植物组织培养概念.doc

课程序号： 金丝桃的初代培养和铁皮石斛的继代培养学 院: 化学与生命科学 专 业: 生物科学 姓 名： 孙萍萍 学 号: 09260117 授课教师: 廖芳蕾 提交时间:2011年10月31日一、前言植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。植物组织培养条件有四个条件，分别为1.愈伤组织的培养条件：必须无菌操作 2.材料：刚生长不久，具有高度分裂能力的茎尖，芽尖，感染病毒的机会很小 3.植物细胞全能性，确保组织能培养成植株。 4.在无菌操作室中完成接种工作，然后放于培养室光照（日光灯照射），温度（30度）中培养。所以说完成操作后，在培养室中培养时就需要光照条件组织培养可以增加遗传变异性，改良作物。例如单倍体育种，它通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株，这是一条育种的新途径。单倍体育种可以缩短育种年限，节约人力物力，较快地获得优良品种，目前已有四十多种植物获得了单倍体植株。我国在水稻、小麦、烟草、柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上，处于领先地位。又如胚培养、子房培养、胚珠培养：为了克服远缘杂交的不亲和性，可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段。最早成功的例子是两个栽培种亚麻的杂交胚发生败育，利有杂种胚培养克服了一些障碍，得到种子。现在在棉花、黄麻上也获得成功。从玉米的离体子房培养，经体外受粉可以得到种子。此外，通过原生质体融合，并以选择胞质链霉素抗性做手段以转移烟草的雄性不育性状，或通过原生质体融合转移胞质的抗林可霉素因子都得到成功。组织培养可用于繁殖植物。组织培养中从一个单细胞，一块愈伤组织，一个芽（或其它器官）都可以获得无性系。无性系就是用植物体细胞繁殖所获得的后代。用植物组织培养技术繁殖的无性系可概括为五个类型： 原球茎、器官发生型、胚状体发生型、器官型、无菌短枝扦插。通过组织培养可以做到快速繁殖。1年中从一个芽得到103-106个芽，达到快速目的。通过组织培养可以进行无病毒植株的培育。 组织培养除了在农业上的应用外，目前世界各国都在重视另一个方面，即有用化合物的工业化生产。有用化合物包括药物、橡胶、香精油、色素等。这些化合物许多都是高等植物的次生代谢物，有些化合物还不能大规模地人工合成，而靠植物产生这些化合物来源有限。因此，利用组织培养方法，培养植物的某些器官或愈伤组织，并筛选出高产、高合成能力、生长快的细胞株系，以进行工业化生产，是一条行之有效的途径。 由于生产方法独特，且都是在人工无菌操作和近期温的环境条件下进行大规模的人工培养和工厂化生产，因此组织培养技术对食物资源的保质、保纯和反季节生产有着特殊作用，因而有望成为农产品工厂化生产的基本内容，预计在本世纪将形成大产业。 本次实验用的材料为金丝桃和铁皮石斛。金丝桃（Hypericum monogynum L.）藤黄科（Guttiferae）金丝桃属(Hypericum) 植物。又叫土连翘，为金丝桃科的半常绿小灌木，为半灌木：地上每生长季末枯萎，地下为多年生。小枝纤细且多分枝，叶纸质、无柄、对生、长椭圆形，花期6-7月，常见3-7朵集合成聚伞花序着生在枝顶，此花不但花色金黄，而且其呈束状纤细的雄蕊花丝也灿若金丝，惹人喜爱。是人们很乐于栽培的花木之一。此花原产我国中部及南部地区，常野生于湿润溪边或半阴的山坡下，爱温暖湿润气候，喜光,略耐阴，耐寒，对土壤要求不严，除粘重土境外，在一般的土壤中均能较好地生长；金丝桃的繁殖常用分株、扦插和播种法繁殖。分株在冬春季进行，较易成活，扦插用硬枝，宜在早春孵萌发探前进行，但可在6-7月取带踵的嫩枝扦插。播种则在3-4月进行，因其种子细小，播后宜稍加覆土，并盖草保湿，一般20天即可萌发，头年分栽1次，第二年就能开花。铁皮石斛是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium Sw.）植物，全世界兰科约有500属，15000多种；石斛属是兰科中最大的属之一。中国兰科约有150属，1000种，主要分布于秦岭和长江流域以南省区；石斛属植物大多数种类都集中分布在北纬15°3025°12之间，且越向北延而种类则逐渐减少。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。花期多在春季。它的花形与卡特兰有些相似，主要作盆花栽培。耐低温能力都比较强，越冬温度可低于5或更低，一般在棚室内栽种不易受冻害。它夏季不喜欢太高的温度，在炎热的夏季往往停止生长，应放在通风良好的场所。二、实验目的1、.通过在无菌操作台上进行无菌操作训练，初步掌握组织培养的无菌操作技术。2、 通过本次实验，了解并掌握愈伤组织诱导和茎丛生芽途径的基本程序和方法。