8-芡中药资源化学研究.ppt

代表性水生药用植物芡资源化学研究 与资源有效利用,南京中医药大学 吴启南 二0一三年十一月二十三日,全国中药资源化学研究与资源有效利用的新思路新方法 暨“中药资源与开发”专业系列规划教材师资培训研讨班,一、水生药用植物资源简介 二、芡的品种资源概述 三、芡的资源生产现状 四、芡的资源化学研究 五、芡的资源有效利用,目 录,一、水生药用植物资源简介,一、水生药用植物资源简介,根据中华本草、中药大辞典及中国海洋湖沼药物学等记载，初步统计结果表明，目前，药用水生植物约有262种；隶属于72科154属。 其中被子植物：62科，248种，涉及双子叶植物42科，178种，单子叶植物20科，70种； 裸子植物：1科，1种； 蕨类植物：9科13种。,一、水生药用植物资源简介,湿生植物：千屈菜、半枝莲、鱼腥草等。,植物,挺水植物：泽泻、黑三棱、石菖蒲、蒲黄、莲子等。,浮叶植物(漂浮植物)：芡、眼子菜等。,沉水植物：黑藻等。,一、水生药用植物资源简介,主要化学成分类型 黄酮类：如莲、芡实 、三棱、蒲黄、三白草、鱼腥草、浮萍等； 挥发油类：泽泻、三棱、三白草、鱼腥草、石菖蒲等； 生物碱类：三白草、莲、鱼腥草等； 有机酸类：三棱、蒲黄等。 特征性成分：原萜烷型三萜（泽泻）等。,一、水生药用植物资源简介,主要药理活性 抗菌、抗病毒作用； 增强机体免疫能力； 对心血管系统的作用； 抑制血小板聚集、抑制血栓形成、影响血液流变性； 镇痛，保肝，抗肿瘤，利尿等作用。,一、水生药用植物资源简介,药用水生植物资源开发与利用 药用价值：黑三棱、泽泻民、浮萍等。 食用价值：芡实、莲子、菱、慈姑、鱼腥草等，泽泻的花茎、芡实的茎也可食用。 水环境治理价值：石菖蒲、长苞香蒲、芦苇、水薄荷常用于水污染的生物治理和环境修复。 其他价值：园林水景的重要造景素材；芦苇、黑三棱的茎、叶可编织成生活用品；荷叶、芦苇叶可作为食品加工的辅助材料等。,二、芡的品种资源概述,芡实 为睡莲科植物芡Euryale ferox Salisb. 的成熟种仁。 始载于神农本草经，历版药典中均有记载。 具有益肾固精，补脾止泻，祛湿、止带的功效。 主治梦遗、滑精、遗尿、尿频、脾虚久泻、白浊、 带下。,本草品汇精要,芡茎三月生叶贴水，大于荷叶，皱纹如 榖，蹙衄如沸，面青背紫，茎、叶皆有刺。其茎长至丈余，中亦有孔有丝，嫩者剥皮可食。五六月生紫花，花开向日结苞，外有青刺，如猬刺及栗球之形。花在苞顶，亦如鸡喙及猬喙。剥开内有斑驳软肉裹子，累累如珠玑。壳内白米，状如鱼目。,本草纲目,江南产者其汇红紫光润无刺，自扬而北产者汇有刺而青绿为异。,（一）本草考证,2019/6/15,芡 实 简 介,刺 芡,苏 芡,刺 芡,苏 芡,叶正反面叶脉分枝处均具刺,密生针刺,密被倒向硬刺，果实青色,个体较大,叶反面叶脉分枝处具刺,无刺,无刺，果实污紫色,植 株,椭圆形，暗灰或暗灰褐色,个体较小,正常叶,叶 柄 果 柄 花 柄,萼 片 果 实,种 子,类圆形，橙红色,苏芡,刺芡,芡实及其近缘种药材ITS2 条形码鉴定研究,ITS2条形码序列能够准确鉴别芡实及其近缘种药材，从DNA条形码分子鉴定角度，刺芡和苏芡为一个单倍型，属于同一个物种。,三、芡的资源生产现状,16,全国芡实药材及商品分布图,国内芡实种植地,刺芡,苏芡,4月,5月,6月,7月,8月,9月,10月,2019/6/15,苏州市娄葑镇群力村,2019/6/15,采收加工,乘船用长柄镰刀将果实稍带果柄割下，用网兜将果实捞起,采果工下水用刀采收,堆沤脱果皮,手工剥去个果皮,刺芡,苏芡,2019/6/15,收集的样品,四、芡的资源化学研究,（一）芡的化学成分,1. 黄酮类化合物（flavones）,5，7，4'-三羟基-二氢黄酮,5，7，3'，4'，5'-五羟基二氢黄酮,2.环肽类化合物（cyclic peptide）,（一）芡的化学成分,3. 