第7章蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

第7章 蛋白质的分离、纯化和表征,Protein Separation, Purification and Characterization,因材施法，有的放矢,Protein Purification and Characterization,对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生物与化学分子的独特的性质）和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。,Protein Purification and Characterization,分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括： 分子的大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力,Protein Purification and Characterization,The aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest,Protein Purification and Characterization,.1 蛋白质的酸碱性质 Ionization of protein 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点 (isoelectric point, pI)。,沉淀技术,Ionization of protein,蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下可以发生明显的变化。 蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。 没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(isoionic point)。,acid excess positive charge Cation exchanger,isoelectric point balanced positive and negative charge,alkaline excess negative charge Anion exchanger,3,10,pH,_,+,Overall charge on protein,The overall charge on a protein depends on pH,Ionization of protein,7.2 蛋白质分子的大小与形状 Protein size and shape 7.2.1 根据化学组成测定最低相对分子质量 铁的原子量 铁的百分含量= ×100 最低相对分子质量 铁的原子量 最低相对分子质量=×100 铁的百分含量,55.8 例如，肌红蛋白相对分子质量=×100 0.335 =16700 用其他物理化学法法测得的 肌红蛋白Mr与此极为接近，可 见肌红蛋白分子中只含一个 铁原子。,Protein size and shape,7.2.2 渗透压法测定相对分子质量 渗透与渗透压,渗透压法测定相对分子质量 溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向净移动现象称为渗透(osmosis)。 渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压（osmotic pressure)。 渗透压是单位体积内溶质质点数的函数，而与溶质的性质和形状无关。,在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的关系为： = RT(c/Mr + K c2 ) Mr = RT/ lim/c c0,渗透压法测定相对分子质量,7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数 扩散（diffusion） dm/dt =-DA dc/dx D 扩散系数， A 扩散面积 扩散系数随Mr的增加而降低。 但扩散系数对Mr的变化并不敏感，一般不单独用来确定Mr。,7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量 蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。 沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。 沉降速率法 沉降平衡法,沉降分析法测定相对分子质量,离心机 转速 60 000-80 000rpm 离心力 400 00- 700 000g,沉降分析法测定相对分子质量,离心力 42 v 2 r F = - g F :离心力，单位以地心引力的倍数g表示（即g 或×g） g :重力加速度，等于980.6 cm2/s2. r : 通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离（cm） v :为转速，即离心机每秒的转数，若以每分钟转数（rpm）表示，则上式应为 42 v 2 r F = - （1/60）2 g,7.2.4.1 沉降速率法 沉降界面 n单分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力的关系： nFc- Fb= Ff n dx/dt mp(1-) = 2 f dx/dt s= 2,单位离心场的沉积速度是个定值，称为沉降系数（sedimentation coefficient)或沉降常数。 蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1×10-13 到200×10 - 13 秒的范围。 10 - 13 秒作为一个单位，斯维得贝格单位或沉降系数单位，即S。,沉降分析法测定相对分子质量,7.2.4.2 沉降平衡法 利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度（8000 -20000r/min）的离心场中进行的。 蛋白质的沉降平衡（图7-3）,沉降分析法测定相对分子质量,在时间dt内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量： dm=-cA dx/dt dt 因此扩散作用沿相反方向越过横截面A的溶质量： dm=- DA dc/dx dt,沉降分析法测定相对分子质量,当净离心力与扩散力平衡时，在离心池内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度，因此： 2RTdln(c2 / c1) Mr = (1-) 2(x22-x12),沉降分析法测定相对分子质量,7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量 Gel filtration chromatography 凝胶过滤法的原理,Gel filtration chromatography,Size exclusion chromatography Molecular sieve（筛子） chromatography Molecules are separated on the basis of their size and shape. The protein sample in a small volumes is applied to the top of a column of porous(有孔的) beads that are made of an insoluble but highly hydrated （亲水的）polymer such as polyacrylamide (Bio-Gel) or the carbohydrates dextran （葡聚糖 ）(Sephadex) or agarose (琼脂糖) (Sepharose), Small molecules can enter the pores in the beads whereas larger or more elongated molecules cannot. The smaller molecules therefore have a larger volume of liquid accessible （可接近的） to them; both the liquid surrounding the porous heads and that inside the beads., In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first. The smaller molecules move more slowly through the column and elute later.,层析柱的洗脱体积与分子量的关系： Ve=K1-K2lgM,凝胶过滤法测定相对分子质量,7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 相对分子质量 SDS， 有效变性剂，带负电荷 巯基乙醇，打开二硫键 蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。 