银杏黄酮的制备.doc

组长：组员：Tel:E-mail:236150351qq.comQQ：236150351指导老师：刘宝全2013年09月 25日实验申请实验项目：银杏黄酮的制备实验原料：银杏叶粉，对照品芦丁实验仪器：（1）大孔吸附树脂 （2）722 型分光光度计 （3）真空泵 （4）超声波细胞粉碎机（5）微波炉实验试剂：乙醇（20%、70%、90%），亚硝酸钠溶液（5%），1M NaOH， 硝酸铝（10%）耗材及辅助器材：（1）移液管 1ml×1，5ml×1，10ml×1 （2）容量瓶 25ml×12 ，500ml×1，100ml×4 （3）洗耳球（4）胶头滴管（5）布氏漏斗 （6）量筒 20ml×1 ，100ml×1（7）抽滤瓶实验操作操作步骤：² 黄酮的提取：1. 校正天平，然后称取处理好的银杏叶粉末 1g。2. 将所称样品加入 50ml70%乙醇中，搅拌混匀。3. 将上述溶液在微波炉中火条件下（10s+10s）处理3 次。4. 然后超声破碎（5s+6s）60 次,测量体积V1，然后搅拌6min.5. 用循环水真空泵过滤。6. 滤液用大孔树脂法精制7. 装柱：树脂柱高度约为 4cm。8. 取滤液上柱吸附，重复2 次，收集流出液，记录体积V2。9. 洗涤：用无水乙醇洗涤树脂 2 次，流出液为无色透明， 再用高纯水洗涤树脂柱，直至无醇味。10. 洗脱：用90%乙醇进行洗脱，收集流出液V3，进行黄酮浓度测定。11. 制作芦丁标准曲线并测定黄酮含量。12. 结束，整理实验台。² 标准曲线的制定及黄酮含量的测定： 1.准确配制 0.292g/L 的芦丁标准液 2.分别取1ml，2ml，3ml，4 ml ，5 ml，6 ml，7 ml，8 ml，9 ml， 标准液和样品液1ml 置于25ml容量瓶中 3.加20%乙醇至12.5ml,加0.5ml亚硝酸钠溶液（5%） 4.放置5min 后加0.5ml 硝酸铝（10%） 5.放置5min 后加5ml 1mol/LNaOH，混匀 6.用20%乙醇稀释至刻度，10min后在510nm 处进行比色测定， 同时做空白对照。记录数值。 7.结束，整理操作操作流程图： 微波辅助浸提称取银杏叶粉末1g 加70%乙醇50ML 样品溶解 超声波辅助浸提循环水真空泵过滤 精制 测V1装柱洗柱 黄酮吸附 洗脱洗脱 收集V2 黄酮含量测定 结束 制作标准曲线 实验记录 试管标号012345样品芦丁标准液/ml0123457芦丁标准液含量（mg）00.2920.5840.8761.1681.46xOD 值510nm00.0590.1180.1700.2300.2830.072实验总结² 数据统计：试管标号012345样品芦丁标准液/ml0123457芦丁标准液含量（mg）00.2920.5840.8761.1681.460.401OD 值510nm00.0590.1180.1700.2300.2830.072已知芦丁标准液的浓度c=0.292g/L，所以有上述计算结果。计算：1ml样品的OD值为0,072，带人代入标准曲线Y=0.1967X-0.0069X = (mg)叶片干粉质量m1=3.015g最后流出液体积V=41ml银杏叶粉黄酮的含量得率= X× ÷m ÷1000×100% =0.401×÷3.015 ÷1000 ×100% =0.273%误差分析：1.仪器与操作人员本身存在着误差。2.由于抽滤两次，所以黄酮含量有所损失3.在吸附前，虽然经过多次洗树脂柱，但由于某些因素，树脂柱可能 没有完全洗净。4.为了保证精制黄酮纯度高，多次用90%乙醇洗涤，所以最终 流出液体积较大。5.在进行吸光值测量时，只用配套的两支比色皿进行比色，一支 测空白，另一支测其它，这样能减少比色皿带来的实验误差。比色 皿放置于第1、3 暗格中，这样方便取用。² 注意事项：1. 微波萃取与超声波破碎时，中间应间隔几秒，间隙时间应大于或等于超声时间，以便于热量散发。时间设定应以超声时间短，超声次数多原则，可延长超声机子以及探头的寿命。2. 树脂柱底端应放一团棉花，防止液体未被吸附就流下； 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等 现象发生。