葡糖基甾醇类化合物（glucityl sterols）,芡实中葡糖基甾醇类化合物主要有：24-methylcholest5enyl-3O- pyranoglucoside、24ethylcholest5enyl-3Opyranoglucoside、24 ethylcholesta5, 22Edienyl-3O- pyranoglucoside 3种吡喃糖苷，它们可能是芡实的活性物质成分。此外，还有木脂素苷、异落叶松树脂醇-9-O-D-吡喃葡萄糖苷。,4. 烷烃类化合物及不饱和脂肪酸（alkane and unsaturated fatty acid）,（一）芡的化学成分,5. 脑苷脂类化合物（cerebrosides）,（一）芡的化学成分,6. 倍半木脂素类（sesquineolignans）,7 . 其他化合物: 芡实所含的化合物类型较多，除上述类型化合物外，尚含有-生育酚、-生育酚和-生育酚、多糖、多酚等化合物。,1、指纹图谱评价研究,HPLC指纹图谱研究,NIR指纹图谱研究,IR指纹图谱研究,（二）定性研究, HPLC指纹图谱研究, NIR指纹图谱研究,叠加图,标记峰,一阶导数,二阶导数,主峰位,种子类中药淀粉多糖特征, IR指纹图谱研究,3400、2931、1654、1540、1368、1155、1081、1021、858、575cm-1,多O-H、N-H取代,酰胺带，氨基酸多肽类特征峰,多糖特征峰，-糖苷键为主，含少量-糖苷键,淀粉峰, IR指纹图谱研究,2、芡实粉末X射线衍射图谱研究,芡实的X射线衍射在2约为的15º，17º，18º ，23º，26º和29º有较强的衍射峰。 强度大小为18º17º15º23º26º29º。,（二）定性研究,根据前面对芡实粉末x射线衍射的分析，可以初步推断芡实粉 末中淀粉的晶体类型为A型。,淀粉类型,结论,x射线衍射将天然淀粉分为3个基本类型：A、B、C型。 A型：谷类如玉米、小麦、稻米淀粉为特征，在15º，17º，18º和23º有较强的衍射峰 B型：块茎、果实、茎类淀粉如马铃薯，西米以及香蕉和含直链淀粉超过30%40%的玉米淀粉为特征 在5.6º，17º，22º和24º有较强的衍射峰出现 C型：处于A、B两种模式之间，如豆类和其它根类淀粉。包含有A，B型2种晶型,芡实药材的XRD Fourier指纹图谱分析,芡实中的主体成分是淀粉，故芡实粉末的X射线衍射图谱中的衍射峰主要表现为淀粉的特征衍射峰。通过对芡实标准药材的X射线衍射图谱中衍射特征峰的研究，初步推断芡实药材粉末中淀粉的晶体类型为A型。,对芡实淀粉的4个特征衍射峰进行了分析，同时对组成图谱的所有数据作相关系数分析，结果表明不同品种之间相似度极高。,1、水溶性蛋白含量测定,（二） 定量研究,各产地水溶性蛋白质均值为0.4577mg/g。长江流域南方北方,2、氨基酸含量及营养评价,2019/6/15,方法： 氨基酸自动分析仪法 色谱条件 ：波长570nm（其他氨基酸），440nm（脯氨酸），阳离子交换树脂分析柱，柱温57，分析时间40min。 样品准备：磺基水杨酸水解测定游离氨基酸，盐酸水解测定总氨基酸。,种类少，波动大,种类多，含量均衡,种类少，波动大,种类多，含量均衡,种类少，波动大,2、氨基酸含量及营养评价,2、氨基酸含量及营养评价,各种必需氨基酸与WHO/FAO推荐氨基酸模式谱比较（mg/100g 蛋白质）,结果表明芡实中人体必需氨基酸配比合理，是一种优质的膳食蛋白。与各类食品氨基酸模式相比，芡实蛋白与谷物蛋白相似。同时，芡实蛋白又需与牛奶、肉类等优质蛋白配合食用，互补各自的氨基酸缺陷，才能达到膳食配比更合理更健康。,第一限制性氨基酸,第二限制性氨基酸,2019/6/15,除蛋白前后：粗多糖纯度为73.25%，精多糖为76.22%； 粗多糖蛋白质含量为6.27%，精多糖为1.39%。