黄曲霉毒素解毒方法.doc

1.1.4 黄曲霉毒素的解毒措施 黄曲霉毒素危害严重，分析每一批家禽饲料中霉菌毒素的含量是不可能的，当慢性霉菌毒素中毒发生时，除了轻微的生产性能下降外，没有任何明确的临床症状。在发展中国家中，每年黄曲霉毒素都会给饲料业及畜牧业带来巨大经济损失。在过去很长的一段时间里，为尽量减少霉菌毒素的危害所做的努力已经取得长足的进步，避免饲料中黄曲霉毒素的含量超过规定允许的浓度是预防和治疗毒素中毒的方法之一。为减少黄曲霉毒素及其代谢物残留在动物性食品中以及减轻毒性反应，适当的方法包括物理分离，化学方法和毒素粘合剂是必须要使用的42，如沸石化合物，活性炭，珍珠岩，膨润土，硅藻土等已经被使用。1.1.4.1 物理去毒方法传统用于霉菌毒素的物理去毒方法主要有混合稀释法、水洗法、热处理、脱壳、磨粉、放射、萃取、吸附等。混合稀释法是将简单地将霉变饲料与未霉变饲料进行混合，以降低饲料中霉菌毒素的浓度，此法成本低，工作量大，不能从根本上解决饲料中毒素的问题。水洗法可显著减少毒素，但只用于湿磨或发酵的前处理，否则干燥成本太高。霉菌素素在谷物表面含量高，脱壳可有效降低霉菌毒素水平，但工作量大。黄曲霉毒素耐热，一些试验表明热处理似乎能降低一些毒素水平，然而实际效果存疑。磨粉处理只能改变毒素的分布，不能减少毒素总量。放射能杀真菌孢子，但不减少毒素含量。有机溶剂可提取花生油、棉籽油中的黄曲霉毒素，几乎可将油中所有的黄曲霉毒素除去，但成本高，应用不广43。 在当前的实际生产中，往饲料中添加可以吸附霉菌毒素的物质是一种常用的方法，利用吸附剂来降低机体对毒素的吸收率，减少毒素对机体的毒害作用，众所周知的吸附剂主要有水合硅铝酸钙钠盐、蒙脱石、膨润土、粘土、沸石和活性炭等。汪前红、齐德生等44,45报道含有矿物、酵母等的复合吸附剂以及蒙脱石均能降低AFB1对动物的负面作用。在含黄曲霉毒素日粮中添加复合吸附剂或蒙脱石，均能在一定程度上能缓解AFB1对动物的毒性作用，降低AFB1中毒的死淘率，一定程度上恢复动物的生产性能，提高动物产品的质量。物理吸附法虽在一定条件下能吸附霉菌毒素，但其吸附毒素的特异性与广谱性的统一还是一个世界性问题。1.1.4.2 化学去毒方法传统的用于降低日粮中黄曲霉毒素的化学方法主要是选用氢氧化钠、氨等能与黄曲霉毒素结合发生反应的化学物质对霉变饲料进行处理，使饲料中黄曲霉毒素结构遭到破坏或钝化其化学结构，从而降低其危害作用，常用的主要包括氨处理、碱处理、氧化剂等方法。一般来说传统打底化学脱毒法效果较好，但成本高，操作困难，处理时营养物质可能会破坏饲料的养分因子而使饲料营养价值和可口性降低。1.1.4.3 生物学方法自1960发现黄曲霉毒素以来，人们为降低其危害作用而研究了许多脱毒方法，早期多以物理方法和化学方法来去除食品或饲料中的毒素，但这些传统方法均或多或少存在效果差、成本高、不易大规模推广等问题，对食品及饲料的价值也有所影响，而在实际生产中应用价值不高。而研究动物原籍菌对黄曲霉毒素的吸附作用并将其应用在动物体内探讨其对黄曲霉毒素的解毒应用效果较少。近年来，用于去除黄曲霉毒素的生物学方法成为研究的热点，越来越多的研究表明，许多微生物及其代谢产物对黄曲霉毒素具有降解能力或吸附作用。微生物降解或酶解法就是用微生物（细菌）产生的酶来分解霉菌素素或直接利用微生物来降解霉菌毒素，据报道，橙色黄杆菌的粗蛋白质提取物可降解在水溶液74.5的AFB1，嗜麦窄食单胞菌降解AFB1的能力可高达85.7%46,47。Teniola等48报道了4株具有降解AFB1活性的菌，其中，红串红球菌的胞外提取物在30与AFB1反应4h后，降解率超过90，8 h可完全降解AFB1。但一些生物降解方法在实际生产上的使用有一定的局限性，如酶的专一性不强、酶的浓度和作用环境不易控制等。吸附作用主要是指微生物对霉菌毒素的吸附作用，添加可以吸附饲料中霉菌毒素的微生物，减少动物对毒素的吸收及毒素在动物体内的肝-肠循环，使毒素更多的排出动物体外，从而减轻霉菌毒素对畜禽危害，这是一种较为成熟可行的方法。