常用作物生理指标测定方法.doc

SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液。磷酸缓冲液配制：A液（Na2HPO4 0.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml浓度mol/lPH值A液体积mlB液体积ml定容体积ml0.057.891.58.54000.17.584162000.17.061392000.16.012.387.72001/157.06139300130mmol/l甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml0.75mmol/l氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml0.02mmol/l核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存反应液组成 水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05M,PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25mlSOD：称取0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液倒入离心管，再用2ml缓冲液冲洗研钵，倒入离心管中，平衡后低温（0-4）10000rpm离心后10min冷藏保存。取相同型号的试管，加入20l上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml反应液，其中一支对照放于暗处，其余在4000lux下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm下进行比色。计算公式：SOD总活性（units.g-1FW）=(Ack-A)*V/Ack*0.5*W*a(V酶液总体积4ml，w样品重=0.5g，a测定是的酶液体积=0.02ml)POD：取上清液20l加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每个1min读1次（读0，1，2，3min）的OD值。反应液：0.1mol/L，PH=6.0的磷酸50ml,加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器加热溶解，加入30%的H2O219l存于冰箱内。计算公式：POD总活性（OD470/Min.gFW）=OD470*V/a*W(V=4ml,a=0.02ml,W=0.5g)CAT：取上清液100l加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每个1min再读一次（读第0，1min的OD值）。反应液：0.1mol/L PH=7.0磷酸缓冲液20ml，加入0.1mol/LH2O2(5.68ml30%H2O2定容至1000ml)5ml。计算公式：CAT总活性（OD240/Min.gFW）=OD240*V/a*W(V=4ml,a=0.1ml,W=0.5g)数值下降。MDA: 取上清液1ml(对照加1ml水），加2mlTBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000转下离心20min,取上清液于600nm,532nm,450nm下比色。0.67%TBA：称0.67gTBA加少量1mol/LNAOH溶解，再用10%三氯乙酸定容100ml。MDA(g/gFW)=C*V/W=0.1548(D532-D600)+0.013D450(V=0.012L,W=0.5g)可溶性蛋白：取上清液20l（对照加水），加3ml考马斯亮蓝放置2min，立即于595nm比色。G-250：称取100mgG-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%（v/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温可保存一个月。计算公式：蛋白质含量（mg/gFW）=3*Y*V/5*1000*a*W标准曲线Y=143.15OD+3.6（生理组）或Y=143.56OD+1.28（园艺系） V酶液总体积=4ml,a=0.02ml,W=0.5g，3/5由于标线是5ml中的含量，而本方法用3ml，1000将g变为mg)可滴定酸：1.取一彩椒，称重，放入高速组织捣碎机内，加入等量水，捣碎 12min。每 2g 匀浆折算为 1g 试样。2.称取25-50g，用无CO2水100ml，洗入250ml容量瓶，在80度水浴中30min，取出冷却，用无CO2水定容过滤。3.取滤液50ml或100ml加入三角瓶中。加酚酞5-10d，用NaOH标液滴定，呈微红色，当滴定接近终点时，若溶液仍呈橙黄色，可再加2d酚酞，CK空白滴定。记下所消耗的体积。结果计算（1）试样的可滴定酸度以每 100g 或 100mL 中氢离子毫摩尔数表示，按下式计算：可滴定酸度mmol/100g(mL)=（c×V1）/V0×250/m(V)×100式中：c氢氧化钠标准溶液摩尔浓度V1滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL)V0吸取滴定用的样液体积(mL)m(V)试样质量(g)或体积(mL)250试样浸提后定容体积(mL)（2）试样的可滴定酸度以某种酸的百分含量表示，按下式计算：可滴定酸度（%）(c×V1×k)/V0×250/m(V)×100式中：k换算为某种酸克数的系数， 0.1Mol/LNaOH标液：50gNaOH加入500ml蒸馏水，溶解贮于塑料瓶中，吸取5.4ml加入1000ml容量瓶中，用刚煮沸冷却的蒸馏水稀释至刻度。0.5%酚酞：0.5g酚酞加入100ml90%乙醇。本试验用水应是不含二氧化碳的或中性蒸馏水,可在使用前将蒸馏水煮沸、放冷,或加入酚酞指示剂用0.1mol/L氢氧化钠溶液中和至出现微红色。植物组织中游离氨基酸总量的测定：（茚三酮溶液显色法）水合茚三酮试剂：称取0.6g再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9mlPH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶中，置4下保存备用，10d内有效。