苏州大学微生物制药复习纲要.doc

苏大08生物制药 微生物制药复习纲要感谢李倩，马一丹，蔡婷同学的合作整理，有不足的请大家修正。第二章：微生物药物产生菌和菌种改良1、自发突变的原因:菌种连续传代，这种自发突变比保藏过程中产生的比例高，因为在生命活动中遗传物质更容易受环境因素的影响。活细胞内进行的新陈代谢活动，能产生具有诱变作用的物质，如过氧化氢、有机过氧化物等，当它们在细胞内积累到一定浓度时能诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因也能诱发基因突变.有的微生物染色体上还存在导致菌体退化的死亡基因，DNA的代谢失调也会引起基因突变而造成菌种退化。2、自然选育：是一种纯种选育方法.它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有生产水平的菌株。因此，它能达到纯化、复壮菌种，稳定生产的目的，生产上又将该方法称为自然分离。3、单孢子悬浮液的制备：用无菌生理盐水或缓冲液制备单孢子悬浮液，在显微镜下计数，也可稀释后在平板上进行活菌计数。4、诱变育种：通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，这种方法就称为诱变育种。5、诱变育种的特点：优点：速度快、收效大，方法简便，是当前菌种选育的主要方法，生产中使用十分普遍。缺点：诱发突变缺乏定向性，因此诱发突变必须与大规模的筛选工作配合才有好的效果。6、DNA损伤的修复：不利于突变发生光复活作用切补修复DNA多聚酶的校正作用 利于突变发生SOS修复系统重组修复。6-1光复活作用：DNA被紫外线照射后形成胸腺嘧啶二聚体，黑暗中酶与二聚体结合，形成的复合物在可见光照射下，酶可以解离二聚体，DNA复原。6-2切补修复：在4种酶的协同作用下进行DNA损伤的修复，4种酶都不需要可见光的激活：在胸腺嘧啶二聚体的5端，核酸内切酶作用下造成单链断裂；其次在核酸外切酶作用下切除胸腺嘧啶二聚体；然后在DNA多聚酶、的作用下进行修补合成，最后在DNA连接酶的作用下形成一个完整的双链结构。6-3 DNA多聚酶的校正作用：细胞对于复制过程中的差错也具有校正功能。大肠杆菌中的三种DNA多聚酶（多聚酶、）也具有3到5外切酶的作用，能在复制过程中随时切除错配的核苷酸。6-4 SOS修复系统：一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受诱变损伤而阻断DNA复制时，DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，进行DNA修复。修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复合成，并将合成的DNA片段插入受损DNA的空隙处。SOS修复系统容易导致基因突变，大多数经诱变所获得的突变来源于此修复系统的作用。6-5重组修复：重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，又称为复制后修复。重组修复是在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下进行修复作用。以带有二聚体的单链为模板合成互补单链，但在每一个二聚体附近留下一个空隙，通过染色体交换，空隙部位不再面对二聚体，而是面对正常单链，此时DNA多聚酶和连接酶能把空隙部分修复好。7、前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。例如紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体就是一种前突变。8、突变：前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变。也可以经过修复重新回到原有的结构而不发生突变。9表型延迟的原因：分离性迟延：分离性迟延是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态（野生型基因和突变型基因并存在同一细胞中），突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需要经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态（一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因）时，其性状才得以表达。生理性迟延：突变基因由杂合状态变为纯合状态时,还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因产物稀释到某一程度后才能表现出来。而这些原有基因产物浓度降低到能改变表型的临界水平以前，细胞已经分裂多次，经过了好几个世代。10反馈抑制（feedback inhibition）：是指代谢途径的终产物对催化该途径中的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制，其实质是终产物结合到酶的变构部位，从而干扰酶和它底物的结合，当然与此相反为酶活性的激活。