目前，吸附黄曲霉毒素的微生物主要研究乳酸菌和酵母菌，且已证实，乳酸菌和双歧杆菌是公认的能减少黄曲霉毒素的并适用于动物的微生物49。1.2 益生菌在黄曲霉毒素解毒中的应用AFB1是一种难以避免的食品污染物，目前各种方法都无法完全消除作物中的黄曲霉毒素。新的研究方法主要着眼于防止AFB1在动物和人类胃肠道吸收，因此生物控制方法受到广泛重视。许多微生物都能去除或降解饲料中的黄曲霉毒素，如细菌（Bacteria）、酵母（Yeast）、真菌（Fungi）、放线菌（Actinomycetes）和藻类（Algae）等50。黄曲霉毒素是致癌的真菌代谢产物，在农产品中检出率很高，避免黄曲霉毒素的污染除了提高农作物的质量和改善贮藏方法外，降低黄曲霉毒素的生物利用度也是行之有效的方法。然而，目前没有一种方法能完全保护人类和动物不受黄曲霉毒素的危害。目前，益生菌的使用是一种精选方法，把益生菌混入被黄曲霉毒素污染的饲料或饮水中，能有效降低黄曲霉毒素在动物体内的吸收率，部分益生菌如枯草芽孢杆菌、酵母、乳酸菌等菌表现出较强的降解黄曲霉毒素的能力51。1.2.1 益生菌去除黄曲霉毒素的机理益生菌（Probiotics）主要是通过吸附作用来去除黄曲霉毒素，学术界认为其解毒机理是益生菌可以吸附黄曲霉毒素，形成益生菌-黄曲霉毒素复合体，当复合体形成后，益生菌自身的吸附特性下降，继而使其与黄曲霉毒素一起更好地排出体外。此外，益生菌对黄曲霉毒素的产生有很强的抑制作用，试验已证实，将益生菌与曲霉菌共同培养或在培养基中添加益生菌代谢产物，对曲霉菌的生长及黄曲霉毒素的产生均有一定的抑制作用，甚至是杀灭作用52。 关于益生菌与AFB1结合所形成的复合物，有些文献报道是可逆的，有些则报道是不可逆的53,54，其稳定性与所使用的菌株、菌株的处理方式、浓度及作用环境等有关，EI-Nezami发现不同乳杆菌菌种（株）对曲霉菌的生长及毒素形成的抑制作用有一定的差别55。另据Halkard等报道，乳酸菌结合AFB1的能力及其稳定性存在种的差异，且乳酸菌吸附AFB1的能力与酸、肠酶、肠黏液没有直接关系56,57。研究认为，益生菌与AFB1作用的温度以及菌体浓度对益生菌吸附AFB1的能力影响较大，一般情况下，菌体浓度越大吸附毒素就越多。吸附AFB1是一个以非共价相互作用的快速过程，受细菌细胞壁结构影响较大，但益生菌活菌体与死菌体吸附黄曲霉毒素的能力相当，这进一步说明益生菌吸附黄曲霉毒素的能力可能取决于细胞壁的结构，且细胞壁的完整性在吸附AFB1的过程中起着非常重要的作用。有些研究者认为益生菌影响曲霉菌产生黄曲霉毒素不是因为益生菌菌体，而是益生菌代谢产物，这些代谢产物可能是小分子的肽58。许多乳酸菌对黄曲霉毒素的降解能力或者吸附作用，可能与在生长过程中产生的各种代谢产物，如有机酸（Organic acids）、细菌素（Bacteriocins）、过氧化氢（Hydrogen Peroxide）、二乙酰（Diacetyl）等59 多种抑菌物质有关，有报道称，植物乳杆菌能比明串珠菌和乳酸杆菌等产生更多的乳酸（Lactic acid）、过氧化氢、二乙酰等物质60，Lavermicocca等又从植物乳杆菌21B中分离到了新的抗菌化合物61，因此植物乳杆菌的高产量代谢物可能是其对AFB1高降解性能的表现。此外，磷壁酸是乳杆菌细胞壁的重要成分，也可能是参与吸附AFB1的重要物质，如已经证实的罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌62。1.2.2 乳酸菌的应用 我国农业部1126号公告饲料添加剂品种目录（2008）中规定的能够直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）等，其中乳酸菌占了较大比例。研究已经证实，乳酸菌对人类和动物都具有健康的益生作用63。