,2019/6/15,理化性质,均一分子量,均一分子量,未知,3、多糖成分含量与分离鉴定,单糖组成 HPLC-RID,3、多糖成分含量与分离鉴定,紫外全波长扫描图,葡萄糖回归曲线图,4、HPLC测定芡实中维生素E的含量,图1 VE标准品及样品的HPLC图 Fig.1 HPLC chromatograms of vitamin E from standard and sample A：VE标准品 B：芡实样品 1、-生育酚 2、+-生育酚 3、-生育酚,A,B,表 不同产地芡实中不同构型VE含量测定结果 Tab. sult of determination of different configuration of vitamin E from 15 habitats,5、 不同产地芡实中8 种无机元素含量比较,表1 不同产地芡实中8种无机元素含量 g/g，n=6）,微波消解-火焰原子吸收光谱法测定了4 种不同产地芡实中Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Mn、K和Na的含量，比较了不同产地芡实中w（Zn）/w （Cu）比值。结果表明，广东芡实中w（Zn）/w（Cu）比值最高，山东和湖北芡实中w（Zn）/w（Cu）较低，从微量元素的医疗保健功效角度来看，广东芡实的品质优于其他产地。,6、汞污染芡实根部过氧化物酶活性的动态变化,重金属离子污染对植物过氧化物酶活性的影响有着时间和浓度上的动态变化。汞污染对芡实根部过氧化物酶活性随时间延长呈下降趋势。在受害时间相同的条件下，酶活性随着培养液中Hg2+浓度的升高而呈现下降的趋势。,7、芡实对重金属富集的动态变化,印度加尔班地区的九大湖泊中芡实对重金属Pb、Cr、Cu、Cd富集能力有差异性，但总体呈现PbCrCuCd的趋势，且存在年份上的不同。提示芡实对重金属的富集性与水体及土壤沉积物中重金属含量有关。,五、芡的资源有效利用,1、芡实多糖、果壳多酚体内外抗氧化实验,（一）药效学研究,2019/6/15,多糖,多酚,（1）一般情况（饮食情况、体重变化、脏器系数）,1.1 抗疲劳耐缺氧实验,1、芡实多糖、果壳多酚体内外抗氧化实验,（2）行为学实验（力竭游泳）,运动指标,（3）抗应激实验（常压耐缺氧）,对肝NO不明显,代谢指标,（4）运动与代谢指标（糖原、LDH、NO、BUN）,1.2 体内抗衰老实验研究,（1）一般情况测定 饮食情况、体重变化、脏器指数 （2）抗氧化酶活性 T-SOD（黄嘌呤氧化酶法）、CAT（钼酸铵法）、GSH-PX（DTNB法）、HYP（二甲氨基苯甲醛比色法） （3）脂质过氧化产物水平 MDA（TBA）、 MAO（苄胺比色法） （4）组织病理切片 （光镜）,1、芡实多糖、果壳多酚体内外抗氧化实验,（1）一般情况测定,（2）抗氧化酶活性,2019/6/15,启动抗氧化防御机制,启动抗氧化防御机制,自由基攻击较为严重并出现了脂质过氧化损伤,自由基攻击较为严重并出现了脂质过氧化损伤,2019/6/15,多糖,启动抗氧化防御机制,无差异,2019/6/15,启动抗氧化防御机制,启动抗氧化防御机制,启动抗氧化防御机制,自由基攻击较为严重并出现了脂质过氧化损伤,自由基攻击较为严重并出现了脂质过氧化损伤,启动抗氧化防御机制,（3）脂质过氧化产物水平,2019/6/15,启动抗氧化防御机制,启动抗氧化防御机制,2019/6/15,“-”无病变，“+”轻度变性，“+”中度变性，“+”重度变性。,病理切片结果,（4）组织病理切片,2019/6/15,（1）清除羟基自由基（·OH）活性的测定 （2）清除超氧负离子自由基（O2-·）活性的测定 （3）清除对亚硝基活性的测定 （4）清除DPPH 自由基活性的测定 （5）猪油（POV值） （6）还原能力,1.3 体外抗氧化研究,1、芡实多糖、果壳多酚体内外抗氧化实验,2019/6/15,0.095 1.214 0.737 1.687,0.463 0.999 0.873 1.749,2019/6/15,0.129 1.719 0.783 1.553,0.001 0.034 0.026 0.826 0.001,纯化多酚接近VC、TBHQ,2019/6/15,0.498 1.253 0.986 2.267,1.270 2.075 1.670 3.021,2019/6/15,明显,最强,多糖及种皮多酚药效研究结果小结,1.