三、实验原理1、植物组织培养（Tissue culture）：是指用无菌方法使植物体的离体（in vitro)器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）或试管培养。2、组织培养材料： 器官：根、茎尖、叶、花、果实等 组织：形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等 细胞：大孢子、小孢子、体细胞、原生质体基本特点：无菌、离体材料、人工培养基与培养环境3、植物组织培养特点：培养条件可以人为控制生长周期短，繁殖率高管理方便，利于工厂化生产和自动化控制4、细胞全能性（cell totipotency) ：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。5、植物组织培养过程离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织根芽再生植株再分化6、组织培养植株再生的途径1）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径） ： 是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。胚状体发生途径外植体脱分化愈伤组织胚状体再生植株再分化2）、器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(2，4-D)高(生长素/细胞分裂素)低(生长素/细胞分裂素)器官发生途径7、植物组织培养的类型根据培养方式：固体培养、液体培养固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。固体培养、液体培养的特点：(1)固体培养法是最常用的方法。该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。(2)液体培养法 由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给。复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200rmin，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 培养过程分为:初代培养和继代培养初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。三、母液配制1、经常需配制培养基时，为减少工作量，一般配成比所需浓度高10倍100倍的母液，用时可按比例稀释。这样每种药品称量一次，可以使用多次，并可减少多次称量所造成的误差。母液的配制有两种方法：A.将母液配制成单一化合物母液；(优点：若经常需配制较多种类的培养基比较方便。B.配成几种不同的混合溶液。（优点：在大量配制同种培养基时省时省力。）2、大量元素和微量元素的配制：在配制大量元素无机盐母液时，要防止在混合各种盐类时产生沉淀，各种药品必须在充分溶解后才能混合，同时在混合时要注意先后次序，把钙离子（Ca2+）、锰离子（Mn2+）、钡离子（Ba2+）和硫酸根离子（SO42-）、磷酸根离子（PO43-）错开，以免KH2PO4和MgSO4与CaCl2等发生作用，相互结合生成硫酸钙、硫酸钡、磷酸钙或磷酸锰沉淀。在混合各种无机盐时，其稀释度要大，慢慢地混合，同时边混合边搅拌。在配制微量元素混合母液时也要注意药品的添加顺序，以免产生沉淀3、铁盐的配制铁盐必须单独配制，因为与其他母液混合容易产生沉淀。过去铁盐都采用硫酸亚铁、柠檬酸铁、酒石酸铁、氯化铁，但这些铁盐中的铁离子一般需要在较低pH 值的培养基中才被吸收利用（pH<5.2），pH值高于5.2时容易形成Fe（OH）3不溶性沉淀。因此现在培养基中，几乎都采用螯合铁，即硫酸亚铁和Na2-EDTA的混合物，在pH值7.68.0时也可保证铁的供应源。 4、生长调节物质的配制原液的浓度不宜配制的过大，一般每毫升原液含生长调节物质0.5mg1mg，若经常只需配制少量培养基，可将每毫升原液的生长调节物质调至0.1mg0.2mg，这样既方便量取，精确度也更高。某些生长调节物质不溶于水，在配制时可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，也可加热助溶，或用1mol/LKOH（或NaOH）助溶。激动素（KT）和6-苄基氨莽嘌呤（6-BA），可先溶于少量1mol/L盐酸中，再加水定容。叶酸需用少量稀氨水溶解。 5、母液的保存配制好的母液应分别贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。母液最好在2-4的冰箱中贮存，特别是激素与有机类物质要求较严。贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完。