胶原蛋白的提取.doc

型胶原蛋白的制备、鉴定及其抗UVA氧化损伤作用的初步研究学科专业：动 物 学 研究方向：生化制药 指导教师：魏泓 教授 研 究 生：王 琳（2001345） 内 容 摘 要本文围绕型胶原蛋白（CP）的制备及其理化性质进行研究，同时在其防止长波紫外线（UVA）对细胞的要用于填充深的皱纹，皮肤损伤造成的缺损（如青春痘疤）和修补脸形的缺陷等。其效果立竿见影，但注射到皮肤内的胶元蛋白会被人体逐渐吸收，因此其功效只能维持半年至一年，而且少数人群可能会出现过敏氧化损伤方面进行了初步探索，为CP的进一步研发提供理论基础和科学依据。以猪皮为材料，比较酸溶法、酶解法、中性盐溶液法三种粗提方法，选择得率和纯度都较高的酶解法为最佳粗提法，结合高效液相色谱进行CP的分离纯化。CP理化性质鉴定结果表明：样品在223 nm处有紫外最大吸收值；含有十八种氨基酸，氨基酸总量在90%以上；样品的蛋白质浓度为1.03mg/ml；SDS-PAGE测定CP由、三条链组成；色谱分析纯度约为100%。通过小鼠急性毒性试验、豚鼠致敏试验、细胞毒性试验对自制CP进行整体水平和细胞水平的生物安全性评价，观察期内，小鼠未见异常毒性反应；豚鼠注射点无红斑及水肿情况；细胞毒性小于级，结果证明本方法制备的CP无毒副作用。评价CP对UVA氧化损伤的L929细胞的保护作用。结果表明：随着UVA照射时间的延长，细胞的活性明显降低，说明UVA对细胞的氧化损伤是明显的，其中表现为MDA的含量升高、GSH-px的含量降低。加入不同浓度的CP后照射同样的时间，MDA的含量有所下降、GSH-px的含量有所升高，其中50%CP组的效果极为显著（P0.01）。提示该物质有防止UVA氧化损伤的作用。综上所述，利用酶解和高效液相色谱制备相结合的方法可以从猪皮中分离纯化CP，该方法具有高效性，高选择性和易放大性；理化性质鉴定及生物安全性试验表明，该物质为纯活性胶原蛋白，无毒副作用；同时对体外细胞的UVA氧化损伤具有较好的保护作用。关键词：型胶原蛋白；高效液相色谱；制备；鉴定；氧化损伤Studies on the preparation，identification of CPand its protective effect on cells damaged by UVAMajor : Biology Speciality : Zoology Tutor : Prof. Wei Hong Author : Wang Lin（2001345）AbstractIn this paper,how to prepare CPand identify physico-chemical property had been studied, and UVA oxidative damage L929 was perliminary discussed. These datas provided theoretic foundation and scientific proof for further research and development of this product.Pigskin was used as material. According to the comparation among the three kinds of crude extraction methods including acid dissolve,enzymolysis and neutral salt solution. The method of enzymolysis combined with HPLC was chosen to prepare CP.The physico-chemical property of CPwas identified. The results showed that: CPshowed character absorption peak at 223nm; CPhad 18 kinds of amino acids, total count of amino acid was more than 90%; the concentration of protein was 1.03 mg/ml; CPwas composed of chain,chain and chain by SDS-PAGE; One pure peak with HPLC was founded and its purity was 100%. The security of CPaccording to the experiments of mice accute toxicity was evaluated, Guinea pig sensitization and