素酰胺酶的抑制剂，从而抑制耐药细菌的青霉素酰胺酶，使青霉素重新有效，但是 迄今尚未成功。近来的研究发现，对人类健康构成巨大威胁的艾滋病的感染和传播，主要是由艾滋病病毒颗粒表面的蛋白酶引起的。因此，艾滋病病毒蛋白酶的研究成为一个热点，人们希望通过对艾滋病病毒蛋白酶抑制剂的研究，寻找出防止艾滋病病毒感染和治疗艾滋病的方法 9 10。2酶工程技术的应用现代酶工程具有技术先进、厂房设备投资小、工艺简单、能耗粮耗低、产品收率高、效率高、效益大和污染小等优点，正日益成为食品、化工医药工业应用方面的主力军。以往采用化学合成、微生物发酵及生物材料提取等传统技术生产的产品，皆可通过现代酶工程生产，甚至可获得传统技术不可能得到的昂贵产品，如昂贵药品人胰岛素、McAb、IFN、6-APA、7-ACA及7-ADCA等。特别是在柠檬酸、L-苹果酸、L-乳酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸以及药物产品如1,6-二磷酸果糖、头孢霉素及工业酒精的产生方面都可应用酶工程技术进行规模化生产，固定化基因工程菌、工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙结合，将导致整个发酵工业和化学合成工业的根本性变革。2.1酶工程技术在医药工业中的应用具体表现为：应用固定化细胞可大量生产各种初级或中间产物，产品有D-葡萄糖、D-果糖、甘油、1,6-二磷酸果糖、柠檬酸、苹果酸、富马酸、乳酸、右旋糖酐、丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、6-APA、7-ACA及7-ADCA、麦角生物碱、羟化孕酮、可的松和肉瘤碱等；应用酶工程技术进一步综合应用了酶抑制剂，生化阻断突变株和细胞通透性的改变等从而制得了雄甾-1,4二烯-3,17二酮(ADD)，雄甾-4-烯-3,17二酮(4AD)和3氧联降胆甾1,4二烯-20酸(BDA)等关键中间体，使复杂的天然资源经过几步反应就合成了各种性激素和皮质激素，如应用固定化微生物细胞技术可生产强的松、11-去氧强的松、氢化可的松、-胆甾烯酮、-雄二烯-3,17-二酮等甾体化合物；应用酶工程可以制造6-氨基青霉烷酸(6-APA)，7-烷基头孢烷酸（7-ACA），头孢菌素，7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸（7-ADCA），脱乙酰头孢菌素等抗生素，近年来还进行固定化产黄青霉（青霉素合成酶系）细胞生产青霉素的研究，青霉素和头孢菌素前体物的合成的最新工艺也采用酶工程的方法11；应用酶工程生产氨基酸，制造2-酮基-L-古龙糖酸，肌醇，L肉毒碱，CoA等维生素，由山梨醇和葡萄糖生产维生素及丙烯酰胺的生产也采用酶工程的方法12；应用酶工程生产核苷酸类药物，如腺嘌呤核苷酸 (AMP)由产蛋白假丝酵母菌体用热水提取核酸，再经核酸酶水解制得， ATP和AMP分别由氨甲酰磷酸激酶和激酶加乙酸激酶制得等。2.2酶工程在医疗中的应用由于外原性酶在体内易产生免役反应，且稳定性差，又难达到特定部位，因此固定化酶、人工细胞、脂质体及红细胞膜包埋酶工程技术在临床治疗中的应用日趋活跃。将固定化酶应用于体内作为治疗药物；将固定化酶组装成体外生物反应器，通过体外循环作为临床治疗剂。如用脲酶及脲酸酶治疗肾衰竭和痛风症，将固定化胆红素氧化酶清除血中过高的胆红素；将L-天冬酰胺酶固定于中空纤维上进行体外血液循环，可用于治疗白血病等；将胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、溶菌酶、凝血酶及溶葡萄球菌酶等固定于膜上或纤维上制成辅料贴于伤口，可用于止血，抗炎，促进伤口愈合等。胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶用于血胆固醇定量测定。从植物中克隆苯丙氨酸脱氨酶基因 ，导入肠道有益菌乳酸乳球菌中表达，用以治疗引起儿童智力障碍的苯丙酮尿症，已在动物试验中获得成功13。由于酶传感器所具备的简单、便宜、可靠、准确的优点，它已广泛用于工业发酵、临床监测及监护，如安放于静脉或动脉中的葡萄糖传感器能持续不断地监测血糖含量，并将指令传给植入人体的胰岛素泵，控制胰岛素释放量，而使糖尿病人获救14。