如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。表 MS培养基母液配制（单位：mg）（配成几种不同的混合溶液方法）母液成分规定量扩大倍数称取量母液体积（ml）配1L培养基吸取量（ml）编号种类1大量元素KNO3NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO4CaCl2·2H2190016503701704401010101010190001650037001700440010001002微量元素MnSO4·4H2OZnSO4·7H2OH3BO3KINa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O CoCl2·6H2O22.38.66.20.830.250.0250.025100100100100100100223086062083252.52.51000103铁盐Na2-EDTAFeSO4·4H2O37.327.8100373027801000104维生素甘氨酸盐酸硫胺素VB1盐酸吡哆醇VB6烟酸肌酸2.00.10.50.51005010052525500050010注意事项：药品应采用等级较高的化学纯CP（三级）及分析纯AR（二级），以免杂质对培养物造成不利影响。药品的称量及定容都要准确，在称量时不同的化学药品需使用不同的药匙，避免药品的交叉污染与混杂。称量时应特别仔细，最好有两人校正，以避免因一次的差错，而造成多次的失误，甚至找不到原因。三、培养基配制前准备1、将贮藏的母液按顺序排好。2、将各种玻璃器皿、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。3、称好所需的琼脂、蔗糖，准备好蒸馏水及作盖瓶用的棉塞、包纸、橡皮筋等。4、培养基的配制程序图：配制：水、药、糖、琼脂混合加热溶解调pH分装：玻璃器皿加棉塞或纸盖灭菌：高压灭菌冷却凝固紫外灭菌接种四、培养基的配制(1)在搪瓷杯中加入300400ml的蒸馏水。（搪瓷杯事先要洗净，且用蒸馏水润洗）(2)分别加入大量元素100ml，微量元素10ml，铁盐元素 10ml，肌醇(IVA) 10ml，混合维生素10ml。(3)用电子天平称量30g蔗糖 加入溶液中，用玻璃棒充分搅匀。(4) 称取910g的琼脂备用。(5)将搪瓷杯放在电炉上加热，将溶液加热至6070，然后缓缓加入琼脂，并不断用玻璃棒搅拌，使琼脂混合均匀，持续加热，使琼脂完全溶解后关闭电炉。（溶解琼脂时，要防止溶液沸腾溢出）(6)待溶液冷却至 5060，再加入相应的激素，用玻璃棒搅拌均匀。再将溶液的pH值调制5.86.0。 (7)将培养基分装至培养瓶（锥形瓶）中，每个培养瓶约装4050ml。（在分装时用玻璃棒引流，锥形瓶瓶口不可粘上培养基）(8)将制备的培养基放入高压灭菌锅内在121126oC下灭菌 20min。自然冷却备用。（在灭菌的同时，要准备400500ml的无菌水）注意：还要将镊子，小刀及培养皿一同放入锅中灭菌。注意事项：1、加入母液或生长调节物质时，应事先检查这些药品是否已变色或产生沉淀，已失效的就不要再用。2、先在量筒或烧杯内放一定量的水，以免加入药液时溅出。再按母液顺序，根据母液的不同倍数量取规定的量。3、pH值：调到5.8. 一般用1mol/L NaOH 和 1mol/L HCl 调节4、9-10g (1%)琼脂; 30g (3%)蔗糖5、分装一般以占试管、三角烧瓶等培养容器的1/4-1/3左右为宜。分装时要注意不要将培养基沾到管壁上，以免引起污染，分装后立即塞上棉塞或加上盖子，有不同的处理还要及时做好标记。 6、实验中初代培养用MS培养基，而继代培养用1/2的MS培养基。四、材料的初代培养1、实验的材料：金丝桃的叶子2、最佳培养基配制：最佳叶片愈伤组织诱导培养基为： MS+1.0mg/L BA +0.5mg/L 2,4-D或 MS+1.0mg/L NAA +1.0mg/L 3、材料的消毒：消毒前要经自来水较长时间的冲洗；消毒时要用70%酒精浸泡8秒钟，以无菌水洗23次，然后按材料的老嫩和枝条的坚实程度，采用升汞溶液（0.1%）浸泡2 10 min（叶3min，茎4min为宜）；消毒后用无菌水冲洗3次后方可接种。4、接种室的消毒：每次接种前应进行地面的清洁卫生工作，并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降，并用紫外线灯照射20 min。接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗，使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。5、无菌操作的要求：操作时应禁止谈话并应戴上口罩。6、材料的分离：较大的材料肉眼观察即可操作分离，较小的材料需要在双筒实体解剖镜下放大操作。7、材料的接种：接种时要防止交叉污染的发生，通常在无菌滤纸上切取材料。刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%（或95%）酒精中浸泡，然后灼烧放凉备用。五、材料的继代培养1、实验的材料：初代培养的铁皮石斛2、最佳培养基配制：最佳叶片愈伤组织诱导培养基为：MS+2.0mg/L BA +0.5mg/L 2,4-D或MS+0.5mg/L NAA +1.0mg/L BA3、接种室的消毒：每次接种前应进行地面的清洁卫生工作，并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降，并用紫外线灯照射20 min。接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗，使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。4、无菌操作的要求：操作时应禁止谈话并应戴上口罩。5、材料的分离：用肉眼观察即可操作分离。6、材料的接种：接种时要防止交叉污染的发生，通常在无菌滤纸上切取材料。刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%（或95%）酒精中浸泡，然后灼烧放凉备用。六、形态观察定期观察实验现象，看其是否被污染或褐变及愈伤组织的生成等形态变化和发育情况。七、数据统计记录实验数据，记录实验被污染的数量、发育成愈伤组织的数量等，然后分析实验数据、统计实验结果。八、实验结果 1、金丝桃的愈伤组织的颜色、大小 颜色：绿色、黄色、有的地方已经变干黑化 大小：基本不改变由于季节问题，生长缓慢，正在继续培养中。 2、铁皮石斛的继代培养的颜色、大小 颜色：绿色，微黄色略微泛青色。 大小：长度/cm根茎叶1叶29月26日21.86.34.14.410月11日29.713.57.56.211月25日36.216.89.68.2九、结果分析初代培养：颜色、大小都不均一。有的已经褐变或干掉，但是没有霉菌出现，说明消毒时间太长。应该是在升汞里浸泡时间过长，违反了组织培养有一定污染率的原则，从侧面反映了外植体的大小距离控制不足。继代培养：颜色、大小都不均一。植株都有长长，生长良好。 9-26初代培养10-11初代培养9-26继代培养10-11继代培养10-25继代培养八、结果讨论1、初代培养有部分褐化的现象（褐变的原因及如何防治）很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。     影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐化的作用。强光和高温同样会促进褐化现象。     为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件中进行培养。在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。常用的抗氧化剂有抗坏血酸（VC）、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。可用抗氧化剂溶液预先处理外植体，或者在抗氧化剂溶液中切割和剥离外植体。必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。也可以将抗氧化剂加入到培养基中。另一种方法是在培养基中加入0.51的活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。应当注意的是：活性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高培养基中激素的浓度。还有一种办法是不断地（每隔12d）将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老培养基中褐色物质的不利影响。在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。1.在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化。对形态发生和器官形成有良好作用。一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高是吸附力减弱，甚至会解吸附。通常使用浓度为0.5-10g/L。加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂。很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶。2.植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质，在接触空气中的氧气后其会氧化为相应的醌类物质，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚污染”。