cytotoxicity experiment in integer level and cell level. It was showed that : the mice had no toxic reaction; the Guinea pigs points of injection had no erythema and dropsy; the cytotoxicity was lower thanclass. The results proved that CPhad no poison side effects.CPprevented UVA from oxidative damaging L929 was studied. The activity of cells became weaker and weaker with exposure time. It was conspicuous that UVA damaged the activity of cells. The contents of MDA upgraded and the contents of GSH-px degraded. When adding different concentration of CP, the contents of MDA decreased and that of GSH-px increased. The effect of 50 % concentration group was extremely remarkable (P<0.01). It showed that CPcan counteract oxidative damage from UVA.In conclusion, the method of enzymolysis combined with HPLC to extract CPfrom pigskin was proposed. This method showed the adventages of high performance, high selectivity and easily amplification. Acoording to the experiments of identifying the physico-chemical property and the biosafety of CP, it was concluded that CPhad high bioactivity and no toxicity effect, and that CPhad the ability to protect cells from oxidative damnification.Key words : CP, high performance liquid chromatography, physico-chemical property , identification, oxidative damnification1 前言型胶原蛋白（Collagen Protein）是一组由多种糖蛋白组成的大家族，不仅具有合成高分子不可比拟的生物相容性、生物降解性和抵抗原性1，而且具有一系列重要的生物学功能，如：具有明显的提高人体免疫功能与改变心肌功能作用；保护胃粘膜以及抗溃疡作用；抗过敏作用；抑制血压上升作用；其中某些特殊氨基酸还具有防癌作用2。因此型胶原蛋白在生物医学材料、美容保健、药物缓释等诸多领域具有良好的应用前景。型胶原蛋白由于其结构复杂，生物学特性各异，因此从生物组织中纯化型胶原蛋白比较困难。关于型胶原蛋白的分离纯化工作，国内相关报道不多，常见的提纯方式只是简单的利用一步柱层析进行3，此方法存在生产周期长、分离效率低、产物纯度不高等缺点。长的分离周期和低的分离效率不仅增加了胶原蛋白的生产成本，而且使很多资源无法得到有效的利用。本文在此基础上对制备工艺进行改进，使用酶解和高效液相色谱相结合的方法，从猪皮中分离纯化型胶原蛋白。高效液相色谱具有操作条件温和，选择性高，批处理量大和操作自动化等优点4，是分离纯化胶原蛋白的有效方法。本文探索了型胶原蛋白的提取方法，为其高效制备工艺的形成提供有力的技术依据。近年来由于臭氧层的破坏而使长波紫外线辐射增强，长期的紫外线辐射会导致皮肤老化，黑色素瘤及多种皮肤癌等病变5-8。自由基抑制剂或清除剂能防止紫外线的氧化损伤，保护皮肤，延缓皮肤衰老910。以往的研究多是集中于天然植物提取物的抗氧化作用，而对动物活性物质抗氧化作用的研究少见报道。本文在建立UVA氧化损伤L929细胞模型的基础上，探索型胶原蛋白防止UVA氧化损伤的作用和机理，为具有抗UVA氧化损伤作用的活性物质的开发开辟新的领域。