酵母细胞分批培养实验.doc

酵母菌分批发酵试验一、实验目的1.     学习酵母菌的发酵方法及其发酵过程的优化控制技术；2.     学习和掌握分批发酵一般过程和操作规程。二、实验原理酿酒酵母是一种食品级的微生物，人类从几千年前就开始利用它了，像夏禹时期就有仪狄作酒的记载。干酵母蛋白质含量高达45%，且其蛋白氨基酸品种齐全，维生素丰富，营养价值较高，是饲料工业、医药工业、发酵工业和食品工业的重要原料。早在1900年时，面包酵母已经形成大生产的规模。作为人类食物的酵母生产，则是在第一次世界大战时在德国发展起来的。酵母单细胞蛋白一直是欧美市场上缺乏的蛋白质资源，国内也很匮乏。本实验在发酵工程课堂教学理论基础上，以分批发酵法制备酿酒酵母细胞为实践内容，深入理解发酵原理、方法以及过程及其优化控制方法。通过实践与理论的结合，加深对发酵工程的认识，进一步增进专业能力和素养。发酵工程实验日程表序号实验项目时间实验内容安排1培养基制备与灭菌预计4学时1、   固体培养基配制500ml/组，分装2瓶；2、   培养皿清洗及包扎15副/组；无菌水100ml/瓶；3、   吸管包扎4支/组；4、   液体培养基制备：800ml/组，分装16瓶，灭菌0.1MPa,20min.2酵母菌种活化与种子制预计2学时1、菌种的分离纯化:超净工作台消毒（UV照射20min）75%乙醇擦拭台面；活性酵母菌粉无菌水溶解(稀释10-2倍)涡旋震荡5min；倒平板(10副平皿/组)平板划线分离30倒置培养。2、接种准备工作：超净工作台消毒（UV照射20min）75%乙醇擦拭台面。1、   种子培养接种：平板单一菌落种子培养基（2环/瓶）涡旋震荡3-5min；2、   摇瓶培养：摇床设置及调节（30，200r/m）摇瓶固定启动培养。3发酵罐结构、操作规程及酵母菌分批发酵预计 8学时1、   发酵培养基配制：18L。2、   发酵罐操作培训：发酵罐初始状态检查及调节清洗（清水冲洗2-3遍）发酵罐运行启动发酵罐运行参数设置空罐灭菌（0.15MPa,20min）进料实罐灭菌（0.1MPa维持30min）冷却火焰封口接种发酵参数稳定状态调节与维持。3、   发酵取样：取样管灭菌取样再灭菌；4、   发酵中间过程分析（0 hour）： pH测定（pH计or精密试纸）；酸度（中和法）；残糖测定（折光法）；菌体浓度测定（A600光密度法）5、   中间取样：每间隔4h, 取样管灭菌取样再灭菌.共计4-6次 ；4酵母菌的形态观察；酵母细胞的分离提取预计 6学时1、   水浸片制作及观察2、   酵母菌分离条件试验3、   发酵结束工作：器皿、设备还原，环境清洁 实验一 培养基制备与灭菌1、实验原理 培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一个完整的培养基配方组成包括组成成分、各组成成分的浓度和合适的pH。培养基的组成成分主要有碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、生长因子以及特殊用途的前体和诱导物。实验利用葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物组成的培养基分批发酵培养酵母菌。灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵，因此所使用的培养基须彻底灭菌。本实验采用121，30min的湿热灭菌法来对培养基进行灭菌处理。2、仪器、材料和试剂（1）仪器电子天平；高压灭菌锅（2）材料蛋白胨；酵母抽提物；葡萄糖；去离子水；pH试纸；NaOH；HCl；100mL三角瓶；250mL三角瓶；瓶塞；玻璃棒；称量纸；100mL量筒；500mL烧杯；培养皿（3）试剂 固体平板培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母抽提物1%，琼脂2%。液体培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母抽提物1%3、实验步骤（1）计算按固体培养基和液体培养基的配方，计算500mL固体培养基和800mL液体培养基各物质的用量。（2）称药品用砝码天平准确称量各物质。（3）溶解将培养基的组分放加在500mL烧杯的水中，玻璃棒搅拌溶解。