发育生物学实验.doc

发育生物学实验指导2008-2009学年第二学期 2009年4月2日实验一1原理 卵巢表面为单层立方或扁平的表面上皮，上皮下方为薄层致密结缔组织构成的白膜。卵巢实质分为皮质和髓质。皮质含不同发育阶段的卵泡、黄体和白体，卵泡间结缔组织由低分化的梭形的基质细胞、网状纤维及散在的平滑肌纤维构成。髓质有血管和淋巴管。近卵巢门处有少量门细胞，其结构和功能类似睾丸间质细胞，可分泌雄激素， 在FSH和LH刺激下，每个周期有一批卵泡发育，其中之一发育成熟并排卵。卵泡的发育分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。原始卵泡体积小，由一个初级卵母细胞和一层扁平的卵泡细胞构成。初级卵母细胞为圆形，直径约40m，核大而圆，染色浅，核仁明显，胞质嗜酸性。初级卵母细胞是在胚胎时期由卵原细胞分裂分化形成，并停滞在第一次减数分裂前期，直至排卵前才完成分裂。初级卵泡为原始卵泡在FSH的作用下发育形成。初级卵母细胞增大，在靠近质膜的胞质中出现电子致密的溶酶体，称皮质颗粒。卵泡细胞增生，由扁平变为立方形或柱状，由单层变为多层；最内一层卵泡细胞为柱状，呈放射状排列，称放射冠。在初级卵母细胞与放射冠的卵泡细胞之间出现一层均质状、嗜酸性的透明带。构成透明带的蛋白中，ZP3为精子受体。次级卵泡 其内出现卵泡腔，腔内充满卵泡液；初级卵母细胞、透明带、放射冠及部分卵泡细胞突入卵泡腔内形成卵丘；卵泡腔周围的数层卵泡细胞形成卵泡壁，称颗粒层，卵泡细胞改称颗粒细胞。初级卵泡和次级卵泡合称生长卵泡，其周围形成卵泡膜。卵泡膜内层有多边形或梭形的膜细胞，具有分泌类固醇激素细胞的特征；外层有胶原纤维和平滑肌纤维，膜细胞合成雄激素，雄激素进入颗粒细胞，转化为雌激素，故雌激素由两种细胞联合产生。成熟卵泡 在LH刺激下，次级卵泡发育为成熟卵泡。初级卵母细胞直径可达150m。由于卵泡液急剧增多卵泡体积显著增大，直径可超过2cm，并向卵巢表面突出。在排卵前3648小时，初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成次级卵母细胞和第一极体。第一极体很小，含极少量胞质。次级卵母细胞迅速进入第二次减数分裂，停滞在分裂中期。绝大多数卵泡不能发育成熟，它们在发育的各个阶段停止生长并退化，退化的卵泡称闭锁卵泡。精子的发生精子发生的全过程是在精巢内进行的。各种动物的精巢结构不同，精子的形态也各种各样，但是精子发生的规律基本相似。精子发生都必须经历增殖期、生长期、成熟期和精子形成期这几个阶段。生精细胞包括精原细胞（spermatogonium）、初级精母细胞（primary spermatocyte）、次级精母细胞（secondary spermatocyte）、精子细胞（spematid）和精子（sperm）。在生精细胞之间还分布着一种称之为支持细胞（sertoli cell）的体细胞。它对生精细胞具有支持、营养和分解残余物质的作用，也具有调节精子发生和诱导精子形成的作用。 精子的发生是一个连续的过程。在哺乳类精巢中有许许多多的生精细管，在生精细管上有规律地分布着各期生精细胞。而在两栖类或鱼类，精子的发生有着明显的季节性变化。