因此，本文选取型胶原蛋白作为研究对象，通过对型胶原蛋白的提取分离、理化性质及生物功能的研究，为型胶原蛋白产品的深入开发提供必要的技术支持。2 材料2.1 主要仪器设备CR22G型高速冷冻离心机，日本HITACHI株式会社；FTS系列冻干机，Dupont公司；79型控温多用高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂；BD-462型冰柜、SC-320型冷藏箱，青岛澳柯玛股份有限公司；LS-B501型立式圆形压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂；电泳仪，美国BIO-RAD公司；QPLS-22型不锈钢绞肉机，江苏丹徒县纪庄食品机械铸件厂；ZT-2000型圆筒式过滤器，绍兴市卫星医疗设备制造有限公司；UV751，GD紫外/可见光分光光度计，上海分析仪器厂；SPX250B型系列生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；PB310S型电子天平，北京赛乌利斯有限公司；LAC 214型电光分析天平，常熟市衡器厂；HHS-8S电热恒温水浴锅，上海天平仪器厂；B5060型二氧化碳培养箱，美国HERAEUS公司；COTC型倒置显微镜，重庆光学仪器厂；紫外线灯管(UVA)，北电光源研究所；SXK-103型超净工作台，安徽省蚌埠净化设备厂；超声波细胞粉碎机，宁波东芝生物技术有限公司；550型酶标仪，美国BIO-RAD公司；HP-1100型高效液相色谱仪，Agilent公司；ZORBAX 300 SB-C18半制备色谱柱（9.4mm×25cm），Agilent公司；Hypersil ODS C18分析柱（4.0mm×250mm），Agilent公司；FC 203B馏分收集仪（Fraction Collector），美国Gilson公司；8453E型紫外分光光度系统，Agilent公司；高速氨基酸自动分析仪，6300黄金系统，美国贝可曼公司；2.2 实验动物2.2.1 豚鼠英国种封闭群，普通级，健康，雌雄均可，体重250350g，试验前及试验后的观察期内，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的动物不得重复利用。由第三军医大学实验动物中心提供。2.2.2 小鼠昆明（KM）小鼠，普通级，健康，68周龄，1822g，合格证号：310101014，由第三军医大学实验动物中心提供。2.3 样品与试剂市售猪皮；NIH3T3细胞，L929细胞，由第三军医大学免疫教研室提供；型胶原蛋白对照品，Sigma公司；胃蛋白酶（1：2500），Sigma公司；胰蛋白酶，Sigma公司；甲醇，Merck公司；羟脯氨酸对照品，南京建成生物工程研究所；DMEM培养基干粉，美国GIBCO公司；小牛血清，兰州民海生物工程公司；丙烯酰胺，Tianjin,H&Y. Bio,Co;Ltd；甲叉双丙烯酰胺，Tianjin,H&Y. Bio,Co;Ltd；TEMED，Promega Corporation;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；MTT，Sigma公司；DMSO，上海生工有限公司；分子量蛋白Marker，上海生物化学研究所；MDA活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；GSH活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯。2.4 常用工作液D-Hanks溶液：将NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，Na2HPO4.7H2O 0.06g，酚红 0.02g，加ddH2O至1000ml溶解，0.07Mpa高压灭菌15min。双抗储备液：将青霉素100万单位，链霉素100万单位溶于10ml ddH2O，即为每毫升含青霉素10万单位，链霉素10万单位的双抗储备液，-20 OC保存。DMEM培养液：DMEM培养基干粉10g，双抗储备液1ml, NaHCO3 2.0g，用三蒸水溶解，定容至1000 ml。溶液用5.6% NaHCO3调pH至7.2左右，不锈钢滤器除菌分装，此为不完全DMEM培养液，加入20%小牛血清后为完全DMEM培养液，-20 OC保存。胰蛋白酶液：将0.25g胰蛋白酶粉末溶于100ml的PBS中，即为0.25%胰蛋白酶液。丙烯酰胺单体贮液：将14.55g丙烯酰胺和0.45g甲叉双丙烯酰胺溶解于40 ml的ddH2O中，搅拌直到溶液变成透明，再加ddH2O至50ml，过滤，装入棕色瓶，4OC可保存一个月。浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCL，pH 6.8）：将6.06g Tris溶解在40 ml的ddH2O中，用4mol/L HCL调节pH至6.8，再加ddH2O至50ml，4OC保存。分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCL，pH 8.8）：将9.08g Tris溶解在40 ml的ddH2O中，用4mol/L HCL调节pH至8.8，再加ddH2O至50ml，4OC保存。10%SDS溶液：将25g SDS溶解在250 ml ddH2O中，室温保存。10%过硫酸铵溶液：将0.1g过硫酸铵溶解在1ml ddH2O中，使用前新鲜配置。10%TEMED溶液：将0.1ml的TEMED溶解在0.9ml ddH2O中，-20 OC保存。电泳缓冲液：将3g Tris、14.4g甘氨酸、1g SDS溶解在1L ddH2O中，调节pH至8.3左右，室温下保存。样品缓冲液：将0.6ml的1mol/L Tris-HCL（pH 6.8）、5ml 50%的甘油、2 ml 10%的SDS溶液、0.5ml的-巯基乙醇和1ml的1%溴酚蓝混合，加ddH2O至10 ml，4OC保存。染色液：0.29g考马斯亮兰R-250溶于250 ml脱色液中。脱色液：50 ml乙酸和165 ml甲醇，加ddH2O至1L。3 方法3.1 型胶原蛋白（CP）的制备型胶原在皮肤中含量丰富。本实验选择猪皮作为提取材料，分别用酸溶法、酶解法及中性盐溶液法来粗提CP。3.1.1 粗提法3.1.1.1 酸溶法前处理：称取新鲜猪皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液对其进行脱脂后切除皮下脂肪，去毛并细切。将用蒸馏水洗涤后的组织小块放入高速组织捣碎机中捣碎成糊状（12000r/min），用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）充分洗涤以去除脂质及血清等成分，低温离心（8000r/min，30min，4OC）。抽提：将沉淀用含0.45mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液在4OC下反复抽提，以去除非胶原杂蛋白。用蒸馏水反复洗涤。然后在上清液中加入0.5mol/L冰醋酸，使溶液pH为2.53.0，通常每升提取液中加入30ml的冰醋酸，用磁力搅拌器充分搅拌，离心后弃沉淀。盐析：在上清液中加入NaCl至4.4mol/L，搅拌过夜，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/L冰醋酸中，再逐级用2.4mol/L，1.7mol/L及1.0mol/L的NaCl反复盐析、酸溶。最后得到的上清液即为胶原粗提液。将胶原粗提液冷冻干燥得到胶原粗提物冻干品，于低温下保存。3.1.1.2 酶解法将新鲜猪皮100g以同样的方法进行前处理后，加入1L含胃蛋白酶500mg的0.5mol/L冰醋酸，搅拌并维持在4OC，提取48h。沉淀、盐析、纯化、干燥及保存胶原的方法与酸溶法相同。3.1.1.3 中性盐溶液法将新鲜猪皮100g以同样的方法进行前处理后，加入1L含1.0mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.5），在4OC下抽提48h。盐析、收集、干燥和保存胶原的方法与上面相同。3.1.2 高效液相色谱纯化CP将胶原冻干品用超纯水溶解，经0.45um滤膜过滤，取滤液上样进行色谱分离。色谱条件：ZORBAX 300 SB-C18半制备色谱柱（9.4mm×25cm），流动相：A为水（85%），B为甲醇（15%）；采用线形梯度洗脱；流速：1ml.min-1 ；进样量：500uL；检测波长：220nm；柱温：室温，收集主峰，用于理化性质鉴定。3.2 CP的理化性质鉴定3.2.1 37 OC凝结试验 将型胶原蛋白冻干品溶解于PBS溶液中，放入4OC的冰箱，1h后观察溶液的变化，再升温至37OC观察溶液的变化。3.2.2 紫外吸收值测定将CP冻干品溶于0.5mol/L冰醋酸溶液中，配成0.05%的胶原溶液。以0.5mol/L冰醋酸溶液作为空白对照，用Agilent 8453E型紫外分光光度计测定其吸收光谱。3.2.3氨基酸组成及含量分析 3.2.3.1 羟脯氨酸含量测定准确称取羟脯氨酸标准品，加入0.001mol/L盐酸溶液，分别配制浓度为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml的标准液。然后，以0.001mol/L盐酸作为空白液，在上述标准液中分别加入氯胺T溶液2ml，混和静置20min，加过氯酸2ml，对苯氨基苯甲醛2ml，混合后60OC加热20min，待冷却后用可见分光光度计于560nm处测定吸光值。