抗疲劳耐缺氧试验结果表明，与VC、VE组相比，各剂量多糖组和种皮多酚组小鼠负重游泳时间和常压密闭耐缺氧时间均延长，显著提高了小鼠的抗应激能力，且量效关系明显。 2.小鼠活动能力、食量、精神状态、日均体重增加量、脏器系数明显优于空白对照组和阳性药物组，增加小鼠肝糖原、肌糖原、降低血清BUN、提高小鼠血清LDH、增加组织和血清中NO含量，均证实芡实多糖及其种皮多酚确实具有延缓衰老的作用。,多糖及种皮多酚药效研究结果小结,3.对D-半乳糖致小鼠衰老模型，能提高组织和血清中SOD、CAT、GSH-Px、Hyp活性，降低MAO活性，阻断脂质过氧化过程，减少MDA的生成，从而有效地清除ROS。同时能够缓解造模所致衰老小鼠的胸腺和脾脏等免疫器官指数下降。 4.体外抗氧化试验证实，芡实多糖、种皮多酚能有效清除·OH、O2-·等自由基，对亚硝胺合成以及亚硝基清除有一定作用，对DPPH·及其灵敏，对含脂食品的自动氧化防止有一定帮助，还原力大于同浓度下阳性药VC和TBHQ，可用于一些因氧自由基损伤所引起的疾病的治疗。,D-半乳糖造模,小鼠42天平均日增重及脏器指数比较,小鼠旷场行为学考察,2、 芡实提取物的抗衰老实验,中医学认为，髓由肾中精气化生，髓聚而成脑，故补肾填精类中药是治疗脑病之首选。,75,注：与空白组相比，#P0.05，#P0.01；与模型组相比，*P0.05，*P0.01。,2.1对小鼠体重的影响,2.2芡实提取物对小鼠脏器指数的影响,只有芡实正丁醇提取物低剂量组各脏器指数与模型组相比均有明显差异； 只有在脾指数指标上，芡实各提取物组与模型组相比均有明显差异； 只有在肾指数指标上，芡实各提取物组与空白组相比均有明显差异。,77,Page 77,2.3水迷宫行为学考察Morris水迷宫装置,外观图,2.4小鼠旷场试验,外观图,2.5组织学考察（脑衰老及器官衰老情况）,芡实提取物对衰老小鼠体内脏器组织T-AOC的影响,综合分析，在总抗氧化能力上，只有芡实正丁醇提取物对三种脏器组织均有作用，且效果较优。,芡实提取物对衰老小鼠脑组织NOS和Na+K+-ATP酶的影响,芡实各提取物组小鼠脑组织Na+K+-ATP酶活力均较模型组明显增强。,芡实各提取物组小鼠脑组织AChE活性均较模型组明显降低，除乙酸乙酯提取物低剂量组外，其它各提取物组小鼠脑组织ChAT 活性均较模型组显著性升高。其中，在脑组织ChAT活性表现方面，芡实各提取物作用均较明显。,芡实提取物对衰老小鼠脑组织TChE和ChAT的影响,模型组海马区p53基因蛋白的表达,脑组织海马区形态及p53基因蛋白表达,正常组海马区p53基因蛋白表达,对模型小鼠海马细胞形态学的影响,SH-SY5Y神经母细胞（H2O2氧化损伤保护实验）,实验结果表明，18.75µmol/L以下浓度H2O2对SH-SY5Y细胞存活率影响不明显。而自18.75 -600µmol/L的H2O2作用于SH-SY5Y细胞4h后，细胞存活率呈下降趋势，且与H2O2浓度有一定线性关系。,不同浓度H2O2对SH-SY5Y细胞存活率的影响,不同浓度芡实提取物对SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制率,芡实各提取物有明显的细胞保护作用，可抑制细胞免受氧化损伤，且随提取物浓度的升高，该表现越来越明显，其中尤以正丁醇提取物的细胞保护作用最强。,芡实抗衰老研究小结,结果显示，芡实80%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均能不同程度改善亚急性衰老小鼠的学习记忆能力，提高小鼠脑、肝、心组织T-AOC、T-SOD、GSH-Px 活性及脑组织NOS、Na+K+-ATPase、ChAT 活性，减少MDA 含量，降低AChE 活性，抑制海马区细胞凋亡或病变，减少p53 基因蛋白表达。 其中，芡实正丁醇提取物延缓衰老的作用强于80%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物。 