乙酸-乙酸钠缓冲液（PH5.4）：称取乙酸钠54.4g加入100ml无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至60ml左右。冷却后转入100ml容量瓶中加30ml冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。标准氨基酸：称取80下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为含5g/ml氨基酸之标准液。0.1%抗坏血酸：称取50mg抗坏血酸，溶于50ml无氨蒸馏水中，随配随用。1.样品制备：取干样，混匀后，迅速称取0.05-0.1g,于研钵中加入5ml10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。2.制作标准曲线：取6支20ml刻度试管，按下表操作：试剂123456标准氨基酸/ml00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮/ml3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸/ml0.10.10.10.10.10.1每管含氮量/ml012345加完试剂后混匀，盖上大小适中的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm下测定吸光度。3.样品测定：吸取样品滤液1.0ml，放入20ml干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，向每管中加入3.0ml水合茚三酮，0.1ml抗坏血酸。加完试剂后混匀，封口，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热形成的红色被逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm下测吸光度。 根据标准曲线查得含氮量。 计算公式：100g样品中氨基态氮含量=（C*Vt/Vs*W）*100 (C为从标准曲线查得的氨基态氮含量，g；Vt为样品稀释总体积，ml; Vs为测定时样品体积，ml；W为样品干重，g) 注意：（1）因为茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans自在1h内摆出稳定，故稀释后尽快比色；（2）严格掌握加入抗坏血酸的量；（3）在80水浴中加热，应该适当延长反应时间，效果良好。可溶性糖：0.3g鲜样品（或0.03g干样）加入10ml蒸馏水，封口沸水浴30min（2次）,滤纸漏斗过滤入50ml容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ml加入蒸馏水1ml（对照加2ml蒸馏水），加蒽酮乙酸乙酯0.5ml，加浓硫酸5ml，振荡，沸水浴1min，自然冷却后与630nm下比色。计算公式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106）(Y由Y糖(g)=322.58OD-0.96774查得 V提取液体积=50ml a测定时吸取的体积=1ml n为稀释倍数 W鲜样品重=0.3)叶绿素测定：取新鲜叶片，擦净表面污物，去掉中脉，用打孔器取叶圆片，混匀，称取叶圆片0.2g，加20ml 80%的丙酮（80ml丙酮定容于100ml），封口，置于暗处24-36h，到叶片变白，于663nm,646nm,470nm下比色（对照是80%丙酮）。公式：Ca(mg/L)=12.21D663-2.81D646 Cb=20.13D646-5.03D663 Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 叶绿体色素含量（mg/gFW）=C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)可溶性糖：0.3g鲜样品（或0.03g干样）加入10ml蒸馏水，封口沸水浴30min（2次）,滤纸漏斗过滤入50ml容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ml加入蒸馏水1ml（对照加2ml蒸馏水），加蒽酮乙酸乙酯0.5ml，加浓硫酸5ml，振荡，沸水浴1min，自然冷却后与630nm下比色。计算公式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106）(Y由Y糖(g)=322.58OD-0.96774查得 V提取液体积=50ml a测定时吸取的体积=1ml n为稀释倍数 W鲜样品重=0.3)叶绿素测定：称取叶片0.2g，加20ml 80%的丙酮（80ml丙酮定容于100ml），封口，置于暗处24-36h，到叶片变白，于663nm,646nm,470nm下比色（对照是80%丙酮）。公式：Ca(mg/L)=12.21D663-2.81D646 Cb=20.13D646-5.03D663 Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229 色素含量（mg/gFW）=C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)根系TTC活力：根系去掉根尖和上部老根，去跟0.4-0.5g,剪成2cm长的段，放入试管中，对照先加入1mol/LH2SO4,其余试管中加入0.4%TTC和磷酸缓冲液（1/15mol/L,PH=7.0）等体积混合液10ml，封口，放入37恒温箱4h，取出，除对照外其余加1mol/L H2SO42ml中止反应，放置15min后取出根，吸干，再放回原试管，各试管中加入10ml 95%乙醇，封口，提取24h至根变白，根据颜色稀释3-5倍后，于485nm下比色。40个样用量：0.4%TTC称1gTTC，溶于250ml蒸馏水中。 1/15mol/L PH=7.0 取A=61ml+B液=39ml 稀释到300ml 1mol/L H2SO4: 先在烧杯中加入100ml水，再加入浓硫酸11ml，冷却后定容200ml。