在精巢中生精细胞分布在精小叶中，各期生精细胞以精小囊为单位。在同一个精小囊中的生精细胞往往为同一发育期的生精细胞，不同精小囊的生精细胞发育不同步。本实验以哺乳类、蛙的精巢为材料，观察精子的发生过程和精子的形态特征。一、精子的发生 1、取哺乳类精巢切片，置显微镜下先用低倍镜观察，可见在整个精巢外表有一层较厚的结缔组织膜，称白膜（tunica albuginea），白膜的结缔组织伸到精巢内形成一些结缔组织小隔，称精巢小隔（septula testis），把精巢分隔成许多锥形小叶，每个小叶有1-4条生精细管。在切片中可见生精细管多呈横切面，每个生精细管外有一薄层的结缔组织。选一生精细管置高倍镜及油镜下仔细观察，注意生精细管的管壁由数层发育不同时期的生精细胞所构成，自管壁向管腔依次排列如下：精原细胞 为生精细管管壁上最外层的生精细胞，紧附于结缔组织之内，通常为一层细胞，呈圆形，胞核染色深。精原细胞经过若干次有丝分裂后，最后一代的细胞长大为精母细胞。初级精母细胞 初级精母细胞位于精原细胞的内方，为生精细管上各期生精细胞中体积最大的细胞，有二、三层。核非常明显，可见到处于减数分裂前期不同时期的变化，有时还可见到正在进行第一次成熟分裂。次级精母细胞 初级精母细胞经第一次成熟分裂后形成次级精母细胞，大小为初级精母细胞的一半，位于初级精母细胞的内方。次级精母细胞的染色体已减少一半，为单倍体，细胞染色较浅。由于次级精母细胞存在的时间很短，所以在切片中数目有时也少，通常为一、二层。精子细胞 次级精母细胞经过第二次成熟分裂，形成精子细胞。精子细胞位于次级精母细胞的内方，接近生精细管的管腔。精子细胞较次级精母细胞小，细胞呈卵圆形，细胞核染色深，有的可见到精子细胞在精子形成中的不同形态变化。精子 精子细胞完成分化过程形成精子。精子位于生精细管的管腔中，精子聚集成束，一般头部朝向管壁或深埋在支持细胞的细胞质中。精子具有染色很深的头部和鞭毛状的尾部。4.实验步骤调节光源放置标片观察绘图5 作业：1）卵巢和精巢的组织构成（描述）2)各阶段卵母细胞和精巢细胞的形态特征（描述或绘图）实验二 精子获能的鉴定实验1实验器材 冻置装置 水浴锅 培养皿 5ml注射器 1ml移液枪 枪头 倒置显微镜 载玻片 PH试纸, 2实验试剂 生理盐水、BO培养基、 双抗、E2、 P4 、 无水乙醇、 95%乙醇 、考马斯亮蓝G250染液、 NaHCO3、 HCl 、 肝素3材料 冷冻精液4原理精子在离开雄性生殖系统时，虽有完整的形态和独立运动能力，但不能立刻与卵子受精，必须在雌性生殖道或在体外的特定介质中进行最后成熟，即“获能”（Sperm Capacitation），才能与同种动物的卵子受精，这是受精过程最基本的一步，特别在体外受精技术中是相当关键的一步。精卵结合之前,精子应该具备如下能力:有能力到达卵母细胞并穿过透明带;有能力进行获能和顶体反应;成熟过程中获得的蛋白结合位点,能适时暴露给卵母细胞以结合透明带;可以与卵母细胞膜融合并且将遗传物质注入到卵子的细胞质中。精子通过附睾时已经获得上述大部分能力。但精子必须在雌性生殖道或体外培养液中停留一段时间获能以后才具备完整的授精条件。精子获能的理想场所是一新近交配的雌性生殖道。精子体外获能的实质是模仿体内获能,但体内获能的效率远远比体外获能的高。