在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植物中，此现象较为严重。常用的防治措施如下：A.试用抗酚类氧化的药剂（半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间）B.适当降低培养基温度。C.接种后先进行一定时间的暗培养。D.及时转接入新鲜培养基。E.选择切取外植体部位等。注：易发生褐化的作物在进行组织培养时，先进行预培养（即培养在基础培养基中）23天（如果分泌物多，如利用花魔芋的球茎进行组织培养时，适当延长预培养时间并多次更换培养基），再培养到添加了激素的培养基上。2、植物组培中玻璃化现象及其预防措施 在植物组织培养过程中，叶片和嫩梢呈透明或半透明水浸状的培养物称为玻璃化苗，它是组培苗的一种生理失调症状。玻璃化大大降低了试管苗有效增殖系数，严重影响了试管苗质量，造成人、财、物的极大浪费，必须对玻璃化加以控制。 1、玻璃化苗的特点与发生原因 （1）玻璃化苗的特点 在形态解剖与生理上，玻璃化苗有如下特点： 玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎 叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织而无栅栏组织 体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低 吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至死亡 生根困难，移栽成活率低 （2）发生原因 玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生理性异常所引起。其实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化。不同作物种类或品种，玻璃化的发生频率各不相同，在情人草中较少见，香石竹中则较普遍。 2、影响玻璃化苗产生的因素 （1）生长调节剂 细胞分裂素和生长素的浓度及其比例均影响玻璃化苗产生。高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化，也会使玻璃化苗的发生比例提高。不同的植物发生玻璃化的生长调节剂水平不相同，如香石竹的部分品种在BA 0.5mg/L 时就有玻璃化发生。同一植物的不同阶段对细胞分裂素的要求也不同，在某些特定阶段可忍受较高的浓度，而在其他阶段的培养中，却只需要较低的浓度，如非洲菊只有在 BA 2-10mg/L 时才能诱导幼花托脱分化形成愈伤组织，并在愈伤组织上诱导不定芽;而在丛生芽增殖过程中，BA 1 mg/L 即可满足要求。细胞分裂素与生长素的比例失调，细胞分裂素的含量显著高于两者之间的适宜比例，使试管苗正常生长所 需的生长调节剂水平失衡，也会导致玻璃化的发生。 （2）温度 随着培养温度的升高，苗的生长速度明显加快，但高温达到一定限度后，会对正常的生长和代谢产生不良影响，促进玻璃化的产生。变温培养时，温度变化幅度大，忽高忽低的温度变化容易在瓶内壁形成小水滴，增加容器内湿度，提高玻璃化发生率。 （3）湿度 瓶内湿度与通气条件密切相关，使用有透气孔的膜或通气较好的滤纸、牛皮纸封口膜时，通过气体交换，瓶内湿度降低，玻璃化发生率减少。相反，如果用不透气的瓶盖、封口膜、锡箔纸封口时，不利于气体的交换，在不透气的高湿条件下，苗的生长势快，但玻璃化的发生频率也相对较高。一般来说在单位容积内，培养的材料越多，苗的长势越快，玻璃化出现的频率也越高。 （4）消毒方法 对容易发生玻璃化的品种进行接种时，要尽量减少在水中浸泡的时间，做到随洗随灭，漂洗后马上接种。特别对一些草本花卉，幼嫩的组织在长时间的消毒和清洗后很容易水渍状，继而产生玻璃化。 （5）光照时间 光照影响光合作用和碳水化合物的合成，光照不足再加上高温，极易引起试管苗的过度生长，加速玻璃化发生。 （6）培养基 培养基中的成分对促进培养物的生长和发育有积极的作用，提高培养基中的碳氮比，可以减少玻璃化的比例。增加琼脂用量可降低容器内湿度，随琼脂浓度的增加，玻璃化的比例明显减少。但培养基太硬，影响养分的吸收，使苗的生长速度减慢。（7）继代次数 随着继代次数的增加，愈伤组织和试管苗体内积累过量的细胞分裂素，玻璃化程度不断升高。继代培养最初几代玻璃化苗很少，随着继代次数的增加，玻璃化苗的比例越来越高。这在香石竹、非洲菊等植物中均 有报道。 3、控制和克服玻璃化苗的措施 针对以上玻璃化苗的产生原因，可采取以下措施来减轻玻璃化现象发生。（1）降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等生长抑制物质。 （2）控制适宜的培养温度，避免温度过高，变温培养时注意温差不宜过大。 （3）使用透气性好封口材料，改善培养容器的痛风换气条件，降低容器内湿度。 （4）适当增加培养基琼脂浓度，降低培养基的水势。 （5）减少培养基中含氮化合物的用量，选用低 NH4+水平的B5培养基。 （6）增加自然光照，光照强度较弱时，可通过延长时间进行补偿。 （7）控制继代次数。2、防止人为污染1）真菌的污染    真菌(fungi) 一类没有叶绿素，异养的真核微生物。除极少数种类是单细胞外，绝大多数是由多细胞组成的菌丝，结成一团的菌丝称菌丝体，菌丝分有隔菌丝和无隔菌丝两种。有隔菌丝是由多个细胞组成，相邻的细胞之间由隔丝隔开。在地球上广泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內。皆可有真菌生长。大气中已知的真菌有11255属10万种，在室内常附着在物体表面，能自动或随人的活动而扩散。种类丰富，分布广泛，繁殖快速，无处没有，无处不在。一个季节繁殖4-5代，孢子可达1万亿个。 室内真菌种类：主要有芽枝孢霉属、曲霉属、铰链孢霉属、镰刀霉属、青霉属等，真菌数量的多少，与温度、湿度有很大关系。真菌以腐生、寄生或共生的型式進行異營性生活。釋放消化酵素於鄰近的環境，以分解食物成較小的水溶性分子進入細胞內消化。並可於菌絲產生孢子以完成有性或無性繁殖。真菌季节变化：春、夏季尤其是南方的梅雨时节温暖潮湿，非常适合真菌生长。冬季室内真菌浓度较高。 空调加重污染：如果长期使用空调而不注意通风，可引起室内真菌污染。室内有空调比没有空调情况下曲雾菌落数多4倍。2）细菌（bacteria）的污染细菌是一类微小的单细胞生物，约有多种。从形态上看，细菌可以分成球菌、杆菌和螺旋菌类。细菌是无孔不入的微生物，儿童玩具、手机、计算机键盘和衣服上，甚至植入人体的医用植入物等（如心脏起搏器），都随时有可能沾染细菌，对人体造成危害。为避免细菌的侵袭，科学家曾尝试用抗微生物材料生产各种用品，但效果不十分理想，因为这些材料虽然能杀死细菌，却充满化学物质。细菌是处于生物和无生物之间的东西。泥土里、水里、都市的空气里都有细菌散布着，多到50种以上。三类细菌的形状：就是球形的，杆形的，及螺旋的。球形的有的正圆，有的卵圆；杆形的有长有短，有的微弯螺旋形的也有长短和弯曲的转数多少的不同，有的生着细毛，毛长与短多少不定。虽然概括地说，形状只有球形、杆形、螺旋形这几种，但细分起来，形状还是很不少。论大小，它长约12微米，阔0.5微米余。病菌，能分泌出毒质，如果寄生在体里，因病菌种类的不同，人就会发生不同的疾病。 3）组织培养过程中的污染源1户外风大菌类进屋机会多 2屋内太潮菌类繁衍多3物品带菌多4屋内不干净5屋内清理带菌组培苗6接种不正确4）菌类传播途径1户外风传播 细小如尘、随风飘散、由上下落、见湿就长、有风就有沙、有沙就有尘、有尘就有菌、菌尘混共存2涡流传播超净工作台上，摆放物品太多，当无菌风吹过时，就会在物品周围形成涡流群，菌类就会在涡流群中停留，从而降低净化效果，增加污染机会。3接种传播脏手每只带有细菌4万40万，干净的手，指甲盖大小也有3200多个细菌。指甲缝可以窝藏30多种细菌。1克重的指甲垢里竟藏有38亿个细菌。洗的手3小时后，在大拇指的细菌由原来的300个变成30万个。如果手上带菌较多，在操作过程中，就难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。用肥皂洗手比不用肥皂洗手的杀菌功效要大810倍。流动的温水可去掉95%以上。因此，在注意个人卫生的同时，操作前一定要对手进行彻底消毒。另外，不正确操作也会增加污染机率掀盖生硬，灭菌不够，操作过慢等。接种过程应该轻开盖，火灭慢，操作快。5）相应的措施通风：经常开窗，保持室内空气流通可以使室内真菌数量减少。通风方法简便易行应多使用。去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。因此，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处。防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。 6）污染原因判断及污染苗抢救1若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多。若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染；若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌；2真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。3用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响植物材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。