食用菌实用新技术.doc

食用菌实用新技术报告 福建农林大学 黄毅 报告内容： 一、黄毅食用菌工作室简介 一、二、三、二、一、 从第一次种菇谈起三、常压灭菌锅的设计与应用四、二、 一种网格式食用菌专利栽培架的介绍五、市场价格变化的分析六、回答问题一、黄毅食用菌工作室E-mail:huangyi1113yahoo.com.cn地址：福建、福州、金山福建农林大学电话：3789137、3791387 邮编：350002简介：福建农林大学教授一名、副教授一名，现有研究生8名。本实验室专门从事食用菌教学、科研、技术开发，已有33年的历史。主攻各种食用菌集约化、规模化、工厂化栽培的设计、实施及相关多学科的协调与运作等问题。科研项目：白色金针菇优良菌株的早期鉴定、名特优稀新菌类产业化生产综合技术示范、珍稀食用菌周年设施栽培环境的控制技术及应用工作汇报1993年罗源霍口乡百万袋白背毛木耳场99年福州城门周年金针菇栽培设施三、 从第一次种菇谈起1、1、 1969年冬第一次到三明真菌所，认识吴经论恩师开始。2、第一次收获香菇的喜悦，决定了我终身的事业。3、黄年来恩师给我的引导，使我终身难忘。4、手抄本。对菌业的兴趣才是永恒的动力。5、第一次发表文章 草菇的心情真菌试验 （三明地区真菌试验站）6、2、 三明菌种厂的筹建，得到锻炼。仅有专业知识是不够的，食用菌是多学科的交叉，迫使自己不断扩充知识。7、农林7、 业大学给我扩充知识和提高的机会。三、食用菌常压灭菌锅的设计与应用（一）、灭菌彻底是食用菌栽培的核心栽培袋的灭菌是否彻底，是食用菌栽培成功的基础。影响灭菌彻底的因素很多，在我的专著中已经详细分析过，今天就灭菌锅的结构的历史演变进行详细讨论，希望有所启发。（二）、福建常压灭菌锅建筑的历史演变过程栽培者对食用菌栽培的认识有一个过程，同样，对灭菌锅的构造的合理性与否，也要经过一个长期的认识、了解和接受的过程。1、 型灭菌锅（1971年三明真菌试验站）点评:当时主要生产玻璃瓶为容器的菌种。2、 型灭菌锅（1972年在三明真菌试验站首次设计）3、点评:当时的认识有历史的局限性, 采用塑料袋作为容器，用于栽培食用菌工艺还没有出现。3、周转筐推拉式灭菌锅（1986年本工作室首次设计）4、点评:当时历史是属于新思路、有创意, 但灭菌容量较小，但其原理是后来新设计方案仿效的基础。4、汽油桶式灭菌锅（1985年许家庭首次设计使用）5、点评:结构简单, 经济, 科学, 但出气慢, 寿命短, 仅能适合季节性生产，满足不了连续性大规模工厂化生产。5、6、 平板车隧道式灭菌锅（1988年在漳州，台湾菇农采用的灭菌锅）7、点评:该灭菌方式适合工厂化栽培连续性灭菌所需要。产生活蒸汽是彻底灭菌和缩短灭菌时间的关键所在，但劳动强度较大。（1）周转筐的设计 （1999年本工作室所设计第二代周转筐）点评：是设施栽培所必须的，从本试验市实验室提出，到广泛接受，经过十年，现已推广到全省设施栽培企业。样子几乎大同小异。（2）周转筐的材料表6、盒式帆布灭菌锅（1998年古田菇农创造）点评:建筑成本低廉、灭菌容量大、灭菌后散热快，但 灭菌时间长, 劳动强度较高6、8、 塑料布灭菌锅（1999年周宁菇农所创造锅炉）9、点评:锅炉热效率相对较高, 出汽快, 但使用寿命较短。