精子获能是一个十分复杂的生理现象,它是顶体反应的前奏,顶体反应是获能的必然结果,是授精的必要条件。精子获能与顶体反应是使精子穿过卵细胞的透明带,发动授精过程的必需生理事件。一般认为精子获能的意义在于使精子准备发生顶体反应和超激化,促使精子穿透卵子。精子在若干生殖道获能因子的作用下，精膜发生一系列变化（吸附于精子膜表面精清蛋白的去除和膜表面蛋白重组等），进而产生生化和运动方式的改变。获能后精子穿越卵母细胞周围的滤泡细胞和透明带的能力提高，是精子发生顶体反应的前奏。精子一旦获能,其运动类型发生显著改变,精子头部侧摆幅度和频率明显增加,尾部振幅加大,频率加快,呈现一种特殊的超激活运动(HAM)或鞭打样运动。HAM是精子为适应受精而形成的一种特殊的运动类型,所反映的是精子运动能力和方式的改变。应用显微录像技术、连续分步曝光照相技术、计算机辅助精液分析(CASA)技术对精子运动轨迹进行分析,可以从精子运动学本质来研究和相对客观的确定超激活精子。CASA分析系统可达到客观准确的量化精子运动状况,通过对精子头部运动轨迹摆动图型的分析可获得多项参数,使人们对精子运动有了更深层次的了解。如人精子获能后表现为精子运动轨迹速度(VCL)的增加,线形度(LIN)和直线性(STR)的降低,头部侧置量(ALH)的增加。对于群体激活精子可用下列标准界定,即VCL>100m /s, LIN65和ALH7. 5m /s。然而, CASA分析系统受诸多因素的影响,该仪器难以从非精子物质中识别精子因而测定值的准确性受精液中细胞成分和非细胞颗粒物质的干扰。又因使用的仪器不同,或者设置的参数不一样,不同的实验室也会有不同的CASA界定标准,偏差较大,至今尚未找到公认的统一手段。顶体反应(AR)是精子在受精过程中经历的重要环节之一。AR与精子获能密切相关，并且标志着获能的完成，主要表现为精子顶体的囊泡化，即精子获能时，头部质膜首先出现不同程度的膨胀，有些精子经过头部的互相帖挥，质膜很快破裂、脱落，顶体内电子密度较大的物质形成致密小团块，顶体囊泡化是在双层顶体外膜之间经过局部融合而形成的，随后逐步溶解脱落，顶体内膜仍包在精子核膜外面，有时在顶体延伸部也形成一些小泡。考马斯亮蓝染色法，CBB是常用的蛋白质染色剂，经考马斯亮蓝染色后，完整的精子即未获能的精子顶体外膜内含有的大量糖蛋白，精子头部顶端顶体区呈深蓝色，而获能后的精子其顶体膜破裂，糖蛋白被释放出来，顶体区不着色，反差明显，容易辨别。CBB染色结果在普通光学显微镜下观察:染色后，所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈A型和B型两种染色类型。A型为没有发生顶体反应的精子，顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色;B型为已发生顶体反应的精子，顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似。两类精子的根本差别是顶体区是否染成紫蓝色。考马斯亮蓝检查结果的稳定性重复性好，批内之间的差异不大，可以在普通实验室中进行，但在辨别获能型精子上有其局限性，表现为“B”型的精子可能包括了已经获能而未发生顶体反应的精子。