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实验三 苏丹染色法染小鼠肠系膜脂肪细胞【实验目的】1、 熟悉脂肪显示技术，了解脂肪在脂肪细胞中的分布2、 用苏丹染液对小鼠的肠系膜细胞染色，观察细胞颜色，掌握苏丹染液的染色方法。【实验原理】脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等，脂肪依其性质可分中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、髓磷脂以及其他类脂质。通常，各种脂与类脂质在体内不是单独存在，是以某种程度混合存在。脂肪于类脂质和蛋白质结合时，往往不易显出，但用重铬酸钾、升汞、硝酸钴或硝酸铀氧化组织块或切片，可以显现出脂肪及类脂类。脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。脂类不溶于水，易溶于酒精、苯、乙醚、氯仿。因此脂肪标本的制作，需要不含酒精或不能溶脂的液体固定。一般常用甲醛类固定剂。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹、苏丹或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹、苏丹或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。苏丹的70%酒精饱和液或丙酮和70%酒精等量饱和液，可将脂肪染为橙红色。用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片。脂肪标本一般不用石蜡切片或火胶棉包埋，而用如下方法。冰冻切片，明胶包埋冰冻切片，铺片法。脂肪细胞主要是贮存脂肪，而脂肪组织主要是由脂肪细胞组成，从而贮存能量。主要由两种脂肪组织，白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT），它们是由两种不同的脂肪细胞组成，在小鼠的肠系膜中主要是WAT。肠系膜是腹膜的双层膜，它在腹部的后壁连接着空肠和回肠，也就是说，它一般连接着多种腹腔的组成部分。本实验中，主要通过小鼠的肠系膜染色观察脂肪细胞，用断头法直接将小鼠杀死，分离小鼠的腹腔肠系膜，经染色后，在显微镜下观察。【实验用品】1. 实验器材：盖玻片，载玻片，镊子， 解剖剪，解剖盘，胶头滴管，显微镜。2. 实验试剂：甲醛钙，70%的乙醇，蒸馏水，苏丹。3. 实验用品：健康的活小鼠。【实验步骤】1. 用断头法处死小鼠，置于解剖盘中，将小鼠的脸部朝上，用蒸馏水将小鼠的腹部湿润，用镊子轻轻拉起小鼠的外皮，用剪刀在水平位置剪开一个小伤口，然后用剪刀轻轻的剪一个v字型伤口，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下部置一载玻片，用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，小心操作，避免损坏肠系膜。滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。2. 吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。3. 用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。4. 用苏丹染色30分钟。5. 吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。【实验结果】在显微镜下观察脂肪细胞的染色结果：经过实验染色后肠系膜处脂肪细胞可以明显观察到细胞被染成桔红色。如图一。图一 脂肪细胞染色【分析与讨论】1.脂肪细胞里含有大量脂肪，脂肪被苏丹染成橘红色，因而使整个细胞呈现橘红色。2.选取实验的肠系膜时，选择在血管附近的肠系膜，此处细胞含脂肪颗粒比较多，容易观察。但是有一些血管周围的脂肪细胞非常厚，肉眼可见呈白色。这样的地方是无法观察的，所以选材时还要注意材料的透明度。此次实验中共制了4张片，其中有两张选取的肠系膜脂肪细胞较厚，造成视野中脂肪细胞分层堆积，造成观察不便。图一中右图脂肪细胞就相对较多，影响观察。3.染色过程中染料的水分很有可能蒸发，因此在染色过程中应不时向载玻片中滴加染料。4.观察时把物镜由10倍转向40倍时，应考虑物镜变长，要注意不要让镜面蹭到小鼠的小肠。5.若观察时发现血管呈红色，是由于放血时没有放干净，下次实验时应该注意。【拓展】石蜡切片的制备（一）石蜡切片前的准备1切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。2修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约12mm的石蜡边，两边必须平行。3蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。4载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。5准备好毛笔、镊子、染色架。6调好展片器内水的温度（45），有时也可以加些酒精到水中。（二）石蜡切片1将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。2切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。3调整切片机上的切片厚度为47m，然后切片。4.切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带。5展片和捞片：（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。（2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在4550，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。6展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需1224小时，烤干备用。注意事项1切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。2修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。3连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。4使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。5用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点1015；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。6单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处；连续切片的粘片顺序一般是从左到右，组织切片较小是，可以并列粘贴23条蜡带。7烤片的温度不宜过高；烤片的时间要合适。脑组织要待稍微晾干一些后，才能烤片，否则容易产生气泡影响染色和观察。H-E染色（一）步骤1脱蜡二甲苯I 10分钟 二甲苯II 5分钟2水化100%酒精I 5分钟100%酒精II 5分钟95%酒精I 5分钟95%酒精II 5分钟85%酒精 3分钟75%酒精 2分钟蒸馏水冲洗 1分钟3.染色苏木精染色 5分钟自来水洗盐酸酒精分化 15秒自来水洗（镜检）自来水洗 15分钟蒸馏水洗 2分钟75%酒精 2分钟85%酒精 2分钟0.5%伊红染色 1分钟95%酒精I 5分钟95%酒精II 5分钟100%酒精I 5分钟100%酒精II 5分钟二甲苯I 5分钟二甲苯II 5分钟4封片中性树胶封片上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡注意事项1染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。2染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。3伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。4在二甲苯脱蜡之前可以先在60烤箱内0.51小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。5二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。6用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。7在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。糖类细胞化学PAS法显示糖类用来显示糖元和其它多糖物质操作步骤1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精 Carnoy固定液: 纯酒精 60 ml 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml2. 