计算公式：四氮唑还原强度（g/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022 (h=4 W=0.4-0.5g)植物组织中游离氨基酸总量的测定：（茚三酮溶液显色法）水合茚三酮试剂：称取0.6g再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15ml正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9mlPH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶中，置4下保存备用，10d内有效。乙酸-乙酸钠缓冲液（PH5.4）：称取乙酸钠54.4g加入100ml无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至60ml左右。冷却后转入100ml容量瓶中加30ml冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。标准氨基酸：称取80下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为含5g/ml氨基酸之标准液。0.1%抗坏血酸：称取50mg抗坏血酸，溶于50ml无氨蒸馏水中，随配随用。1.样品制备：取干样，混匀后，迅速称取0.05-0.1g,于研钵中加入5ml10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。2.制作标准曲线：取6支20ml刻度试管，按下表操作：试剂123456标准氨基酸/ml00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮/ml3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸/ml0.10.10.10.10.10.1每管含氮量/ml012345加完试剂后混匀，盖上大小适中的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm下测定吸光度。3.样品测定：吸取样品滤液1.0ml，放入20ml干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，向每管中加入3.0ml水合茚三酮，0.1ml抗坏血酸。加完试剂后混匀，封口，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热形成的红色被逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm下测吸光度。 根据标准曲线查得含氮量。 计算公式：100g样品中氨基态氮含量=（C*Vt/Vs*W）*100 (C为从标准曲线查得的氨基态氮含量，g；Vt为样品稀释总体积，ml; Vs为测定时样品体积，ml；W为样品干重，g) 注意：（1）因为茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans自在1h内摆出稳定，故稀释后尽快比色；（2）严格掌握加入抗坏血酸的量；（3）在80水浴中加热，应该适当延长反应时间，效果良好。测定方法：SOD：称取0.5g 鲜样，加1ml 磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml 缓冲液倒入离心管，再用2ml缓冲液冲洗研钵，倒入离心管中，平衡后低温（0-4）10000rpm 离心后冷藏保存。取相同型号的试管，加入20l 上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml 反应液，其中一支对照放于暗处，其余在4000lux 下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm 下进行比色。磷酸缓冲液配制：A 液（Na2HPO4 0.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB 液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml130mmol/l 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml0.75mmol/l 氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2 溶液：取0.03721gEDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至1000ml0.02mmol/l 核黄素溶液：取0.00753g 核黄素定容至1000ml 避光保存反应液组成水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml 反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05M,PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25ml计算公式：SOD 总活性（units.g-1FW）=(Ack-A)*V/Ack*0.5*W*a(V 酶液总体积4ml，w 样品重=0.5g，a 测定是的酶液体积=0.02ml)SOD 的比活性=SOD 总活性/蛋白质（蛋白质浓度=mg/gFW）POD：取上清液20l加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每个1min读1次（读0，1，2，3min）的OD 值。反应液：0.1mol/L，PH=6.0 的磷酸50ml,加入愈创木酚28l，于磁力搅拌器加热溶解，加入30%的H2O219l 存于冰箱内。计算公式：POD 总活性（OD470/Min.gFW）=OD470*V/a*W(V=4ml,a=0.02ml,W=0.5g)CAT：取上清液100l 加入比色杯中（对照加磷酸），加3ml 反应液，马上读240nm 下的OD 值并计时，每个1min 再读一次（读第0，1min 的OD 值）。