近年来有学者采用考马斯亮蓝R250来检测小鼠精子AR，江一平等人已将此法移用于人精子AR的检测上，并推广到多种哺乳动物精子AR的检测中。Larson采用考马斯亮蓝G250来检测包括人、牛、猪、兔和小鼠等精子的AR，二者都采用经典的荧光亲合技术PSA法证明其可靠性。5实验步骤5.1精子获能1) 冷冻精子的复苏：恒温水浴锅温度调至37，等水温恒定后将冷冻精液管放入其中15分钟。取精液1 ml加培养液3 ml混匀置于倒置显微镜下观察精子的形态特征和运动状况，同时涂片考马斯亮蓝染色镜检，观察获能前精子的染色特征。2) 获能精子的制备：取精液1 ml加培养液3 ml混匀,500 r/min离心5 min,弃上清液,同法再洗涤1次,加培养液1 ml后置37水浴，培养管倾斜20°,45 min后垂直取上清液约2 ml置倒置显微镜下检查精子运动情况。3) 获能精子的涂片染色观察：用移液管取少量稀释液置于载玻片上，然后推开稀释液，风干以后将涂片浸染于考马斯亮蓝染色液中5min,然后用流水冲干净，在显微镜下观察精子的染色情况。记录精子获能情况，并计算精子获能率。6观察结果：描述精子的形态特征，运动状况，绘制精子考马斯亮蓝涂片染色示意图！描述获能精子与未获能精子在考马斯亮蓝染色上的不同，计算精子获能情况。5.2黄体酮对牛精子获能的影响1）牛精子的复苏与洗涤取牛冻精，混匀，1500R/MIN离心5分钟，去上清液。精子沉淀分别加于3支各盛3ml洗液的试管底部，C02培养箱(37，5%c02)放置，收集上层含高活力精子的悬浮液，离心，去上清液，沉淀加5ml洗液洗涤1次。2）精子获能用肝素刺激精样获能，调整精子数为2x106个/ml，置于38水浴中，处理30分钟。将精液分别加入含不同浓度(0、1、5、10mol/L)孕酮的BO工作液中，然后放入恒温培养箱中孵育,于240-360 min取出少量进行染色检验。3）染色鉴定：按照考马斯亮蓝染色的方法进行精子的获能鉴定，按照下表记录实验数据。孕酮对精子获能的影响孕酮浓度0mol/L1mol/L5mol/L10mol/L视野123123123123总精子数获能精子数获能率平均获能率结果：计算精子获能率，比较不同孕酮添加浓度对精子获能的影响。作业：书写实验报告查阅相关资料，阐述孕酮影响精子获能的影响机理附：蛙胚发育的整个过程蛙胚从受精到成蛙需要经历大的两个发育时期，即早期发育和胚后发育1. 蛙胚的早期发育：蛙胚早期发育是从受精到腮盖闭合的整个发育时期，共经历下表中所列25个发育阶段，历时2-3天。发育时期发育阶段由受精起所需的时间（小时）1受精卵022-细胞2.0 ± 0.0234-细胞2.7 ± 0.0948-细胞3.3 ± 0.08516-细胞4.0 ± 0.4632-细胞4.6 ± 0.37囊胚中期 8.48囊胚晚期 12.49原肠胚早期 15.9 ± 0.310原肠胚中期 19.9 ± 0.411原肠胚晚期，卵黄栓 21.7 ± 0.012神经板期 32.4 ± 1.313神经褶期 39.1 ± 1.314胚胎的转动 41.9 ± 1.115神经管期 45.3 ± 0.8216尾芽期 49.9 ± 1.917肌肉感应 60.2 ± 1.218孵化 70.4 ± 3.019心跳 79.8 ± 4.720鳃血循环 97.2 ± 6.921开口期129.9 ± 2.722尾血循环153.9 ± 4.923鳃盖期160.4 ± 3.724鳃盖右端合缝195.5 ± 2.325鳃盖封闭202.3 ± 5.9从下列示意图可以清晰描述这个时期胚胎早期发育情况：2.