11反馈阻遏（feedback repression）：是指终产物（或终产物的结构类似物）阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成，其实质是调节基因的作用，这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施，当然与此相反有酶合成的诱导。12筛选终产物营养缺陷型例1筛选终产物营养缺陷型例1ABCDEabcd例1 在简单的代谢途径中累积代谢产物在一原始菌株中，其终点产物E反馈抑制第一个酶，并反馈阻遏第一个和第二个酶。获得了缺少第三个酶的突变株，需要供给E才生长。如果供给限量的E，就可打破反馈调节，产生大量的C需要的发酵产物13渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不完全丧失，这种缺陷型能够少量地合成某一代谢物，能在基本培养基上少量生长。渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间产物的积累。多数抗生素高产菌株生长速度低于野生菌株，似乎在某种意义上是渗漏缺陷型。生长速率低有利于抗生素的合成。筛选终产物营养缺陷型例2ABCKJMLNj1j2例2 在一分支途径中，中间产物的大量积累在原始菌株中，终点产物L反馈抑制a酶和j1酶，并反馈阻遏a酶，终点产物N反馈抑制和阻遏a酶和j2酶。L和N对a酶有累加反馈效应。已获得一个缺少j1酶的突变株，它生长需要L。如以限制生长的浓度供给L时，可打破L的反馈调节，导致J的大量积累。此图代表产氨杆菌的一个腺嘌呤缺陷型的肌苷酸的大量生成a天门冬氨酸异亮氨酸14筛选终产物营养缺陷型例3天门冬氨酰磷酸天门冬氨酸半醛赖氨酸高丝氨酸苏氨酸蛋氨酸天门冬氨酸激酶双氢吡啶二羧酸合成酶高丝氨酸脱氢酶赖氨酸的大量合成在谷氨酸棒杆菌的原始菌株中，赖氨酸和苏氨酸合作反馈抑制天门冬氨酸激酶，获得一个缺少高丝氨酸脱氢酶的突变株。它的生长需要苏氨酸和蛋氨酸。如果苏氨酸以限制生长的浓度加入时，合作反馈抑制被打破而大量产生赖氨酸。15细胞膜透性改变的突变株原理：细胞膜透性改变，大量初级代谢产物被分泌到细胞外，细胞内浓度降低，避免终产物反馈调节。例如谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型进行谷氨酸发酵，生物素是合成脂肪酸必须的，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，使细胞膜的透性发生变化，利于谷氨酸分泌至体外的发酵液中。油酸缺陷型或甘油缺陷型在生物素过量的条件下谷氨酸也在体外大量积累。16筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株由于结构类似物没有正常生理功能,细胞缺乏该代谢物,生长受抑制甚至死亡生存下来的菌株即为抗反馈调节突变株结构类似物产生反馈调节,阻碍该代谢物生成在培养基中加入大量与代谢产物结构类似的化合物17次级代谢：某些微生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。18次级代谢的特点：1、次级代谢物不是菌生长、繁殖必需的； 2、次级代谢又受到初级代谢的调节，它们有一些共同的中间产物，这些中间产物可以合成初级代谢物也可以合成次级代谢物，取决于菌的遗传特性和生理状态。（微生物的代谢系统倾向于平衡利用营养物质，可将过剩的营养物质转变为与生长繁殖无关的次级代谢物）。19筛选渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不完全丧失，这种缺陷型能够少量地合成某一代谢物，能在基本培养基上少量生长。渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间产物的积累。多数抗生素高产菌株生长速度低于野生菌株，似乎在某种意义上是渗漏缺陷型。生长速率低有利于抗生素的合成。方法：把营养缺陷型接种在基本培养基上，长出的菌落是回复突变株，长得特别小的菌落是渗漏缺陷型。20、碳源的抑制作用：能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶（包括抗生素合成酶和其他的酶）有阻遏或抑制作用，限制抗生素的发酵产量，不利于发酵工艺的控制。因此筛选去除碳源分解代谢调节突变株对于提高抗生素产量很有意义。21杂交育种的目的：通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷通过杂交可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展22异核现象：营养缺陷型的放线菌，经菌丝间的接触核融合形成异核体，其基因型分别与亲本之一相同，但形成的菌落在表型上是原养型的(即相应的野生型)。 异核体定义:同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核23 接合现象：形成异核体后，相同细胞质里不同基因型的细胞核在双方增殖中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。