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，并回归出标准曲线方程。 将CP以及100倍于样品量的6mol/L HCL放入具塞耐热试管，110oC加热24h进行水解。用NaOH将溶液调至中性后，用上述方法测定胶原样品的吸光值。然后根据回归方程计算出胶原样品中的羟脯氨酸含量。3.2.3.2 氨基酸含量的测定（羟脯氨酸除外）将CP样品溶解在6mol/L HCL中，充氮气2min，抽真空封管，置于110oC烤箱内水解22h24h,蒸干，定容，过滤（0.22um），在高效氨基酸分析仪上测定出除羟脯氨酸以外的其它氨基酸组成。3.2.4 蛋白质浓度的检测使用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒检测。标准曲线制备如下表:空白管标准管1标准管2标准管3标准管4标准管5标准蛋白液(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20CBBG250显色剂3.0ml（迅速混匀，室温放置10分钟） 在595nm处，空白管调零，分别测定各管吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。将样品按上述方法测其吸光度值，用直线回归方程求样品浓度。3.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳3.2.5.1 配胶：按下表分别配制分离胶与浓缩胶溶液。溶 液 种 类分离胶（7%）浓缩胶（3%）丙烯酰胺单体贮液7ml3.4ml浓缩胶缓冲液-2.4ml分离胶缓冲液7.5ml-10% SDS0.3ml0.2ml双蒸水15.2ml14ml过硫酸铵（10%）50ul50ulTEMED（10%）20ul20ul3.2.5.2 制胶：将分离胶注入电泳槽的胶室中，用无水乙醇封存，聚合再后倒入浓缩胶。3.2.5.3 加样：将提取的CP与型胶原蛋白标准品分别加入样品缓冲液。所得的样品处理液以1：1体积分别加入1.5ml离心管中，封盖，100oC加热4 min。再加入10ul -巯基乙醇与10ul 0.05%的PBP（溴酚蓝指示剂），用微量加样器将各样品逐个加入齿槽。3.2.5.4 电泳：在上下槽中加入电泳缓冲液（pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲液），连通电源。电流：50mA电泳时间：2h3h至标记色素到达分离胶的下端3.2.5.5染色和脱色：取出凝胶，浸泡在甲醇系统染色液中，室温下染色，然后用水洗凝胶，用脱色剂脱色至透明。3.2.6 RP-HPLC分析 CP 采用RP-HPLC分析色谱进行鉴定。色谱条件：Hypersil ODS C18分析柱（4.0mm×250mm），流动相：A为水（95%），B为甲醇（5%）；采用线形梯度洗脱；流速：1ml.min-1 ；进样量：20ul；检测波长：220nm；柱温：室温。3.2.6.1 精密度实验 精密吸取型胶原标准品溶液20ul，在同一时间内，重复进样5次。记录峰面积和保留时间，计算相对标准方差。3.2.6.2 重现性实验 取同一批酶解法得到的胶原蛋白粗提物，在不同时间用3.1.2项的方法进行纯化，按上述色谱条件进样测定5次。记录峰面积和保留时间，计算相对标准方差。3.2.7 生物安全性试验3.2.7.1 急性毒性试验选20只昆明小鼠随机分为对照组和实验组，每组10只。分别给实验组的小鼠腹腔注射胶原蛋白溶液1ml，而对照组的每只小鼠注射1ml生理盐水。观察注射7d后每只小鼠的情况11。3.2.7.2 皮肤致敏试验选30只健康豚鼠，随机分为3组：试验组，阳性对照组（5%甲醛溶液）和阴性对照组（生理盐水），每组10只。以脊柱为中线，对豚鼠进行皮内注射，每侧注射3个点，每个注射点注射0.2ml，注射点间相隔2cm。观察注射后24h，48h，72h注射部位的状况12。3.2.7.3 细胞毒性试验制备NIH 3T3 细胞悬液，调整细胞浓度为2×1053×105个/ml，接种到96孔培养板，每孔100ul13-16。试验组为不同浓度的加药组，分别为100%CP组，50% CP组，25% CP组和12.5% CP组，每孔加药 100ul；阴性对照组为正常培养组。 置于37oC，5% CO2培养箱中培养48h。实验结束前4h加5mg/ml的MTT，每孔30ul。37oC下继续孵育4h，离心去上清液，每孔加入DMSO 120ul，室温振荡，30min内用酶标仪测定波长490nm处的OD值，OD值与活细胞成正比1718。 