蛙胚后期发育26）期半圆形肢芽期自后肢芽隆起呈半圆形起至后肢芽开始呈圆盾形止。侧面观,后肢芽已呈边缘清晰的半圆形,游离端平缓,长度(L)接近基部宽度(D)的一半(L1/2D);出水孔位于身体左侧中部,开口不规则,仍有鳃盖愈合时的痕迹。背面观,身体呈椭圆形;眼小,位于背面体前部,不凸出于周围皮肤,晶状体很小;外鼻孔位于眼与吻端之间,开口朝向斜前方;尾鳍发达,前端始于尾基部。腹面观,口位于腹面体前端,唇齿刚刚形成,较细小,上唇两排,下唇3排(1-1/1-1);唇乳突比较发达,仅上唇中部没有;腹部半透明,可见内部盘曲的肠;肛管较粗,开口于尾鳍右侧。27）期圆盾形肢芽期自后肢芽隆起呈圆盾形起至后肢芽开始呈圆锤状止。侧面观,后肢芽呈圆盾状,长度大于基部宽度的一半(L>1/2D);出水孔形成出水管,开口朝向后方,稍向上倾斜。背面观,头部增大,宽度大于躯干宽度;眼轮廓较前一期更清晰一些;尾肌与鳍更加发达,尾上鳍向上凸,尾在中央处最高,尾末端呈圆弧状,尾肌末端很尖锐。腹面观,唇齿式仍为1-1/1-1,角质齿与腭鞘上的细齿都在逐渐增长,且颜色加深;唇乳突增长,更为透明;吸盘处只剩下一些密布的小黑点;肠盘曲圈数增多,肛管更加透明。28）期圆锤形肢芽期自后肢芽隆起呈圆锤状起至后肢芽伸长呈侧指状止。侧面观,后肢芽呈圆锤状,游离端增宽,基部也增长,长度大于或等于基部宽度(LD)。背面观,头部近似三角形,吻端钝圆,腹部近似长方形,整个身体呈子弹形,全身都为黑色,尾鳍半透明;鼻、眼未凸出于周围皮肤,晶状体直径约为眼径的1/6。腹面观,唇齿及唇乳突进一步发育,有些副乳突顶端呈黑色,上唇最里面的一排和下唇最外面的一排唇齿已经出现,唇齿式(2-2/1-1或3-3/1-1)形成;吸盘完全消失;随着肠的发育,肛管也变得更粗。29）期侧指状肢芽期自后肢芽呈侧指状起至后肢芽的长度大于或等于基部宽度的1·5倍止(L1·5D)。侧面观,后肢芽伸长,呈侧指状,后半部稍向下弯,末端较细,边缘圆滑,色素较少。背面观,整个身体呈子弹形,在透明的皮肤下,身体中部两侧向内凹陷,将身体分为前后两部分。后半部黑色,前半部颜色稍浅于后半部;鼻、眼形状与前一期相同;出水管很明显,呈前宽后窄的漏斗形,开口处为圆管状。腹面观,前半部较透明,可看清心脏及内鳃等结构。后半部皮肤增厚,将肠管包围,形成腹腔,腹中线形成;唇齿继续伸长,颜色继续变深;尾肌逐渐发育,可看清肌节之间的分界线;尾基部可见刚开始出现的淋巴心,边缘不清晰,个数不确定。30）期膝关节肢芽期自膝关节出现起至后肢芽开始变成匙状止。侧面观,后肢逐渐伸长,长度约为基部宽度的2倍(L=2D),并向下稍微弯曲,在中部的腹面出现折痕状的凹陷,形成膝关节,后肢末端圆滑,未形成板,股部较粗壮。背面观,体色较前一期浅一点,在透明的薄膜下,鼻孔明显凸出于周围皮肤。腹面观,上唇已经接近吻端,唇齿及乳突进一步发育;腹部较前一期平坦,腹中线很明显。