反应液：0.1mol/L PH=7.0 磷酸缓冲液20ml，加入0.1mol/LH2O2(5.68ml30%H2O2 定容至1000ml)5ml。计算公式：CAT 总活性（OD240/Min.gFW）=OD240*V/a*W(V=4ml,a=0.1ml,W=0.5g)数值下降。MDA:取上清液1ml(对照加1ml 水），加2mlTBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000 转下离心20min,取上清液于600nm,532nm,450nm 下比色。0.67%TBA：称0.67gTBA 加少量1mol/LNAOH 溶解，再用10%三氯乙酸定容100ml。MDA(g/gFW)=C*V/W=0.1548(D532-D600)+0.013D450(V=0.012L,W=0.5g)可溶性蛋白：取上清液20l（对照加水），加3ml 考马斯亮蓝放置2min，立即于595nm 比色。G-250：称取100mgG-250 溶于50ml90%乙醇中，加入85%（v/v）磷酸100ml，定容至1000ml，常温可保存一个月。计算公式：蛋白质含量（mg/gFW）=3*Y*V/5*1000*a*W标准曲线Y=143.15OD+3.6（生理组）或Y=143.56OD+1.28（园艺系）V 酶液总体积=4ml,a=0.02ml,W=0.5g，3/5 由于标线是5ml 中的含量，而本方法用3ml，1000 将g 变为mg)可滴定酸：1.取一彩椒，称重，放入高速组织捣碎机内，加入等量水，捣碎12min。每2g 匀浆折算为1g 试样。2.称取25-50g，用无CO2 水100ml，洗入250ml 容量瓶，在80 度水浴中30min，取出冷却，用无CO2 水定容过滤。3.取滤液50ml 或100ml 加入三角瓶中。加酚酞5-10d，用NaOH 标液滴定，呈微红色，当滴定接近终点时，若溶液仍呈橙黄色，可再加2d 酚酞，CK 空白滴定。记下所消耗的体积。结果计算（1）试样的可滴定酸度以每100g 或100mL 中氢离子毫摩尔数表示，按下式计算：可滴定酸度mmol/100g(mL)=（c×V1）/V0×250/m(V)×100式中：c氢氧化钠标准溶液摩尔浓度V1滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL)V0吸取滴定用的样液体积(mL)m(V)试样质量(g)或体积(mL)浓度mol/l PH 值A 液体积ml B 液体积ml 定容体积ml0.05 7.8 91.5 8.5 4000.1 7.5 84 16 2000.1 7.0 61 39 2000.1 6.0 12.3 87.7 2001/15 7.0 61 39 300250试样浸提后定容体积(mL)（2）试样的可滴定酸度以某种酸的百分含量表示，按下式计算：可滴定酸度（%）(c×V1×k)/V0×250/m(V)×100式中：k换算为某种酸克数的系数，见表44。其余符号同上式0.1Mol/LNaOH 标液：50gNaOH 加入500ml 蒸馏水，溶解贮于塑料瓶中，吸取5.4ml 加入1000ml 容量瓶中，用刚煮沸冷却的蒸馏水稀释至刻度。0.5%酚酞：0.5g 酚酞加入100ml90%乙醇。本试验用水应是不含二氧化碳的或中性蒸馏水,可在使用前将蒸馏水煮沸、放冷,或加入酚酞指示剂用0.1mol/L 氢氧化钠溶液中和至出现微红色。苹果酸 0.067 仁果类、核果类水果结晶柠檬酸 0.070 柑桔类、浆果类水果(一结晶水) 酒石酸 0.075 葡萄草酸 0.045 菠菜乳酸 0.090 盐渍、发酵制品乙酸 0.060 醋渍制品可溶性糖：0.3g 鲜样品（或0.03g 干样）加入10ml 蒸馏水，封口沸水浴30min（2 次）,滤纸漏斗过滤入50ml 容量瓶中，冲洗残渣，定容。吸提取液1ml 加入蒸馏水1ml（对照加2ml 蒸馏水），加蒽酮乙酸乙酯0.5ml，加浓硫酸5ml，振荡，沸水浴1min，自然冷却后与630nm 下比色。计算公式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106）(Y 由Y 糖(g)=322.58OD-0.96774 查得V 提取液体积=50ml a 测定时吸取的体积=1ml n 为稀释倍数W 鲜样品重=0.3)叶绿素测定： 称取叶片0.2g，加20ml 80%的丙酮（ 80ml 丙酮定容于100ml），封口，置于暗处24-36h，到叶片变白，于663nm,646nm,470nm 下比色（对照是80%丙酮）。公式：Ca(mg/L)=12.21D663-2.81D646Cb=20.13D646-5.03D663Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229色素含量（mg/gFW）=C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)植物组织中游离氨基酸总量的测定：（茚三酮溶液显色法）水合茚三酮试剂：称取0.6g 再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15ml 正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30ml 正丁醇及60ml 乙二醇，最后加入9mlPH5.4 的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶中，置4下保存备用，10d 内有效。乙酸-乙酸钠缓冲液（PH5.4）：称取乙酸钠54.4g 加入100ml 无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至60ml 左右。冷却后转入100ml 容量瓶中加30ml 冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml。标准氨基酸：称取80下烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容至100ml。取此液5ml，用蒸馏水稀释至50ml，即为含5g/ml 氨基酸之标准液。0.1%抗坏血酸：称取50mg 抗坏血酸，溶于50ml 无氨蒸馏水中，随配随用。1.