评定方法：以阴性对照组的OD值作为100%细胞增殖率，则试验组的细胞增殖率用下面公式计算：细胞增殖率（RGR）=试验组OD值/阴性对照组OD值×100%将各浓度组的细胞增殖率转化为0-级的细胞毒性。RGR（%）细胞毒性分级100075995074254912403.3 CP防止长波紫外线（UVA）氧化损伤实验3.3.1 小鼠成纤维细胞（L929）的培养、冻存与复苏培养：L929细胞长成致密单层后，倒掉原培养基，加入0.25%胰蛋白酶2ml，室温消化46min，在倒置显微镜下观察，当细胞间隙变大，大部分细胞圆缩，但没有细胞浮起时，立即倒掉胰酶，用DMEM培养基终止消化,离心沉淀三次，吹打使其分散均匀，以1：3比例连续传代，在37OC 5%CO2孵箱中培养19-20。冻存：细胞长成致密单层后，胰蛋白酶消化分散，用冻存液稀释至细胞数为2×1065×106个/ml。将细胞悬液分装于冻存管内，1 ml/支，于液氮内保存20。复苏：为使冻结细胞复苏，将细胞悬液置于37 oC水浴中，使其迅速融化。用培养液洗涤一次，在37OC 5%CO2孵箱中培养21。 3.3.2 UVA对L929细胞活性的影响将对数生长期的细胞随机分为2组：空白组（不经UVA辐射，无CP）和UVA模型组，调整细胞浓度为2×1053×105个/ml，接种到96孔培养板。在无菌条件下，距离UVA灯管约20cm，分别照射30min、60min、90min，辐射强度分别为9J/ cm2、18 J/ cm2、27 J/ cm2。辐射后细胞继续培养2h，进行MTT实验，在490nm波长处用酶标仪测定各孔的吸光值，以细胞抑制率公式计算：细胞抑制率=对照组OD值-实验组OD值/对照组OD值×100%3.3.3 CP对细胞UVA氧化损伤的保护作用将对数生长期的细胞随机分为6组：空白组（不经UVA辐射，无CP）、UVA模型组、UVA+ 100%CP组、UVA+50%CP组、UVA+ 25%CP组，UVA+ 12.5%CP组。UVA辐射，方法同3.3.2。用胰酶消化收集细胞，离心取上清液进行MDA测定，用超声波细胞粉碎机粉碎细胞后，进行GSH-px测定。以上实验均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。实验数据采用SPSS 11.0统计软件包进行单因素方差分析。4 结果4.1 CP的制备4.1.1 型胶原蛋白的粗提酸溶法可以得到6.7g的胶原蛋白粗产品；中性盐溶液法可得5.2g；酶解法可得12.3g。以上三种提取胶原的方法，从提取率方面考虑，以酶解法的产量最高，其次是酸解法，而中性盐溶液法提取效率最低。 4.1.2 高效液相色谱法纯化CP猪皮粗提液经不同浓度NaCl盐析后，在RP-HPLC C18半制备色谱柱出现两个峰，主要峰的保留时间为14.348（见图1）；在相同的色谱条件下，型胶原蛋白标准品的保留时间为14.251（见图2），样品与标准品的保留时间基本一致，收集主峰。 图1型胶原粗提液的半制备色谱图 图2型胶原标准品的半制备色谱图Fig. 2 HPLC chromatograph of semi-preparative CPstandard sampleFig. 1 HPLC chromatograph of semi-preparative CPcrude extract 4.2 CP的理化性质鉴定4.2.1 37 OC凝结试验 PBS溶解的胶原冻干品在4OC下成液态，在37OC下呈固态，这一性质与资料报道的型胶原蛋白性质相符2223。4.2.2 紫外吸收值测定图3是0.05%胶原溶液的紫外吸收光谱图，最大吸收值为223nm。 图3 型胶原蛋白的紫外吸收光谱 Fig. 3 UV spectroscopy of Collagen Protein4.2.3 CP的氨基酸组成及含量分析4.2.3.1 羟脯氨酸含量测定将羟脯氨酸标准品的浓度（ug/ml）与吸光度的测定结果进行回归，回归方程为：y=0.1255x。相关系数R2=0.9918，此标准曲线线性关系良好，见图4。将CP按标准曲线测定方法测定其吸光度，按回归方程换算出CP样品中的羟脯氨酸浓度，最后计算得到羟脯氨酸含量为11.75%。 图4 羟脯氨酸标准曲线Fig. 4 Regression Curve of Hydroxyproline4.2.3.1氨基酸含量测定（除羟脯氨酸外）氨基酸组成及含量结果如表1所示。表1 型胶原蛋白的氨基酸组成Table 1 Amino acids composition in CP氨基酸名称样品中氨基酸含量*标准品中氨基酸含量*氨基酸名称样品中氨基酸含量*标准品中氨基酸含量*Asp5.646.03Met0.810.79Thr0.771.17Ile1.451.61Ser2.403.01Leu2.923.14Glu9.449.40Tyr0.620.50Pro13.2112.04Phe2.282.19Gly29.3930.69Lys2.792.76Ala7.476.05His0.730.68Cys0.240.15Arg5.435.34Val1.872.05*氨基酸含量即每100个氨基酸残基中所含的氨基酸个数4.2.4 蛋白质浓度测定以标准蛋白的浓度（mg/ml）为横坐标，A值为纵坐标，测得的直线回归方程为：y=0.2178x，R2=0.9912，此标准曲线线形关系良好，见图5。