31）期匙状肢芽期自后肢芽呈匙状起至第4趾开始出现止。侧面观,后肢背面色素增多,膝关节处很明显,后肢末端宽于胫部,略向上抬起,边缘部分较薄,呈楔状,血管较多,略微呈红色,还不能看出分趾情况。背面观,身体逐渐伸长,体色较前一期又浅一点,可以清楚的看出鼻和眼的轮廓;背中部稍向上凸起,隐约可见脊柱的雏形。腹面观,唇齿及乳突已经发育完全;腹中线非常明显;尾基部中线处的淋巴心呈微小的圆点状突起,周围分布一些小黑点,淋巴心的个数和形状个体差异很大,一般尾两侧不成对,各为1至3个。32）期第4趾出现期自第4趾出现起至第5趾开始出现止。侧面观,板末端继续伸长,形成第4趾,第4趾与第3趾连接处有细微凹陷的弧形连接,黑色素很少,各趾还未成形。背面观,体型明显大于前一期,身体后半部宽度逐渐小于前半部,尾基部尾肌很粗壮;眼增大,眼眶上缘皮肤隆起,下缘凹陷。腹面观,已经看不清肠的盘曲情况,肛管更加发达,后肢紧贴肛管两侧。33）期第5趾出现期自第5趾出现起至第3趾开始出现止。在第4、第5趾趾端之间出现的凹陷加深,第5趾隆起,边缘黑色素增多,第4、第3趾趾端之间出现细微凹陷。背面观,尾更加发达,体色较前一期又浅一点,尾肌颜色比体色还浅;背中部向上凸起明显,脊柱的形状清晰可见。后肢的背面密布小黑点,颜色逐渐加深。34）期第3趾出现期自第3趾出现起至第1、2趾开始出现止。在板的边缘,第2、第3趾，趾端出现较小的凹陷,第4趾最长,与第5趾之间的凹陷最大(已开始分离),第1、第2趾还未成形。背面观,身体后半部已经明显窄于前半部,整个身体呈流线型;尾下鳍开始变窄。腹面观,肛管较前一期又长一些,后肢末端未超过肛管开口处。侧面观,透过皮肤隐约可见未成形的前肢位于体侧鳃后,很短,第3指末端已经伸到出水管基部,有的个体右侧前肢还未发育。35）期第1、2趾出现期自第1、2趾出现起至第3趾分离止。第1、第2趾趾端之间出现凹陷,第1趾未完全成形,第4趾最长,与第3趾趾端之间凹陷增大,开始分离。股部与胫部可以分清。后肢背面密布深色条纹。背面观,背部的脊柱形状非常清晰,且宽于前一期。腹面观,腹腔壁进一步增厚,腹中线很明显。36）期第3趾分离期自第3趾分离起至第1、2趾开始分离止。第3趾与第4趾已经完全分离,与第2趾之间出现明显的凹陷,通过表面的黑色素可看出分离,但其间有蹼相连,第1、第2趾连在一起,但可以看清两趾的形状;第4趾最长。腹面观,上唇接近吻端,唇齿仍然很发达;后肢紧贴于肛管两侧,后肢末端超过肛管开口处。侧面观,前肢4指并在一起,未完全发育,位于体侧出水管基部皮肤内。左侧前肢发育先于右侧前肢。出水管很发达。37）期第1、2趾分离期自第1、2趾开始分离起至内突出现止。后肢5趾继续伸长,趾末端开始朝向尾部稍稍弯曲。第3趾与第1、第2趾间距增大,第1趾完全成形,通过表面的黑色素可明显看出与第2趾形成分离,但有未完全发育的蹼相连。第4趾与第5、第3趾间的蹼非常明显。背面观,可以看到尾两侧的后肢,股部已经比较粗壮;出水管长于前一期。腹面观,上唇靠近吻端,有些个体的唇齿颜色已经开始变淡。侧面观,前肢进一步伸长,第3指末端已到达腹面。尾基部中线处的淋巴心非常清晰,但具体个数和位置因个体而异,一般为左右各2到3个。38）期内突出现期自内突出现起至关节下瘤开始出现止。