乳酸菌中乳杆菌属等能通过产生抗菌化合物（主要是有机酸和细菌素）对食物和饲料中的生物预防起到重要作用，且乳酸菌菌株比片球菌和明串珠菌能去除更多AFB164，目前大量乳酸菌已被应用于各类商业食品及饲料中，用来提高产品的保质期和利用度，减轻毒素的潜在危害。乳杆菌是乳酸菌最大的一个属，左瑞雨等65筛选3株乳酸菌对黄曲霉菌丝的生长有明显抑制作用，且乳酸菌上清液比枯草芽孢杆菌具有更强的黄曲霉孢子抑制作用，此外另有学者报道，无论是活菌，还是经过加热处理后的死菌，乳酸菌对大豆油等食用油或者培养基中AFB1均有吸附的作用66。乳酸菌中，大部分的乳杆菌与可通过黏附素（Adhesin）与肠上皮细胞的黏附素受体（Adhesion receptor）结合，从而定植在动物的肠道中，并产生大量对动物具有益生效果的物质。此外，大部分乳杆菌在体外也具备较强的黄曲霉毒素吸附能力。一些研究表明，某些乳酸杆菌和双歧杆菌能通过结合毒素从而去除液体中的AFB167，且乳酸菌细胞结合AFB1的效果与所选用的菌株有密切关系。Hernandez等62研究表明，罗伊氏乳杆菌和干酪乳杆菌吸附AFB1效力分别可达79%、67%。Shah等68对4株双歧杆菌和2株乳杆菌吸附AFB1能力的研究表明，乳酸菌对AFB1的去除能力可达2050%，用蒸馏水洗涤乳酸菌-AFB1复合物，AFB1仍吸附在乳酸菌上，说明乳酸菌对AFB1有较强的吸附作用。在Flora等研究中，植物乳杆菌是降低谷物中总AFB1含量效果最好的，其次是德氏乳杆菌69。朱新贵等70人将乳酸菌等几种常见的食品微生物分别在摇瓶培养48h后，添加10g/mLAFB1，每6h测定AFB1的含量，发现乳酸菌和枯草杆菌培养液中的AFB1含量减少最多，乳酸菌在48h培养后AFB1含量减少82%，60h后减少了88%。乳酸菌也可降低体内黄曲霉毒素的浓度，之前的研究已表明，鼠李糖乳杆菌GG（ATCC53013）在体外能高效地吸附几种霉菌毒素，包括AFB1，AFM1及其羟基化的代谢产物71，而乳酸菌在体内发挥其吸附AFB1的功效与它们在胃酸环境、十二指肠碱性环境中的存活率有关，只有通过胃和小肠后，乳酸菌才能在机体中发挥持续有效的作用。鼠李糖乳酸杆菌GG是一种能耐受动物的消化道环境的乳酸菌，具有较强的定值力，在人和动物肠道内轻易定植，同时具有调节肠道菌群、排除毒素等益生特性而成为当今最受关注的益生菌之一72。Hani EL-nizami等筛选出了两株鼠李糖乳杆菌LBGG和LC-750，与其它益生菌相比具有更强的吸附能力，吸附率高达80%73，将两株鼠李糖乳杆菌应用于鸡肠腔液，结果显示鼠李糖乳杆菌LBGG可使鸡肠腔液内黄曲霉毒素浓度下降54%，鼠李糖乳杆菌LC-750可使鸡肠腔液内黄曲霉毒素浓度下降44%74。1.2.3 酵母的应用酵母是人和动物体内的一类固定有益菌。研究表明75，酵母能提供维生素、酶和增长蛋白，增强动物免疫反应，改变肠道微生物环境和肠道微生态产酶提高动物对营养物质的生物利用度来发挥其有益作用。此外，酵母可用于家禽饲料，利用其细胞壁成分对黄曲霉毒素具有降解作用，从而通过提高体重增加率、增强免疫反应能力、降低死亡率来降低含黄曲霉毒素的饲料对家禽的危害76。酿酒酵母的解毒作用主要归因于其能产生和黄曲霉毒素分子相互作用的生物酶和其他的生长促进作用77，这种方法不仅提高了家禽的生产力并提高了经济利润，更有利于人类健康。酵母或其成分（抗氧化成分）在体外对抗AFB1对细胞的致突变或毒性作用，可能是由于细胞色素系统介导的N-羟基化酶活性被诱导或抑制，从而增强了肝肾功能，减少基因异常物质78。刘畅等79研究表明，酿酒酵母Y1可通过物理方式与AFB1可逆性结合，但经加热处理后，酿酒酵母Y1细胞壁明显增厚，菌体表面凹凸不平，与AFB1的接触面积明显增大，对AFB1的吸附能力也显著增强。在含黄曲霉毒素的花生粕中分别添加1乳酸菌和1酵母菌处理试样，结果发现，乳酸菌的处理效果显著优于酵母菌，经30厌氧培养72h后，乳酸菌可破坏99.4的AFB1，而酵母只能降解83.4的AFB180。