（固体培养基琼脂在室温下不能溶解，需加热煮化）。（4）分装液体培养基每组按50L 培养基/250mL三角瓶规格分装16瓶；固体培养基分装250mL培养基/250mL三角瓶。（5）包扎 三角瓶口塞上瓶塞后用牛皮纸和线绳包扎，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。在纸上写上培养基名称、组别、日期。（6）灭菌放置于高压蒸汽灭菌锅内，121湿热灭菌30min。（7）倒平板待高压蒸汽灭菌锅降温至60时，取出培养基，液体培养基室温放置，固体培养基在已紫外灭菌的超净工作台里倒制5-10只平板。【实验注意事项】（1）          准确称量各物质，称完药品应及时盖紧瓶盖。（2）          调pH值时要小心操作，避免回调。（3）          不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。（4）          灭菌操作中务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。实验二 酵母菌种活化与种子制备1、实验原理 菌种活化是指将保存在砂土管、冷冻干燥管、冷冻斜面中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面或平板培养基进行复苏处理。活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种。这些纯种培养物称为发酵的种子。种子的一般制备过程可用下图表示：2、仪器、材料和试剂（1）仪器恒温培养箱；超净工作台；恒温摇床（2）材料酿酒酵母菌种；接种环（3）试剂固体培养基；液体培养基3、实验步骤（1）超净工作台灭菌打开紫外灯，照射30min，完毕后打开风机吹5min。(2) 准备工作将酵母菌种和培养基平板放在超净工作台中，点燃酒精灯，用75%的酒精棉球擦拭双手。(3) 灼烧接种环将接种环在酒精灯外焰上来回移动着灼烧，其中螺旋接头部分多烧一会儿，接种环烧至红热状态后，移离火焰冷却。(4) 划线法分离接种环挑取少量酵母菌，左手拿培养基平板在酒精灯火焰旁打开，接种环在平板表面分三次作“之”字形划线。每次划线后要烧接种环，再从上一次划痕的尾部拉出后划下一区，依次划成4个区。(5) 菌落培养将划线接种的平板倒置于30培养箱中培养24h。观察菌落的大小、颜色、形状。(6) 单菌落接种在超净工作台中（注意无菌操作），将50mL培养基/250mL三角瓶的瓶口连同瓶塞在酒精灯火焰上旋转灼烧片刻后取下棉塞，用灼烧过的接种环挑取一个酵母单菌落，伸入液体培养基中振荡几下，取出在火焰上灼烧，再将瓶塞塞好。再依次完成另外三瓶50mL培养基/250mL三角瓶的接种操作。(7) 标记在接种的三解瓶壁上贴上标签，注明菌种名称、操作人、日期。(8) 种子培养将接种后的培养基置于30摇床中，200rpm，振荡培养约12h。【实验注意事项】（1）       整个实验过程要严格无菌操作。（2）       标记时请写明操作者的姓名，方便查找和整理，提高效率。（3）       划线及接种完后要将接种环在火焰上灼烧，以杀死残留的酵母菌。实验三 发酵罐结构及使用操作规程1、实验目的熟悉发酵罐基本结构，了解发酵罐工作原理，学会发酵罐使用方法。2、实验内容（1）发酵罐基本结构组成：1)      罐体系统： 罐体、夹套、搅拌器、挡板、进料口、接种口、放料口、排气管、进气管、取样管、照明灯等。2)      灭菌系统：蒸汽发生器、蒸汽分配管、夹套加热装置、放料口灭菌装置、通气管取样管灭菌装置、空气过滤系统灭菌装置。3)      温度控制系统：罐内温度传感器（电极）、水箱温度传感器（电极）、恒温水箱、恒温水循环管路。4)      无菌空气制备系统：空气压缩机、气液分离器、气体流量计、气流调节器、空气过滤器（2级）。5)      控制系统：电源开关、操作显示屏、控制器触摸开关、参数设置转换调节屏。发酵罐外形图（2）发酵罐操作规程1）发酵罐工艺操作条件温度：2540。压力：00.3MPa(表压)。灭菌条件；温度100140，压力00.3MPa (表压).pH：211。需氧量：0050.3 kmo1/m3·h。通气量：0.32 V/V/M。功率消耗：0.54kW/m3。发酵热量：5，00020，000 kcalm3h。