第三章：微生物产生菌的保藏1菌种保藏的目的：存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。没有优良的菌种，就没有先进的微生物学。一个国家对菌种的收集、保藏和供应，反应了这个国家的水平。2菌种保藏的原理:选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等），使微生物暂时保持休眠状态，保持其优良的生产性能，尽可能减低其变异率。3.移植培养（传代培养）保藏法:一种基本的简易保存方法，实验室或工厂中必不可少的一种经典方法，适于所有微生物，关键是根据微生物的特点选择最适宜的培养基。4.液体石蜡保藏法5.砂土保藏法6.冷冻干燥保藏法(真空冷冻):简介：冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使细菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。7保护剂的选择及制备：保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免于死亡或损伤，并减少在保藏过程中的死亡，还能防止复水时引起的死亡，并使菌体容易从休眠状态恢复为生长发育状态。保护剂是保护性溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型，如保护剂可替代结合水而稳定细胞的构型，减少对细胞透性的破坏。选择对细胞和水有很强亲和力的保护剂，可防止因深冻和水分不断升华对细胞的损伤。对某些微生物，加保护剂反而有害，应特别注意。8冷冻干燥过程中的影响因素：1)菌的质量 2)保护剂 3)干燥速度 4)空气的影响 (5)温度的影响 (6)含水量的影响 (7)复苏培养 9冰冻损伤的机理：细胞内降温速度太快易形成冰晶，不适当的复温易重结晶。溶质损伤冷冻使电解质和溶质的浓度逐步提高，对细胞膜造成压力而损伤细胞。冷冻也可使所有结构失去结构水而致死。细胞冷冻损伤主要是细胞脱水和细胞内结冰两个物理现象的平衡。当细胞外结冰时，细胞不断脱水，造成脱水细胞内电解质浓度提高，使渗透压发生变化，引起质壁分离，严重时膜的脂肪内脂质变性破坏细胞膜，致使细胞死亡。保护剂甘油、DMSO等可以吸住水分子，保护细胞膜不致大量脱水，可改善冷冻损伤程度。慢速解冻易重结晶，快速解冻能减少冷冻损伤。10菌种退化的定义：菌种经过多次传代或长期保藏后，由于自然突变或异核体和多倍体的分离，使有些细胞的遗传性状发生改变，造成菌种不纯，严重者使生产能力下降，称为菌种退化。退化是在多次接种传代中逐渐发展的过程。11菌种退化的原因：1、自发突变与回复突变2、链霉菌遗传不稳定性：发生大幅度的DNA重建（扩增、缺失、转位）3、细胞本身自我调节和修复：有些DNA修复途径易发生突变4、环境条件的影响：温度、湿度、pH、通气条件等12复壮定义：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种第四章 微生物药物的生物合成1 初级代谢：能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具有生理活性作用的物质,或是为机体生长提供能量的一类代谢。次级代谢：指存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并在一定生长期内出现的一类代谢类型。其代谢产物在抵抗恶劣环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物，寻找配偶以及在传递信息时都显得非常重要。2 初级代谢与次级代谢的区别？ 存在范围及产物类型不同。不同的微生物可产生不同的初级代谢产物。 对产生着自身的重要性不同。初级代谢产物是机体必不可少的，次级代谢重要性低。 同微生物生长过程中的关系明显不同。初级代谢贯穿微生物生长全程，而次级代谢则是在一定时期内。 对环境条件的敏感性或遗传稳定上明显不同。初级代谢敏感性小，遗传稳定性大，次级代谢相反。 某些机体内存在的两种既有联系又有区别的代谢类型。3 微生物初级代谢与次级代谢的关系？次级代谢产物的合成途径并不是独立存在的,而是与初级代谢产物合成途径间存在紧密联系，基本上都是以初级代谢产物为母体衍生而来，催化特殊次级代谢产物合成反应的酶可以从那些初级代谢途径的酶演化而来。初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，比如糖降解过程中的乙酰-CoA是合成四环素、红霉素的前体，乙酰-CoA 合成脂肪酸是初级代谢产物途径，经过重复缩合、环化或闭环等反应生成抗生素是次级代谢途径。4生源（biogen）：次级代谢产物中的构建单位。主要包括聚酮体、糖类、不常见氨基酸、非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱、吩恶嗪酮、莽草酸、甲羟戊酸。5碳代谢物对次级代谢生物合成的调节？一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用（葡萄糖效应），这是由于速效碳源（如葡萄糖、柠檬酸等）的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。