染色液1) 过碘酸酒清夜配法:过碘酸(HIO .2H O) 0.4g 95% 酒精 35ml M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml) 5ml蒸馏水10ml保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.2) Schiff氏液:0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50后过滤,加入10毫升1N盐酸.冷却至25,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.3) Schiff氏酒精液配置 Schiff氏液 11.5ml 1N HCI 0.5ml 纯酒精 23ml4) 亚硫酸水1%偏重亚硫酸钠 10ml 1N HCI 10ml 蒸馏水 180ml的树胶溶解。阿新蓝-PAS法显示酸性、中性黏多糖阿新蓝属于阳离子染料，是显示酸性黏液物质最特异的染料，染料与酸性基团形成盐键。利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别。核酸细胞化学Feulgen反应法DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时还原，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色，其反应式见图2。利用1N HCl 、60下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。图2 Schiff 试剂的反应过程甲基绿-派洛宁法甲基绿,派洛宁为两种碱性染料,与带负电荷的磷酸根形成盐键。甲基绿分子有 两个正电荷, 是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末。溶于水，显蓝绿色。稍溶于乙醇，不溶于戊醇。盐酸中显红黄色，在氢氧化钠中无色。试剂溶液在可见光区有吸收峰。甲基绿为碱性染料,它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿易与双链 DNA 分子结合,使 DNA 显示绿色。派洛宁为碱性染料，有一个正电荷, 易与单链 RNA 结合使 RNA 显示红色。所以派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关。Giemsa染色法Giemsa染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。其主要用Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。Giemsa染色的基本材料为：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56保温2小时后，加入33mL纯甲醇，保存于棕色瓶内。染色的基本步骤为：（1）准备染液：用pH6.817.38的Sorensen缓冲液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液；Sorensen缓冲液的配制：pH6.81：Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL;pH6.98：Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mLpH7.17：Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL；pH7.38：Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。(2)细胞标本用甲醇固定10分钟，或用1:3醋酸/甲醇固定30分钟，用滴管把染色液布满玻片上，注意不要有气泡，用染色缸染色亦可，染1015分钟；(3)用自来水冲去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。Giemsa染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞浆成粉红色。苏木精-伊红(HE)染色基本原理去氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色,所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比.伊红是细胞浆的良好染料。  一般染色组织切片厚度为3µm左右,中枢神经系统68µm,肾小球基底膜染色观察时要求1.52µm标准厚度。步骤（1）切片在二甲苯中脱蜡510分钟。（2）移入二甲苯和纯酒精（11）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。（3）入100、95、 85、70酒精，各级为25分钟。最后经蒸馏水转入染液。（4）苏木精染液染色515分钟。（5）水洗玻片上多余染液，0.51盐酸酒精（70酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。（6）流水冲洗1530分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。（7）蒸馏水短洗。（8）0.10.5伊红染液染色15分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入12滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。（9）依次经70、85、95、100酒精脱水，各级为23分钟，在95以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。（10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。（11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。蛋白质细胞化学碱性蛋白与酸性蛋白显示蛋白质的基本组成单位是氨基酸，它们同时具有氨基和羧基(在溶液中主要以NH3+，COO式存在)，而自由氨基和羧基的游离取决于溶液的pH值，当蛋白质处于酸性溶液时，由于该溶液中正离(OH)多，从而抑制蛋白质中的COOH电离，于是造成蛋白质带正电荷多；当蛋白质处于碱性溶液时，由于该溶液中负离子(OH)多，从而促使蛋白质中的COOH都电离成COO，于是造成蛋白质带负电荷多；当蛋白质处于某一种pH溶液时，它恰好带有相等的正负电荷(呈兼性离子)。此时的pH值称为等电点(pL)，由于蛋白质除了末端氨基和末端羧基之外，还具有许多侧链，其上的许多基团在溶液中也都可以电离，因此，一个蛋白质分子表面四周都有电荷。不同蛋白质分子所带有的碱性基团和酸性基团的数量不等，故它们的等电点也不一样。因此蛋白质分子所带的净电荷取决于：(1)分子中碱性基团和酸性基团含量。(2)所处溶液的pH值，如在生理条件下，整个蛋白质带负电荷多。为酸性蛋白质(等电点偏向酸性)；带正电荷多，为碱性蛋白质(等电点偏向碱性)。据此，可将标本经三氯醋酸处理后，用不同pH的固绿染液(一种弱酸性染料，本身带负电荷)，予以染色，可使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白分别显示。酸性或碱性磷酸酶显示碱性磷酸酶染色（NAP）中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢酱紫等。酸性磷酸酶显示酸性磷酸酶主要位于溶酶体内，是溶酶体的标志酶，而具有吞噬作用的细胞（如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）中溶酶体含量最多，在吞噬过程中溶酶体起着十分重要的作用。Gomori氏法显示酸性磷酸酶的原理：细胞中的酸性磷酸酶分解底物（-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基，在pH5.0的环境中，磷酸基与硝酸铅反应，形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵的作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀。由此而显示酸性磷酸酶在细胞内的存在和分布。过氧化物酶显示（色素形成法）细胞内的过氧化物酶可以将联苯胺氧化成蓝色或者棕色产物，蓝色为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙，通过产物颜色间接显示出细胞内过氧化物酶的分布。酶联仪测定琥珀酸脱氢酶（MTT法）噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，而死细胞没有这种功能。结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。