7、双门周转车灭菌锅（1）、本工作室什么要设计双门周转车常压灭菌锅灭菌数量 灭菌时间的限制 设施栽培所需要（减少一次搬动，降低劳动强度） 活蒸汽（2）、双门周转车灭菌锅的结构图 （1999年2月本工作室所设计的新型常压灭菌锅，现已在金针菇企业得到广泛应用）点价:大幅度降低劳动强度, 将平板车改为周转车，灭菌、冷却、进入接种室都在周转车进行，减少搬运次数, 适合连续性大批量生产 活蒸汽（3）、双门周转车灭菌锅的使用效果8、新型节能灭菌锅 思路：（1）、如何减少灭菌锅内地面吸热（2）、灭菌过程中产生的冷凝水如何进行再利用（3）、如何利用太阳能、炉膛的辐射热对进水进行预热四、一种网格式食用菌专利栽培架简介2003年取得国家专利证书（一）、专利栽培架产生的由来（二）专利栽培架外观优点：1、1、 在菌丝培养阶段，能够实现同步生长。2、克服传统墙式栽培无法在栽培袋间随意调整的弊病。2、3、在自动喷雾时，所有栽培袋都能够较一致获得水分。4、3、 出菇阶段，每一栽培袋的发育基本一致。5、便于整体随意搬动，为真正6、实现多区制栽培提供可能。缺点：占地面积较大些。制作成本较高些1、利栽培架成型立体结构图2、专利栽培架的网格尺寸图3、专利栽培架的侧面图 4、专利栽培架顶视图（三）、专利栽培架应用现场五、市场价格变化的分析（一）、上海四大市场蘑菇价格变化曲线（二）、上海四大市场香菇价格变化曲线（三）、上海四大市场草菇价格变化曲线（四）、全国三大市场香菇价格变化曲线 我国双孢蘑菇生产、加工与品种改良福建省轻工业研究所 王泽生摘要：本文介绍我国，尤其是福建省双孢蘑菇生产、加工的发展与品种改良的进程，主要报告杂交菌株AS2796的选育及其家系的分子遗传研究。关键词：双孢蘑菇；生产；加工；品种；改良前 言 双孢蘑菇栽培起源于法国，至今已有300多年的历史。双孢蘑菇菌种的提纯、制备与品种改良也有100多年的历史。我国缺乏双孢蘑菇种质资源，1925年前后从国外引进到国内栽培, 1978年前后开始品种的改良。 至今, 我国已成为世界第一大双孢蘑菇生产国， 我国育成的双孢蘑菇杂交菌株AS2796系列也成为世界上年产鲜蘑菇量最大的商业菌株之一。1、 生产与加工的发展1.1 从1925年引进到2000年，我国已成为世界第一大双孢蘑菇生产国，年产鲜菇45万吨,农业产值15亿元人民币，加工业产值30亿元人民币。(2000年美国产鲜蘑菇38.1万吨，排名第二)1.2 从1985年起，福建省双孢蘑菇年产量均占全国50%以上，成为全国第一大产区，1995年产鲜菇 27.9万吨, 农业产值达10亿元人民币，加工业产值20亿元人民币。1.3 台湾省的双孢蘑菇生产发展先于大陆省份，1978年达到顶峰，年产鲜蘑菇11.9万吨，是当时全世界第三大蘑菇产区。1.4 我国大陆从1960年前后开始生产双孢蘑菇加工产品，1980年起达较大规模, 加工出口贸易量均占国际贸易量的50%左右。福建省从1966年开始加工蘑菇，1985年起加工产量均占全国的50%以上。2、栽培技术与品种改良进程2.1 引进生产菌株与一次发酵栽培技术(1925-1977)2.2 引进菌株的比较筛选与二次发酵技术(1978-1983)2.3 引进菌株的孢子分离物筛选，同核不育单孢株配对杂交和二次发酵新技术研制(1983-1988)2.4 杂交新菌株AS2796育成推广和规范化、集约化栽培(1989-1996)2.5 应用生物技术改良双孢蘑菇生产菌株的特殊性状,比如耐热、抗病等相关基因的分离与转化(1997-)3、双孢蘑菇杂交新菌株AS2796的家系及其分子遗传研究3.1 研究背景双孢蘑菇Agaricus bisporus Lange(Imbach)是世界性研究、生产和消费的食用真菌。自从荷兰育种家G.Fritsche首先于1981年育成商业杂交菌株U1和U3 (Fritsche, 1983)并由Darmycel菌种公司投放市场以来,杂交菌株已经基本取代了传统的孢子分离菌株。