6 氮源抑制次级代谢产物的机制？谷胺酸合成酶（GS）活力受铵根离子浓度调控，铵根离子浓度越高，GS活力越低，抗生素的合成能力也越低。 但硝酸盐能促进利福霉素的合成，原因：1、硝酸盐可促进糖代谢和TCA循环中的酶活力以及琥珀酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的酶活力；2、硝酸盐抑制丙氨酸脱氢酶(ADH)活力，从而抑制脂肪酸合成，使脂肪酸合成前体乙酰CoA转化为利福霉素脂肪环的前体；3、硝酸盐促进GS的活力，增加利福霉素前体浓度。7 磷酸盐对次级代谢生物合成的调节作用机制？ 促进初级代谢，抑制次级代谢：通过次级初级代谢中的很多酶来促进初级代谢，提供大量初级代谢中间产物满足微生物快速生长需要，通过竞争初级代谢与次级代谢共同的中间体来抑制次级代谢； 抑制次级代谢产物前体的形成：通过抑制参与次级代谢产物前体合成的酶的活性，抑制次级代谢产物前体的形成，影响次级代谢途径。如链霉素的前体肌醇由6-磷酸-葡萄糖环化酶催化形成，磷酸盐能增加对环化酶有竞争性抑制作用的焦磷酸的合成，使肌醇合成受抑制而影响链霉素合成。 阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成：如泰乐菌素结构中氨基糖合成中的一些关键酶，如脱水酶、氧化还原酶和转甲基酶都受到磷酸盐的阻遏。 抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性：链霉素合成的最后一个中间体是链霉素磷酸酯，必须经碱性磷酸酯酶的作用脱去磷酸根才能生成链霉素，过量的磷酸盐抑制了该酶的活性，使该反应不能顺利进行，导致无活性的链霉素磷酸酯的积累，抑制了具有抗菌活性的链霉素的合成。 增加菌体能荷状态，促进新陈代谢：高产的次级代谢产物产生菌体内的ATP浓度比低产菌株低，细胞内ATP水平手培养基中磷酸盐浓度调控，培养基中加入过量磷酸盐可大大提高ATP浓度，降低次级代谢产物的合成。如合成杀假丝菌素的灰色链霉菌培养液中添加磷酸盐，产生菌对氧的需要量增加，细胞内ATP浓度增大，抗生素合成停止。8 ATP对次级代谢生物合成的调节？ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。以磷酸烯醇式丙酮酸合成四环素为例，ATP抑制了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，在第一步抑制了四环素的合成。9 酶的诱导对次级代谢产物生物合成的调节？诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。 同时诱导：诱导物加入后，微生物能同时诱导出几种酶的合成，主要存 在于短的代谢途径中。 顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂代谢途径的分段调节。操纵子（operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作子和启动子。10 细胞膜通透性对次级代谢产物生物合成的调节？细胞膜的通透性影响了物质的运输,进而影响次级代谢产物的合成和分泌。 以青霉素高产菌株为例，细胞膜通透性增大一方面使青霉素不断分泌到 细胞外，产量增加 ；另一方面，硫酸盐更容易通过细胞膜进入，胞内硫酸盐浓度增加，青霉素前体Cys合成增加 ，青霉素合成增加 。11 微生物药物生物合成常用的研究方法？ 喂养实验法。加入可能前体物质观察该物质在发酵过程中的利用情况与促进目的 产物生成的效果 。缺点：难以判断该物质是前体还是刺激该反应。 洗涤菌丝悬浮法。洗涤静息菌丝体悬浮于生理盐水一段时间，耗尽内源营养将菌丝悬浮于人工培养系统内观察被试验的化合物对菌体代谢和对产物生物合成的影响。 阻断突变株。诱变获得阻断突变株积累中间代谢产物分离、提纯、鉴别中间代谢产物，与目的代谢产物结构进行比较推断目的代谢产物生物合成的反应步骤，再分离相应的酶，判断反应特性 互补共合成法。混合培养可获得目的产物阻断突变株1、阻断突变株2分析积累中间体了解阻断部位和顺序及反应过程推断目的产物的生物合成途径 同位素标记法。将同位素标记可疑前体物质加到培养基中培养后分离目的代谢产物测定终产物中同位素含量和分布情况判断可疑前体物质是否参与代谢产物的合成 无细胞抽提液法。裂解细胞，提纯酶考察酶促反应的底物和产物判断该酶是否能催化目的产物的生物合成 酶抑制剂法。加入酶抑制剂，阻断该反应步骤分离、鉴定积累的中间代谢产物及相应产物推测生物合成过程第五章 生物药物的发酵工艺学1发酵:生理学上指微生物无氧呼吸和有氧呼吸以外的一种生物氧化作用。在工业生产中，发酵是利用微生物机能获得工业产品的泛称。目前抗生素、维生素、激素和基因工程产品几乎都是通过微生物发酵而来。2.次级代谢产物发酵特点： （1）、所有微生物都以“纯种”状态在通气搅拌的发酵罐中发酵，培养基和设备都必须事先灭菌，发酵过程注意避免染菌。（2）、发酵过程分为生长期和生产期两个阶段，先菌体生长，在生产次级代谢产物。（3）、发酵产物积累和基质消耗之间没有必然的化学计量关系，理论产量和实际产量相距甚远。（4）、发酵产物非常复杂。可产生几个甚至几十个结构类似的副产物，需要对产物分离精制。(5)、微量的金属离子和磷酸盐等无机离子对次级代谢产物的形成有显著影响。