将本试验制备的CP按标准曲线测定方法测定其吸光度，按回归方程换算出本样品的实际浓度为1.03mg/ml。 图5 蛋白质浓度标准曲线 Fig. 5 Regression curve of protein4.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳图中左边为标准蛋白，1为钙调素结合蛋白（分子量为130,000）；2为兔磷酸化酶B（分子量为97,400）；3为牛血清白蛋白（分子量为66,200）；4为兔肌动蛋白（分子量为43,000）；5为牛碳酸酐酶（分子量为31,000）。中间为型胶原蛋白标准品。右边为本实验样品CP。将CP与其标准品的SDS-PAGE凝胶电泳图谱相对照，谱型一致，证明本实验所制备的CP确实为型胶原蛋白，从上至下依次是链（分子量为130,000）、链（分子量为98,000）、链（分子量为97,200）。图6型胶原蛋白电泳图Fig. 6 Electrophoresis of CP4.2.4 RP-HPLC分析CP经高效液相色谱半制备柱分离纯化后的产物用分析型RP-HPLC分析，结果为一单峰，见图7，面积归一法定量结果为100%。图7 型胶原蛋白的分析色谱图Fig.7 Analysis HPLC chromatograph of purified CP4.2.4.1 精密度实验结果见表2，CP标准品溶液的峰面积测定值的RSD为1.12% ，保留时间测定值的RSD为0.66%，说明该色谱检测方法稳定、精密度好。表2 精密度实验结果（n=5）Table 2 Resluts of precision experimentFrequencyRetTime(min)Area (mAU)13.5714871.31523.6014971.36533.6314982.16343.6164996.12353.6245012.478RSD0.66%1.12%4.2.4.2 重现性实验表3是在5个不同时间经HPLC分析同一批胶原蛋白粗提取物的峰面积和保留时间值。峰面积测定值的RSD为1.99%，保留时间测定值的RSD为0.87%，结果表明该制备方法稳定、重复性好。表3 重复性实验结果（n=5）Table 3 Resluts of reproductivity experimentFrequencyRetTime(min)Area (mAU)13.6214779.36423.5894875.36533.6134995.23043.6734996.16353.6084997.026RSD0.87%1.99%4.2.7 生物安全性试验4.2.7.1 急性毒性试验将CP以腹腔注射方式注入到小鼠体内，7d观察期内，试验组10只小鼠均无死亡、惊厥、瘫痪、呼吸抑制等不良反应，活动正常，饮食饮水正常，均出现体重增加现象，与生理盐水阴性对照组一致。4.2.7.2 皮肤致敏试验在24h、48h、72h时豚鼠注射点无红斑及水肿情况，说明所提取的CP无致敏反应，与生理盐水阴性对照组无差异。4.2.7.3 细胞毒性试验成活的NIH 3T3细胞加入MTT后可形成结晶。各试验组的OD值、细胞相对增殖率和细胞毒性分级结果见表4。表4 各组OD值、RGR和细胞毒性分级Table 4 Grade of OD、RGR and cellular toxicity时 间分 组OD值（±s）RGR细胞毒性分级24小时阴性对照组100% CP组50% CP组25% CP组12.5% CP组0.976±0.2110.925±0.3240.945±0.2680.973±0.2710.991±0.2711009597100>10000048小时阴性对照组100% CP组50% CP组25% CP组12.5% CP组1.245±0.4321.057±0.3381.099±0.3011.255±0.4911.395±0.3561008588100>10000072小时阴性对照组100% CP组50% CP组25% CP组12.5% CP组1.745±0.2331.578±0.3921.614±0.4481.753±0.3911.794±0.3571009092100>1000004.3 CP防止长波紫外线（UVA）氧化损伤实验4.3.1 UVA对L929细胞活性的影响 见表5，随着UVA辐射时间的延长，MTT实验检测细胞的OD值由0.842下降到0.494，在照射时间为90min