2.3酶工程在食品工业的应用应用酶工程技术生产食品添加剂，如采用葡萄糖基转移酶处理甜菊苷，生成葡萄基甜菊苷可除去苦涩味从而改善风味，海藻酸钙包埋乳酸菌生产乳酸，采用从豆类提取的脂肪氧合酶或均质的植物组织，如莴苣叶可将亚油酸转化成具有新鲜、青香气息的顺-3 -己烯醇和反-2 -己烯醇，采用玉米麸质粉为主要原料，经-淀粉酶液化、水解、脱色脱臭及干燥制得新型食品添加剂玉米蛋白发泡粉；应用酶工程技术进行功能食品成分的开发，可生产活性多糖、低聚糖、活性肽及氨基酸、核苷酸和糖醇等，如动物软骨经木瓜蛋白酶处理提取硫酸软骨素，壳聚糖经壳聚糖酶处理制得低聚壳聚糖，卵蛋白经自身酶法脱糖后，加入蛋白酶进行酶解制成卵白肽；酶工程技术在食品加工中有广泛应用，如以玉米淀粉为原料，在糊化时加入耐热-淀粉酶，采用酶脱支反应等手段改变淀粉原有的分子结构并重新结晶，可以提高产品中抗性淀粉的含量，果胶酶可以提高果汁澄清度，葡萄糖氧化酶用于果汁脱氧化，超氧化物酶用于乳请脱色等。2.4酶工程在环保中的应用原先常用的化学方法和物理方法，已经很难达到完全清除污染物的目的。微生物在环境治理方面发挥了巨大的作用，各种微生物酶能够分解糖类、脂肪、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香烃、有机磷农药、氰化物、某些人工合成的聚合物。人们研究的用于环境治理的酶包括如下几类：处理食品工业废水，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、乳糖酶、果胶酶、几丁质酶等；处理造纸工业废水，如木聚糖酶、纤维素酶、漆酶等；处理芳香族化合物，如各种过氧化物酶、酪氨酸酶、萘双氧合酶等；处理氰化物，如氰化酶、腈水解酶、氰化物水合酶等；处理有机磷农药，如对硫磷水解酶、甲胺磷降解酶等，处理重金属，如汞还原酶、磷酸酶等；还有能够完全降解烷基硫酸酯和烷基乙基硫酸酯或部分降解芳基磺酸酯的烷基硫酸酯酶等。随着人们研究的深入，酶工程技术必将在食品、造纸、石油化工、纺织、印染、冶金、制药、农药、煤炭、采矿、电镀、橡胶等各种工业废水和生活污水的治理中发挥越来越大的作用。3酶工程研究应用前景 酶工程的发展在生物工程学科的发展中占有重要位置。21世纪，生物科学与生物工程的发展将进一步揭示生命的奥秘，在世界科技和经济发展中起主导和支柱作用。作为生物工程重要组成部分的酶工程亦将飞速发展，前景广阔。21世纪酶工程的发展主题是3：新酶的研究与开发，酶的优化生产，酶的高效应用。除采用常用技术外，借助基因组学和蛋白质组学的最新知识，借助DNA重排和细胞、噬菌体表面展示技术进行新酶的研究与开发，目前最令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等。充分发挥酶的催化功能、扩大酶的应用范围、提高酶的应用效率是酶工程应用研究的主要目标，要采用固定化、分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高效应用，将固定化技术广泛用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究，使酶工程技术在各工业中发挥更大的作用。参考文献1 李继绗.现代酶工程及其在医药工业中的应用J.中国药学杂志.1994,29(5)2993012 吴梧桐.酶工程技术的研究及其在医药领域的应用J.药学进展,1994,18(3):1291343 郭勇.酶工程研究进展与发展前景J.华南理工大学学报（自然科学版）.2002,30(11):1301334 曾庆平,郭勇.植物细胞对环境胁迫的适应性应答J.应用与环境生物学报.1999,5(2):152 159.5 王正祥,刘吉泉,诸葛健J.生物工程学报,2000,16(3):3013036 甄朱.J.生物工程学报,2001,17(5):4914937 郑成.酶工程的研究进展简述J.韶关学院学报(自然科学版).2001,22(6):39448 居乃琥.21世纪工程研究的新动向J.工业微生物.2001,31(1):37459 Kozarich,J.W.And Rich,D.H.Current Opinion Chem.Biol.1997,1:14915010 马晓建,白净,任珂等. 酶工程研究的新进展J.化工进展.2003,22(8):81381711 Yair Aharonowitz. et al. 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