(6)、发酵过程难以控制，即使同一菌种，同一厂家，也会因生产设备、原料来源等差别，使菌种的生产能力大不相同。3.微生物发酵三种操作方式： （1）、分批发酵：在一个密闭系统内一次性投入有限数量的营养物。发酵过程非恒态，微生物所处环境不断变化，微生物生长速度随时间发生规律性变化，整个过程分为延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。快速生长阶段的产物为初级代谢产物，生长缓慢的稳定期产物多为次级代谢产物。（2）、补料分批发酵：在分批发酵过程中，间歇地补加有限制性营养物，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种方式。（3）、连续发酵：在一个开放的系统内，以一定的速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和代谢产物的培养液以相同的速度从发酵罐内放出，从而使发酵罐内液量维持恒定，使培养物在近似恒定的状态下生长及代谢。4分批发酵的四个阶段：(1)延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。延迟期的长短与菌种、种龄、接种量和培养基成分有关。(2)对数生长期：对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。(3)稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数最高；这一时期也是发酵过程积累次级代谢产物的重要阶段。(4)衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。5补料分批发酵与分批发酵相比的优点：（1） 可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。当代谢产物收率或其生产速率明显地受某种底物组分浓度影响（如用醋酸、甲醇、苯酚等作为发酵基组分而存在底物浓度的抑制）时，采用补料分批技术比分批发 酵有利；（2） 可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；（3）菌种的变异及杂菌污染问题易控制；（4）便于自动化控制 *底物抑制作用：简单酶催化反应动力学有一个显著的特点,即反应速率与底物浓度的关系是一种简单增加的函数关系.而实际上有些酶的催化反应,由于底物浓度过高,其反应速率反而会下降,这种效应称为底物抑制作用. 6连续发酵的优缺点： 优点： 与补料发酵比可维持低基质浓度；提高设备利用率和单位时间产量，节省发酵灌的非生产时间；发酵灌内微生物、基质、产物和溶解氧浓度等各种参数维持一定水平，便于自动化控制；微生物在近似恒定状态下进行生理代谢，发酵产物质量稳定。缺点： 长时间培养中菌种容易发生变异，有可能产生负变株；容易污染杂菌，难以保证纯种培养；对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高 ；营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低 7微生物药物发酵生产的一般流程：冷冻管斜面孢子摇瓶菌丝一级种子罐二级种子罐发酵罐过滤机滤液贮罐分离提纯得到成品8培养基：培养基指按 人工一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物的营养物质。培养基的组成配比是否恰当对微生物的生长、产物的合成、工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大影响。9生长因子：指某些微生物不能从普通碳源、氮源合成，而需要另外添加来满足生长需要的有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸和其他膜成分。绝大多数微生物不需要生长因子，营养缺陷型菌株则必须添加某种生长因子。10前体物质：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。11促进剂：定义：并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。作用原理：改变细胞的渗透性，或“启动”微生物体内的生产部位，否则这些部位是被阻遏的，因此促进剂的添加可以大大提高产量。12抑制剂：作用原理：通过抑制某些合成其它产物的途径而使所需产物的合成得到加强。13培养基的类型：分类依据类型营养物质来源天然、合成、半合成培养基物理状态液体、固体、半液体培养基的成分和目的基本、完全、鉴别、选择生产工艺的要求孢子(Spore)、种子、发酵14孢子(Spore)培养基的要求：（1）、固体；（2）、营养不太丰富（尤其是氮源，否则不易产生孢子）；（3）、适当的无机盐浓度（否则影响孢子量和颜色）；（4）、适当的PH和温度；（5）、分天然和半合成两种类型。天然的包括麸皮培养基和大小米培养基，半合成的有葡萄糖（或淀粉）、无机盐和蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基。15.