芡实提取物延缓衰老的作用机制：可能是通过促进机体清除脂类过氧化物，增强组织抗氧化能力及提高脑内ACh 含量等多方面共同实现的。,芡实提取物GC-MS 成分分析,80%乙醇提取物,乙酸乙酯提取物,正丁醇提取物,3.1种皮多酚提取工艺及质量标准,3. 综合利用与开发,2019/6/15,3.1种皮多酚提取工艺及质量标准,3. 综合利用与开发,2019/6/15,种皮多酚含测 方法：中国药典2010版一部附录62XB 可吸附多酚含量(mg/g) = 总酚含量(mg/g)-不被吸附的多酚含量(mg/g),3.1种皮多酚提取工艺及质量标准,最佳条件为：丙酮浓度57.438%、液料比56.880mL/g、超声时间23.358 min，此时芡实种皮多酚的提取率达114.00mg/g。 考虑到实际操作的便利，确定芡实种皮的超声提取工艺条件为：丙酮浓度57%、液料比57mL/g、超声时间23min。,2019/6/15,响应面设计实验方差分析,液料比超声时间丙酮浓度,Y=111.36-0.57958*A+5.9166*B+3.3669*C-2.4960*A*B+1.0041*A*C+1.2624*B*C-7.6530* A2-4.8340*B2-6.1290* C2,3.1种皮多酚提取工艺及质量标准,纯化多酚,D101大孔树脂纯化,3.1种皮多酚提取工艺及质量标准,2019/6/15,芡实种皮原料技术指标,芡实种皮栲胶技术指标,脱色后即可 当栲胶使用,3.1种皮多酚提取工艺及质量标准,3.2芡茎有效利用与开发,3.2.1芡茎营养性成分分析 （1）氨基酸含量测定 （2）无机元素测定 （3）多糖、水溶性蛋白、脂肪含量 3.2.2 芡茎多糖提取、分离、体外抗氧化研究 3.2.3 芡茎总酚、总黄酮提取 3.2.4 降血糖试验 （1）芡茎多糖降血糖试验 （2）芡茎总酚提取物降血糖试验 （3）芡茎不同提取部位降血糖试验 （4）对正常小鼠血糖调节试验,3.2.5调血脂试验 对正常小鼠血脂的调节试验 3.2.6芡茎化学研究 （1）芡茎不同提取部位的HPLC-MS分析 （2）芡茎石油醚部位GC-MS分析 （3）芡茎不同提取部位化学成分分析,3.2芡茎有效利用与开发,芡茎的研究结论,1.芡茎样品中均含有17种氨基酸，不同产地芡茎的氨基酸含量有较大差异。各样品含有的氨基酸所占比例基本相近。 总氨基酸含量和必需氨基酸含量均高于藕、水芹、茭白等常见的水生蔬菜，符合FAO/WHO对理想蛋白源中必需氨基酸与总氨基酸比为40%左右，必需氨基酸与非必需氨基酸比在60%以上的规定。 2.体外抗氧化实验结果显示：芡茎粗多糖及各分离组分均具有一定的清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基能力及还原能力；其中芡茎粗多糖EFPP的体外抗氧化能力明显高于各分离组分。 芡茎多糖能够降低四氧嘧啶诱发糖尿病小鼠血清TG及TC水平，增加HDLC水平，降低LDLC水平。,芡茎的研究结论,3.芡茎总酚提取物能降低四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠血糖水平、增加血清胰岛素水平、葡萄糖激酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶水平，对体重及血清糖化蛋白的影响不大。 芡茎多酚提取物能够增加四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠肝、肾T-AOC能力、 GSH-Px、CAT、SOD水平，降低肝、肾MDA及MAO水平 4.芡茎不同萃取部位能降低四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠血糖水平、增加血清胰岛素水平、葡萄糖激酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶水平，对体重的影响不大。,3.3芡现已有专利情况,Thanks,