3. 一直保持流速缓慢以加强吸附性，并注意勿使树脂表面干燥。4.分光光度计应预热30min 左右后再进行测量，保证读数稳定。5.天平使用方法： a. 将天平至于干净平整台面，调节水平（气泡位于圆圈内）。 b. 接通电源。 c. 放已知砝码称重。 d. 准则称量药品。不准则校正，然后称量。6.侧吸光值时，最好只用两个比色皿，以减小因比色皿带来的误差。7.在加入试剂520min 内测定吸光值，因为这段时间内颜色最稳 定。8.微波炉不空转，不放金属。² 实验讨论：.实验目的：1.了解黄酮类物质的分离，提取和检测方法。2.了解大孔吸附树脂的特征和在生化分离中的应用。.实验原理：1.提取：溶剂提取法：一般指从中草药中提取有效部位的方法，根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性，选用对活性成分溶解度大、对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内 溶解出来的方法叫溶剂提取法。1.1提取溶剂的选择：中药提取首先要选择适当的溶剂，主要 依据相似相溶原理，即溶质在与之极性相近的溶剂中有更大的溶解度，通过考察溶质与溶剂间的分子极性差异来进行选择。a. 强极性溶剂水。中药中多数成分均可溶于水，如糖、氨基酸、有机酸盐、生物碱盐、多数苷类、鞣质、无机盐等。当直接用提取液作原料生产制剂或饮料，成本费用低，且容易实现。水作溶剂的缺点是提取液存放易腐败变质，因为易于把蛋白质、糖类等易溶于水的成分提取出来造成有效成分含量较低且易霉变。增加了提纯和除杂的度。b. 亲水性有机溶剂。包括甲醇、乙醇、丙酮等可和水任意比例混溶的有机溶剂。这类溶剂既可与水互溶，又可与多数有机溶剂互溶，对中药中各类化学成分的溶解性都较好，对植物细胞组织的穿透能力很强，提取的成分比全面，提取效率高，且提取液不易变质，但多数溶剂具有较强的毒性。c. 亲脂性有机溶剂。多指不与水互溶的有机溶剂，其中石油醚、正己烷、氯仿、乙醚等为强亲脂性溶剂，而乙酸乙酯、正丁醇等亲脂性较弱。这类溶剂可提取的中药成分是油脂、蜡质、挥发油、树脂、游离生物碱、苷元等。但总的来说提取成分范围小、选择性强，毒性大。1.2传统提取方法：浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法等。a. 浸渍法。浸渍法将中草药粉末或者碎块装入适当的容器里，加入适宜的溶剂浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法较简单易行 ，但浸出率较差。b. 渗漉法。渗漉法是往药材粗粉中不断添加溶剂使其渗过粗 粉，下端出口流出浸液的方法。浸润、溶解、扩散与置换连续进行，一般浸出效果优于冷浸法，浸液不需要再分离，适用于有效成分含量较低或贵重药材的提取。c. 煎煮法。煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法，所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿。直火加热最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。d. 回流提取法。应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连续回流冷凝器。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用回流法。提取成分受热时间较长，对热不稳定的成分不宜采用此法。1.3新兴提取方法：微波辅助提取法，超声波辅助提取法，超临界萃取法。a. 微波提取法：微波是指波长从1mm 到1m，介于红外线和无线电波之间之间，频率为3×1063×109Hz 的电磁波。微波提取主要是利用微波强烈的热效应。微波加热过程实质上是介质分子获得微波能并转化成热能的过程。微波在传输过程中，不同材料对微波会产生反射、吸收和穿透作用。