2）清洗工作清洗前应取出pH、DO电极。清洗罐内可配合进水、进气、电机搅拌、加温一起进行。清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。注意罐与罐座间隙均衡。3）试车将电极、电机、电缆、进出气软管、冷凝器进出水接头安装就位；安装完毕后要对罐体内通气（0.2MPa）作密封性试验。方法如下：关闭 阀门；旋紧罐体上每一个接口、堵头、电极紧固帽；打开空压机，调节气阀，使罐压保持0.2MPa左右；对系统进行2-3小时试运行，如有问题作相应处理后，方可正式使用。 4）发酵罐使用操作规程如果短期内需再次培养发酵，应对其进行2-3次清水清洗待用。如准备长期停用，则应对其进行灭菌，然后放去水箱与罐内存水，放松罐盖紧固螺丝，取出电极保养储存好，将罐、各管道余水放净，关闭所有阀门，电源，盖上防尘罩。发酵罐操作开始前，先关闭所有出料口、取样口、进气口，打开出气阀；加入发酵培养基，装注完成后旋紧进料口螺盖。灭菌：启动蒸汽发生器，待气压达到0.2Mpa以上时：a.开启发酵罐出气阀，开启高压蒸汽阀将高压蒸汽通过进气阀引入夹套，打开夹套排水阀，排除蒸汽冷凝水，控制阀门开量，保持微弱出汽；b.同时通过蒸汽分配管将蒸汽引入空气过滤系统（注意：蒸汽引入前关闭通向电器控制柜的空气阀门），使蒸汽通过一级和二级空气过滤器并顺利进入取样口出口，保持取样放出口微弱出汽；c.另一路蒸汽通过蒸汽阀发酵罐放料口，并保持放料口微弱出汽；d.等到罐内培养基温度达到80时，开启与罐直接相连的通气阀，将高压蒸汽直接接入罐内加热培养基，并对与罐相连的管道灭菌。e.直到罐内培养基开始沸腾后，关闭排气阀，使罐内升压至0.1Mpa（或灭菌温度121），维持温度0.5-1.0小时。关闭蒸汽进气阀，开启冷却水管路系统，通过夹套冷却发酵培养基，当罐内压力接近常压前向罐内通入无菌空气，保持罐内空气压力0.03MPa上下，至发酵温度关闭冷却水系统。启动空气压缩机，开启进气阀、使压缩空气通过旋风分离器及空气过滤器，从进气阀进入发酵罐，使溶解氧浓度达到发酵初始水平。接种：接种方法可采用火焰接种法或差压接种法。 a.火焰接种法：在接种口用酒精火圈消毒，然后打开接种口盖，迅速将接种液倒入罐内，在把盖拧紧。b. 差压法：在灭菌前放入垫片，接种时把接种口盖打开，先倒入一定量的酒精消毒。待片刻后把种液瓶的针头插入接种口的垫片。利用罐内压力和种液瓶内的压力差，将种液引入罐内，拧紧盖子。 发酵状态调节a.罐压：发酵过程中须手动控制罐压，即用出口阀控制罐内压力。调节空气流量的，须同时调节出口阀，应保持罐内压力恒定大于0.03Mpa。 b. 溶解氧（DO）的测量和控制 溶解氧的标定：在接种前，在恒定的发酵温度下，将转速及空气量开到最大值时的溶解氧DO值作为100%。发酵过程的溶解氧DO测量和控制：DO的控制可采用调节空气流量和调节转速来达到。最简单是转速和溶氧的关联控制。其次则必须同时调节进气量（手动）控制。有时需要通入纯氧（如在某些基因工程菌的高密度培养中）才能达到要求的DO值。c.pH 的测量与控制pH值的校正：在灭菌前应对pH电极进行PH值的校正。在发酵过程中PH值的控制使用蠕动泵的加酸加碱来达到的，酸瓶或碱瓶须先在灭菌锅中灭菌。旋松进料口螺旋盖，在进料口环槽中加入适量酒精棉，点燃酒精，打开进料口螺旋盖，将种子三角瓶菌液接入发酵罐。搅拌均匀后，开始发酵控制。d.间隔8 h，开启取样阀取样300500ml发酵液分别测定残糖、菌浓、酸度等数值。发酵参数到达放罐指标时，发酵结束。打开放料阀，将发酵液全部排出；放罐后用水清洗发酵罐2-3次，洗净后通蒸汽消毒15min。培养后用干净抹布要清除电器箱、电缆等接头和其他罐体部件上的物体。实验四 酵母菌分批发酵1、实验原理发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。 2、仪器、材料和试剂（1）仪器30L机械搅拌通气式发酵罐；恒温摇床；显微镜；分光光度计（2）材料酿酒酵母种子；移液管；载玻片和盖玻片（3）培养基酵母分批发酵培养基：蔗糖5%，蛋白胨1%，硫酸铵0.4% ，KH2HPO4 0.5%，MgSO4.7H20 0.2%，消泡剂0.2ml/l，pH5.5。3、实验步骤酵母菌发酵过程（操作规程见实验三）30升发酵罐装入20升发酵培养基，121灭菌30-40min，冷却至30，将培养好的摇瓶种子接入发酵罐（接种量1-5%）进行发酵。