在我国，福建省轻工业研究所于1983年开始双孢蘑菇的杂交育种研究,1986年以来建立起同工酶预测、鉴定新菌株等杂交育种技术(王泽生等,1989,1990,1991),先后选育出As376、As1671和As2796等系列杂交菌株, 其中As2796明显结合了双亲本高产与优质的特征,成为我国最广泛使用的商业菌株,年产鲜菇超过30万吨(王泽生等,1995)。 杂交菌株的育成和应用无疑使双孢蘑菇的生产水平和经济效益都得到显著的提高,但是对双孢蘑菇杂种优势的分子机理研究甚少。在使用多年以后，某些杂交菌株表现出对温度敏感或对轮枝霉病侵染敏感,子实体丛生等现象,导致产、质量下降等退化表现。那么这些退化现象的分子机理又如何呢?鉴于此,我们认为有必要对杂交菌株的家系进行遗传跟踪分析,以便进一步探讨双孢蘑菇杂交优势形成与退化的遗传基础,用于指导进一步的杂交育种和菌种保藏,预测新菌株可能形成的优良性状,监测新菌株在长期保藏后与生产使用中的性状表现,直接服务于生产。此前，Fritsche于1987年发现U1菌株发生凹顶、空腹、硬开伞和单产下降等退化现象。为了复壮U1菌株,她采用原生质体克隆,多孢分离培养,单孢分离培养, 并用原先的2个同核体重复杂交,发现U1的F2代单孢分离株表现出较大的变异性(1991)。 Khush等(1992)用RAPD技术作了双孢蘑菇遗传亲子的分析,Kerrigan等(1993)通过系统家系的构建,以DNA分子标记为辅助,分析标记在亲本及其子代中的分离情况,建立了双孢蘑菇遗传连锁图。本研究应用随机扩增多态性DNA(RAPD),线粒体DNA(mtDNA)酶切电泳和酯酶(Est)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术分析杂交菌株As2796的遗传家系。 3.2 杂交菌株AS2796及其遗传家系的由来 单孢分离 02-361-2杂交 单孢分离 单孢分离 单孢分离 W95-2-As2796-As4607 8213-As165 P Ps F1 F2 F3 异核亲本 同核不育株 杂交子一代 杂交子二代 杂交子三代 图1 双孢蘑菇杂交菌株As2796的遗传家系。以上菌株均由福建省轻工业研究所，福建省蘑菇菌种研究推广站提供。3.3 研究方法与试剂3.3.1 总DNA的RAPD分析：按曾伟等的方法(1999)。3.3.2 mtDNA的酶切分析：按廖剑华等人的方法(2001)。3.3.3 酯酶(Est)同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析：按王贤樵等的方法(1989)。3.4 结果与分析3.4.1 RAPD分析本实验用9种随机引物对双孢蘑菇As2796家系的7个菌株的基因组DNA进行扩增,均得到阳性结果,将得到的所有电泳图谱进行统计,根据公式:相似值S=2Nab/Na+Nb对统计的数据进行聚类分析,换算出各菌株间的遗传相似值,并列于家系遗传构成图中(图2)。 实验结果表明:1.单孢同核体的泳带数量少于异核体,但也出现了某些异核体中没有的新带,单孢同核体与其异核亲本及杂种子代间的遗传相似值较低。2.子一代杂种W95-2与两个异核亲本02,8213之间的遗传相似值分别为0.621和0.729;子二代杂种As2796与异核亲本的相似值为0.593和0.640;子三代杂种As4607与异核亲本的相似值为为0.600和0.626。而W95-2与As2796的相似值为0.778, As2796与As4607相似值为0.839。这些数据表明,随着遗传代数的增加,杂种子代与出发异核亲本间的遗传差距逐渐增大,但杂种子代间的遗传相似值也逐渐增大。