种子培养基的要求：（1）液体；（2）常用速效C、N源，便于菌体生长繁殖；（3）PH稳定；16发酵培养基：定义：供菌体生长、繁殖和合成产物的培养基。要求：培养基组成除含菌体生长必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。17湿热灭菌原理：过蒸汽具有强大穿透力，冷凝时能释放出大量潜热，使微生物细胞中的原生质胶体和酶蛋白变性凝固、核酸分子内氢键破坏，酶失去活性，导致微生物因代谢障碍在很短时间内死亡。18热阻：指微生物在某一特定条件的致死时间，相对热阻指相同条件下两种微生物热阻的比值。19种子应备的条件：（1）细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；（2）状态稳定；（3）总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）菌污染，保持纯种发酵；（5）稳定的生产能力。20.接种龄：指种子的培养时间,接种龄指种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以对数生长期的菌丝最为合适。 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。较大的接种量可以缩短发酵时间。但接种量不能过大，否则培养液黏度太大，溶解氧不足，产物合成受影响。21发酵热：将发酵过程中释放出来的引起温度变化的净热量称为发酵热。发酵热包括了生物热、搅拌热、蒸发热以及辐射热等。 生物热：微生物细胞在生长繁殖过程中本身产生的大量热成为生物热。搅拌热：通气式发酵罐，由于机械搅拌带动培养液作相应的比较剧烈的运动，造成液体之间、液体与搅拌器等设备之间的摩擦，会产生比较可观的热量。 蒸发热：在通气培养过程中，空气进入发酵罐后就与发酵液进行广泛的接触，除部分氧等被微生物利用外，大部分气体仍旧从发酵液出来，排放至大气中，必然会引起热量的散发，热量将被空气或蒸发的水分带走，这些热量就称为蒸发热。 辐射热：辐射热是指因发酵罐温度与环境温度不同，而使发酵液通过罐体向外辐射的热量。 通气热：通入空气温度高于液体温度时所产生的热量。通气热大小，取决于通入的空气和发酵液的温度差和通气量。22PH对发酵的影响（1）影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；（2）影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；（3）影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；（4）pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。23基质对发酵的影响及控制。质即培养微生物的营养物质。（1）碳源对发酵的影响及控制迅速利用的碳源：葡萄糖、蔗糖等。迅速参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。缓慢利用的碳源：多数为聚合物、淀粉等。为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期，也有许多微生物药物的发酵所采用。在工业上，发酵培养基中常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源。（2）氮源对发酵的影响及控制迅速利用的氮源：氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）、玉米浆容易被菌体利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。缓慢利用的氮源延长代谢产物的分泌期、提高产物的产量；但一次投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，缩短产物的分泌期。发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合氮源，还要在发酵过程中补加氮源来控制浓度。补加有机氮源，如酵母汁、玉米浆、尿素；补加无机氮源，如氨水或硫酸铵。（3）磷酸盐对发酵的影响及控制磷是生物菌体生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32300mmol/L，次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol/L.磷酸盐浓度的控制，一般是在基础培养基中采用适当的浓度。24补料分批培养（FBC）的优点：（1）可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；（2）可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的影响，改善发酵流变学的性质；（3）可用作控制细胞质量的手段，以提高发芽孢子的比例；（4）可作为理论研究的手段，为自动控制和最优控制提供实验基础。25发酵终点的确定（1）经济因素 以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。