发酵条件为：温度30，搅拌转速250-300rpm，通风量1：0.5/v/v/m。过程检测与监控：0小时：取样测定pH、酸度、光密度OD和还原糖；4-24小时：每隔4h取样测定pH、酸度、光密度OD和还原糖。4、实验报告内容和数据处理根据发酵过程酵母浓度、pH、酸度和还原糖的变化规律，作出相关参数指标随时间变化的曲线图。（形态观察见实验五；生物量测定：利用分光光度计测600nm处酵母细胞的吸光值，可间接地反映细胞的多少，测OD值时，要迅速，尽量避免细胞沉降所引起的误差）实验五 酵母菌的形态观察1、实验原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍或几十倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本试验通过美蓝染液水浸片合水碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种数的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏(McClary)培养基（葡萄糖醋酸钠培养基）有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。2、仪器、材料和试剂（1）仪器 显微镜；超净工作台（2）材料吸耳球； 50mL小烧杯；玻璃棒；载玻片；盖玻片；擦镜纸；接种环；酒精灯（3）试剂0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染色液哥卢氏碘液3、实验步骤美蓝浸片观察（死活细胞的观察）(1) 在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀。(2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。(3) 将制片放置3min 后镜检，先用低背景然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。(4) 染色后约0.5h 后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。(5) 用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。(6) 对于发酵液中的酵母细胞，可以用无菌玻璃棒蘸取后直接制片观察。比较固体培养和液体培养的酵母细胞形态有何异同，并绘图。水碘液浸片观察（酵母菌细胞中肝糖粒的观察）在载玻片中央加一小滴哥卢氏碘液，在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。4、实验结果根据观察结果，绘制出酵母的形态图。实验六 酵母细胞的分离提取1、实验原理 酵母细胞提取物富含氨基酸、维生素、核酸等营养成分，可用于食品、保健品、医药、饲料等多种领域。可通过机械破裂，化学和酶处理，巴氏灭菌法， 自溶，质壁分离和水解等多种技术实现胞内产物的释放。因而首先需要从发酵液中将酵母细胞分离出来。离心分离是生物技术中最常用的分离方法之一，本实验即利用离心技术分离酵母细胞，并比较不同离心操作条件下其生物量的得率，从而确定优化的离心分离条件。另外，工业上常采用板筐过滤机进行酵母细胞的分离。2、仪器、材料和试剂（1）仪器 离心机（2）材料 发酵液；100mL量筒；200mL塑料离心管；玻璃棒（3）试剂丙酮（CP）；去离子水3、实验步骤晃动发酵液中的酵母细胞使其混合均匀。用量筒测定三角瓶中发酵液的体积，并均匀的分成4等份移至200mL离心管中。在3000r/min的转速下，分别离心10min、15min、20min、25min。从三角瓶中倾出清液，回收酵母细胞，并用少量的丙酮清洗酵母细胞、称重。绘出离心时间酵母细胞得率的曲线。采用相似的步骤，在不同的转速1500，3000，4000r/min下离心10min，分析转速酵母细胞得率之间的关系。根据上述结果，分析优化的离心条件并阐明原因。【实验注意事项】（1）离心时样品需对称放置并平衡，平衡时如果缺少样品，可以用蒸馏水空白离心管代替。（2）各组在离心操作时，对离心时间、转速等进行协调，以节省实验时间。