其中极性较大的分子可获得较多的微波能，因而运动速度较快，利用这一性质可选择性的提取一些极性成分；此外微波还具有快速，加热均匀，高效和清洁等的优点，因而将微波应用于提取操作简便，产率高，还大大缩短 了提取时间。b. 超声提取法：是利用超声波产生的强烈振动、空化、粉碎 等作用，将植物药材中成分提取到溶剂之中。超声波是一种强的弹性波，其振动能产生强大的能量，给媒质质点以很大的速度和加速度，从而快速穿透植物体，因此使溶剂能和植物中的有效成分充分接触，有利于有效成分向提取溶剂转移，提高提取效率。近年来超声提取在中药研究中有较多应用。提取率高，并且大大缩短了提取时间，所用仪器简单，操作方便，超声波仪自动化程度极高，便于大规模生产。超临界萃取法：超临界流体萃取（SFE）是近30年来迅速发展的一种新提取技术。与传统的有机溶剂提取技术相比较，SFE具有高的提取速率及效率，操作温度低，天然植物中活性成分和对热保稳定成分不易被分解破坏及无溶剂残留等优点，此外还能通过控制临界温度和压力实现选择性提取和分离纯化。缺点是实用溶剂选择面窄，目前主要是二氧化碳，另外对动力系统及提取设备的涉及和加工也有较高的要求。2 分离2.1传统的分离方法：溶剂分离法、沉淀法、盐析法、结晶法。a. 溶剂分离法。包括系统溶剂分离法和两相溶剂.b. 沉淀法。在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。c. 盐析法。指在中草药的水提液中，加入无机盐至一定浓度 ，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析 出，而与水溶性大的杂质分离。d. 结晶法。一般来说，中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶的通性，可以根据溶解度的不同采用结晶法达到分离精制的目的。2.2新兴分离方法：絮凝法、膜分离技术、高效逆流分离技术和树脂法。a. 絮凝法。在中药水提液中加入一种或数种高分子絮凝剂，以吸附架桥或电荷中和的方式使中药水提取液中悬浮物和溶胶聚集成较大的颗粒，使之加速沉降并除去，从而对药液产生澄清和除杂精制效果的一种新技术。b. 膜分离技术：经特殊制造的具有选择性透过性的薄膜，在外力（如膜两侧的压力差、浓度差、电位差）等推动下对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩等操作，以获取需要的产品。膜分离主要有两种原理，一是依靠分离膜上的微孔，利用待分离混合物各组成成分在质量、体积大小和几何形态的差异，用过筛的方法使大于微孔的组分很难通过，从而达到分离的目的；微滤、超滤、纳滤和渗析一般采用该原理分离混合物。二是依靠分离膜组成材料的理化性质，利用待分离混合物各组分对膜亲和性的差异，用扩散的方法使得那些与膜亲和性大的组分，能溶解于膜中并从膜的一册扩散到另一侧，而与膜亲和性小的成分，很难通过扩散作用透过膜，从而达到分离的目的，反渗透，气体分离、液膜分离、渗透蒸发等膜分离过 程一般属于该原理。膜分离具有工艺简单、节能、成本低的优点。c. 高效逆流色谱技术：采用互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋形 的小孔径管子里分段割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。由于该体系中不存在固态载体，避免了载体对组分的吸附和污染，又具有现代色谱连续、自动、快速、高效的特点，其分配效果取决于样品组分的分配系数和管柱特定效能，分辨能力强，样品处理量较大，并可采用较广泛的溶剂系统，特别适合于制备性分离。d. 大孔吸附树脂分离技术：利用大孔吸附树脂的多孔结构和选择性吸附功能，从提取液中分离精制有效成分或有效部位的技术。大孔吸附树脂属于高分子聚合物树脂，是由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。大孔吸附树脂的吸附性不仅取决于其多孔网状型结构，还与大孔树脂的极性和各种功能基团相关。具有吸附选择性高、再生简单以及稳定性好的优点，可采用水、有机溶剂、酸碱溶液对被吸附物质进行洗脱，使用方便。 12 wzcc-