（2）产品质量因素（3）特殊因素在正常情况下，可根据作业计划，按时放罐；在异常情况下，如染菌、代谢异常（糖耗缓慢等），就应根据不同情况，进行适当处理，以免倒罐。为了能够得到尽量多的产物，应该及时采取措施（如改变温度或补充营养等），并适当提前或拖后放罐时间。26摇瓶与罐培养的差异：（1）体积氧传递系数和溶解氧的差异：发酵罐中溶解氧一般都大于摇瓶，对溶解氧要求高而又敏感的菌株，在罐中发酵生产能力可能比在摇瓶中高。（2）CO2浓度的差异：发酵液中的CO2可以随空气进入，也可以由菌体代谢产生，在水中的溶解度随外界压力增大而增加，发酵罐处于正压状态，摇瓶处于常压状态，所以发酵罐中CO2浓度明显大于摇瓶，而CO2对细胞呼吸和微生物代谢产物的生物合成有很大影响。（3）菌丝受机械损伤的差异：摇瓶培养菌丝机械损伤很小，发酵罐中搅拌叶的损伤很大，菌体受伤导致核酸物质的漏失，影响菌体代谢。27发酵罐规模改变的影响（1）菌体繁殖代数的差异：发酵罐体积越大需要繁殖的代数越多，出现突变株的几率越大，引起发酵结果差异；（2）种子形成的差异：发酵罐规模越大，所需要的种子液体积越大，因此涉及到种子培养级数和菌种繁殖代数的改变，引起种子质量的差异，影响发酵结果。（3）培养基灭菌的差异：灭菌分为预热、维持和冷却三个时期，培养基体积越大，预热期和冷却期越长，整个灭菌过程消耗的时间越长，使得灭菌后的培养基质量发生变化，热不稳定的物质遭到破坏，引起发酵结果的差异；（4）通气和搅拌的差异：发酵规模改变后，其他发酵参数都相应放大，但单位体积消耗的功率（影响体积氧传递）、搅拌叶的速度均不能在放大后保持不变，影响发酵结果；（5）热传递的影响：发酵过程中菌体代谢和机械功的输入是发酵过程不断产生热量，但发酵罐的比表面积随体积增大而减小，影响散热，因此影响发酵结果。第六章 微生物药物的分离、精制和鉴定1.色谱法的基本原理:利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(分配)的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质,进行反复的吸附或分配的作用,从而使各组分分离.2.分类：根据分离的原理不同,可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等,根据操作条件的不同,又可分为柱色谱、纸色谱、 薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等类型。吸附色谱：用固定吸附剂作固定相，利用组分在吸附剂上吸附力的不同，因而吸附平衡常数不同而将组分分离。分配色谱法：用液体作固定相，利用组分在液相中的溶解度不同，因而分配系数不同进行分离。离子交换色谱分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。排阻色谱又称为空间排阻色谱或凝胶色谱法，是快速分离不同分子量混合物的色谱方法。 分离机理：不同大小的组分分子可以分别渗入到凝胶孔内的不同深度，体积大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。体积小的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。由此根据分子大小和形状差别进行分离。3.分离度的公式：影响分离度的因素：K、及NK 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度柱效：柱效低，峰就宽。上样量和流速都会影响柱效。在评价比较柱子的柱效时，必须保证条件一致，一般采用丙酮，因为它和填料之间没有相互作用。柱效与色谱柱本身的性能有关,如固定相的粒度与粒度分布、固定液涂层厚度、柱填充均匀程度及柱长等。改变a的途径：改变固定相或改变流动相，改变温度，改变样品的本身性质。、k 及 N 如何控制分离度值选择性取决于哪些选择性不仅取决于离子交换剂上基团的性质和数量，它也受实验条件的影响，如缓冲液的pH值、离子强度等。由于这些条件是可控的，因此可以人为地改变柱子的选择性，使离子交换柱具有很好的分辨率。4.谱带扩散机制1、涡流扩散：指固定相填充不均匀引起的扩散2、传质阻力项指组分在流动相和固定相之间传质的阻力3、纵向扩散项指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽第七章：微生物产生的生物活性物质1.难培养微生物（VBNC，viable but non-culture)：指的是有些微生物可以在它们的栖息地被检测到存在，但不能在实验室进行人工培养。这不是绝对的，随着微生物技术的不断发展和人们对微生物认识的不断深入，那些过去不能被培养的现在或者不久的将来则可以被培养。2. -内酰胺类抗生素的抗菌机制1)-内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类)抑制细菌胞壁粘肽合成酶（青霉素结合蛋白PBPs）细菌胞壁缺损，水分渗入胞浆，菌体膨胀破裂死亡。G+菌等敏感菌的细胞壁主要由粘肽组成；G-杆菌的胞壁外膜为脂蛋白，青霉素不能透过故不敏感。哺乳动物细胞无细胞壁，故青霉素毒性小。(2)触发细菌的自溶酶活性3. -内酰胺类抗生素细菌耐药机制 (1)细菌产