在靠近第1趾基部的掌内侧边缘,内突开始隆起。股部很粗壮,胫部与跗部都未伸长,各趾逐渐伸长。背面观,眼径逐渐增大,眼球上缘皮肤继续隆起,逐渐形成上眼睑,眼球下缘内陷,眼由朝向斜上方逐渐变为朝向两侧。腹面观,口上唇已经移至吻端,角质齿、腭鞘与唇乳突开始退化,唇齿逐渐缩短、脱落、颜色变浅,同时,唇乳突开始慢慢缩小,口角上部的副乳突首先消失;腹中线明显。侧面观,有些个体的前肢第3指已经伸至腹面,并且出水管开始收缩。39）期关节下瘤出现期自关节下瘤开始出现起至肛管消失止。后肢明显增长,胫部、跗部和趾明显长于前一期, 5趾趾端向掌心方向弯曲,趾关节腹面开始出现瘤状突起,一般是第4趾首先出现。背面观,身体后半部缩小,体型开始由蝌蚪形状向蛙形状演变;吻鼻间距缩短;眼明显大于前一期,而且凸出于周围皮肤,晶状体直径约占眼径的1/3;尾仍很发达。腹面观,口已基本移至体前端,但仍在腹面,下唇向上唇收拢;角质齿和唇乳突继续退化,唇齿不断脱落、颜色变浅,一般是上唇的齿先消失;腹中线明显,有的肛管已开始萎缩。侧面观,前肢的上臂支在出水管基部位置上,前肢4指撑在腹面的皮肤之内;出水管已经收缩变短,并紧贴于体外壁。40）期肛管消失期自肛管消失起至前肢开始伸出止。肛管已经萎缩消失,仅肛门处还有些痕迹。背面观,眼几乎朝向两侧了,上眼睑边缘达到晶状体处;后肢进一步发育,跗部贴在尾的两侧,各趾显著增长并向内弯曲。腹面观,上下唇逐渐向一起闭合,萎缩的唇乳突向口弯曲,仍有部分角质齿没有脱落;前肢4指已经完全发育,指端呈圆形,掌部撑在腹面皮肤内。41）期前肢伸出期自前肢伸出起至肩关节开始露出止。前肢大部分已经伸出,左右先后顺序不定。背面观,头部呈三角形,但吻端为圆弧形,吻鼻间距进一步缩短;有的个体尾仍很发达,远长于后肢长度,有的已经开始萎缩,尾鳍先逐渐消失,尾末端向一侧弯曲。腹面观,出肢孔处向内凹陷,腹壁增厚,腹中线明显,腹股沟愈合为一窄线;口朝向前下方或前方,由蝌蚪型口器向蛙型转变,角质齿及腭鞘全部消失,只余口角或者下唇与口角的部分乳突。出水管消失。42）期肩关节露出期自肩关节露出起至肩基部开始愈合止。前肢已全部伸出体外,肩关节基部凹陷,与四周皮肤有明显的断裂痕迹。背面观,头部呈三角形,出肢孔处的凹陷形成头部与躯干部的界线;鼻孔基部隆起,接近蛙的吻鼻部形状;眼凸出,朝向两侧,稍向前上方倾斜;晶状体直径约为眼径的1/3,上眼睑已经成形;尾已经短于后肢长度,末端稍向下弯曲,只残余很少的尾上鳍;背部与四肢的背面有深色的斑纹。腹面观,口位于前端,逐渐呈蛙形,下唇及口角仍有部分唇乳突,上颌长于下颌,口裂逐渐增大;前肢基部凹陷,腹部半透明,可见内脏。43）期肩基部愈合期自肩基部与周围皮肤开始愈合起至蝌蚪变为幼蛙止。肩基部后缘与周围的皮肤先愈合,肩基部前缘后愈合。背面观,蝌蚪已呈蛙形,头部呈三角形,与躯干部无明显界线;鼻孔与吻端距离小于鼻孔与眼的距离,眼球突出明显,晶状体变大,直径约为眼径的1/2;尾只余极短的一段黑色凸起,末端下弯;背部与四肢的背面都有深色的斑纹。腹面观,口位于体前端,上颌长于下颌,口裂进一步增大,后缘达眼前缘;前肢基部凹陷,腹部半透明,可见内脏。44）期变态完成期蝌蚪完全变为幼蛙形状。尾完全消失,口裂后缘达眼后,鼓膜清晰,后肢强壮,可以跳跃和攀爬。15