实验4乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白.ppt

生物化学实验之,山东师范大学生命科学学院,实验四 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,【实验目的】 学习乙酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关操作技术。,【实验原理】 电泳:带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的方向泳动的现象。 由于被分离物质所带电荷的性质、数量和分子的大小以及形状不同，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率（）不同。因此，经过一定时间电泳后即可被,分离开来。利用此性质，将混合物中各组分进行分离分析的方法称为电泳法。,影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。 影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。,血清蛋白 组分,血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH8.6，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条主要区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白。,【实验材料与试剂】 （一）醋酸纤维薄膜（2×8 cm）、电泳仪、电泳槽、点样器（盖玻片）、载玻片、培养皿、镊子 （二）新鲜血清、巴比妥/钠缓冲液（pH8.6， 离子强度0.07）、染色液（氨基黑10B）、漂洗液,【实验步骤】 1. 薄膜的处理 将醋酸纤维薄膜置于盛有巴比妥/钠缓冲液的平皿中，浸泡30 min以上。 用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸去多余的缓冲液，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上）。,用毛细管取一滴血清，滴在另一 载玻片上，用盖玻片的一侧边在血清上均匀蘸一下，再轻轻印在薄膜点样处片刻，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。,2. 点样,3. 电泳 将薄膜平贴在电泳槽支架上，点样端在阴极。两端用已浸透缓冲液的纱布压住（引桥）。, 盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10 min。 连接电源、电极线。, 通电，调节电压至100 V，电流强度为0.40.6 mA/cm膜宽度，电泳时间约45 60 min 。,4. 染色 电泳完毕后将薄膜取下, 放在氨基黑10B染色液中浸泡5 10min。,5. 漂洗 将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。,+,-,【注意事项】 1. 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的选择与浸润是电泳成败的关键之一。若浸透后的薄膜色泽均匀，深浅一致，则可用于电泳 。 2. 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.09 mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。,3. 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果 。 4. 点样时，点样不要过多，恰到好处，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。,5. 放薄膜的时候要注意放平，与纱布充分接触，但不要接触点样端 。 6. 电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散 。,