证明同核单孢杂交比传统的单孢、多孢分离筛选更容易产生优势明显的新菌株，杂交菌株的遗传特性可以通过单孢分离、筛选得以保持。3.4.2 mtDNA酶切图谱分析 实验使用四种内切酶Hae(识别GGCC)、CfoI(识别GCGC)、MspI(识别CCGG)、TaqI(识别TCGA)对mtDNA粗提物进行酶切,获得的片段数达15-20条，接近纯mtDNA酶切的效果。酶切图谱(图3，图4)显示, 异核亲本8213及其杂种W95-2(F1),As2796(F2)和As4607(F3)具有相同的线粒体基因型,而另一异核亲本02具有另一种基因型,表明双孢蘑菇的mtDNA呈单亲遗传, 这和Sonnenberg(1991)的研究结果相一致。3.4.3 Est同工酶的PAGE图谱分析 图5显示出发异核亲本02和8213分属H2型和G1型,而它们的同核单孢菌株361-2和As165保留了亲本的标记区带e2,e4和e1,e3,但其它区带数明显减少形成Hs1和Gs2型酶谱,杂种W95-2(F1),As2796(F2)和As4607(F3)具有相同的Est酶谱,它们同时表达出双亲的标记区带e1,e2,e3,e4,呈典型的杂合态,被称为HG4型。上述结果表明,从异核亲本分离出同核单孢株到杂交形成杂种子一代,Est同工酶标记位点表现出遗传和重组,形成传统菌株(王泽生等,1989,1990)所没有的新的基因类型,并能稳定遗传给其单孢子代As2796(F2)和As4607(F3),与此相吻合的是亲本02的高产特征和8213的优质特征能通过杂交组合于杂交种W95-2(F1),其异核单孢分离株As2796(F2)和As4607(F3)保持了这种高产兼优质的特征,成为中国最广泛使用的商品菌株(王泽生等,1995),证明Est同工酶标记是双孢蘑菇新菌株特性预测或鉴定的有效指标。2、4.讨论  44.1 应用RAPD、mtDNA和同工酶等分子标记技术对双孢蘑菇商业杂交菌株As2796的家系进行跟踪分析,使我们对同核单孢菌株间杂交产生的杂种优势的内涵及其遗传有了更多的了解。在现有商品菌株间杂交产生的变异是有限的,虽然可以获得更优良的菌株,但改良程度受到限制. 因此,充分利用野生种质,或近缘种(大肥菇等)进行杂交就显得十分重要。 4.2 mtDNA是真菌中最主要的染色体外遗传物质,遗传方式独特。该遗传系统虽受控于核系统,但仍存在特殊的DNA复制机制,RNA拼接机制以及个别有别于“通用”密码子的遗传密码子。国际上对双孢蘑菇mtDNA的初步研究(Hintz等,1988;Sonnenberg等,1991;Jin等,1992)表明双孢蘑菇mtDNA存在3-4种基因类型,虽然这些多态性明显不如其它物种,但它和双孢蘑菇重要性状的关系仍然值得探讨。尤其是双孢蘑菇mtDNA呈现单亲遗传的现象在菌株改良中的应用。假如某一亲本的某一优良性状受控于mtDNA,那么利用单亲遗传特点, 让这一亲本的同核体处于生长较快状态与另一亲本配对杂交,其子代就可能只承袭生长较快状态亲本的基因型(Jin,1994),达到改良的目的。反之若承袭的是不良性状的基因,那么菌株可能产生不如人意的退化现象。4.3 福建省轻工业研究所于八十年代开展双孢蘑菇同工酶PAGE表型与菌株特性相关研究,并成功地把同工酶电泳技术应用于双孢蘑菇菌株特性的预测(王贤樵等,1989;王泽生等,1989,1990),根据电泳表型可把双孢蘑菇分为高产或H型,优质或G型,中间或HG1-2型,杂交或HG4-5型和同核不育或S型。近来又应用RAPD技术对三种重要类型菌株进行分析,获得相同结果,从另一角度证明了同工酶分型的可靠性(陈美元等,1998)。