样品制备：取干样，混匀后，迅速称取0.05-0.1g,于研钵中加入5ml10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100ml。混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。2.制作标准曲线：取6 支20ml 刻度试管，按下表操作：试剂1 2 3 4 5 6标准氨基酸/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0无氨蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0水合茚三酮/ml 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0抗坏血酸/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1加完试剂后混匀，盖上大小适中的玻璃球，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm 下测定吸光度。3.样品测定：吸取样品滤液1.0ml，放入20ml 干燥试管中，加无氨蒸馏水1.0ml，向每管中加入3.0ml 水合茚三酮，0.1ml 抗坏血酸。加完试剂后混匀，封口，置沸水中加热15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热形成的红色被逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用60%乙醇定容至20ml。混匀后再570nm 下测吸光度。根据标准曲线查得含氮量。计算公式：100g 样品中氨基态氮含量=（C*Vt/Vs*W）*100 (C 为从标准曲线查得的氨基态氮含量，g；Vt 为样品稀释总体积，ml; Vs 为测定时样品体积，ml；W 为样品干重，g)注意：（1）因为茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans 自在1h 内摆出稳定，故稀释后尽快比色；（2）严格掌握加入抗坏血酸的量；（3）在80水浴中加热，应该适当延长反应时间，效果良好。超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。超氧自由基（O2.）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。二、原理SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50时的酶量作为一个酶活力单位（U）。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片2主要仪器（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个（10）微烧杯 1015mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器 50L×2；100L×2（13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2（14）量筒 50mL×1；100mL×2（15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2（16）细口瓶 125mL×53试剂（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4冰箱中保存可用12d。（3）7.5 × 104 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4冰箱中保存可用23d。（4）含1.0mol/L EDTA的2 × 105 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4冰箱中保存可用810d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0mol/L EDTA的2 × 105 mol/L 核黄素溶液。（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。（6）石英砂。四、操作方法和步骤1酶液的制备按每克鲜叶加入3mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8 500 r/min（10 000g）冷冻离心30min，上清液即为SOD酶粗提液。2酶活力的测定每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中48号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25，光强为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50抑制率的酶液量（L）作为一个酶活力单位（U）。  表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL） 试 剂杯 号试剂（5）试剂（2）试剂（3）酶 液试剂（4）10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.340.851.50.30.050.350.801.50.30.100.360.751.50.30.150.370.701.50.30.200.380.651.50.30.250.3五、结果计算1560nm波长下各杯液的光密度（表2）表2 测定数据列表杯 号123456782、3号平均值酶液量（mL）0000.050.100.150.200.25光密度（OD560nm）0        抑制率（）100100     100以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50抑制率的酶液量（L）作为一个酶活力单位（U）。2SOD酶活力按下式计算AV × 1000 × 60B × W × T式中各因子代表内容如下：A：为酶活力（酶活力单位：U/g（FW）·h）；V：为酶提取