Rf = K1-K2 lg M,Electrophoresis of Protein,In polyacrylamide(聚丙烯酰胺) gel electrophoresis (PAGE) proteins are applied to a porous polyacrylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size. Small/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteins,7.3 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀 Protein colloid character and deposition 7.3.1 蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一个分散系统 分散相质点 100nm的为悬浊液， 介于1-100nm的为胶体溶液。,Protein colloid character and deposition,胶体系统的稳定条件： 1 分散相质点的大小 2 分散相质点带有同种电荷 3 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,每克蛋白质分子能结合0.3-0.5克水。 蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及 不能通过半透膜的性质。,Protein colloid character and deposition,The hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of protein,Protein colloid character and deposition,7.3.2 蛋白质的沉淀 沉淀蛋白质的方法 ： 1）盐析法 盐析一般不引起蛋白质的变性 2）有机溶剂沉淀法 脱去水化层及降低介电常数(酒精，丙酮) 3）重金属盐沉淀法 生成不溶性的复合物 4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法 单宁酸，三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸 5）加热变性沉淀法,7.4 蛋白质分离纯化的一般原则 Principles of Protein purification 蛋白质分离纯化的程序包括： 1）前处理 2）粗分级分离 3）细分级分离 4）结晶,7.5 蛋白质的分离纯化方法 Methods of Protein Purification 根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法： 1）分子大小 2）溶解度 3）电荷 4）吸附性质 5）对配体分子的生物学亲和力,7.5.1 根据分子大小不同的纯化方法 7.5.1.1 透析和超过滤 常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸。 透析装置 利用压力和离心力的超过滤装置,Methods of Protein Purification,Methods of Protein Purification,蛋白质的分离纯化方法,密度梯度（区带）离心法 蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也决定于它的密度。,Methods of Protein Purification,Methods of Protein Purification,凝胶过滤 gel filtration chromatography,1903-1906，M. Tswett 将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带，所以称色谱图。,Methods of Protein Purification,Gel Filtration Chromatography 也称： 凝胶过滤层析 分子排阻层析 凝胶渗透层析 分子筛层析 凝胶的交联度和孔度（网孔大小）决定了凝胶的分离分级范围,Gel Filtration Chromatography,常使用的凝胶有： 交联葡聚糖（Sephadex） 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P) 琼脂糖 (Sepharose Bio-gel A),Gel Filtration Chromatography 凝胶过滤的原理： 当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外 比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外 这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得到分离,凝胶过滤,柱层析的基本装置 Column,蛋白质的分离纯化方法,层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨率高。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。,Column,蛋白质的分离纯化方法,凝胶过滤的术语: Vt 凝胶柱床的总（床）体积 Ve 洗脱体积 V0 孔隙体积，外水体积 Vi 内水体积 Vm 凝胶基质体积 Vt = Vi +V0 + Vm,蛋白质的分离纯化方法,Gel Filtration Chromatography,7.5.2 利用溶解度差别的纯化方法 7.5.2.1 等电点沉淀和pH控制,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,7.5.2.2 蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：少量盐促进蛋白质溶解的现象 盐析：大量盐使得蛋白质沉淀的现象,盐析作用 大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水 那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团 随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀 最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,7.5.2.3 有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂（如甲醇，乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。 控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。 介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,7.5.2.4 温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约 0-40 之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。 人的血红蛋白从0-25，溶解度随温度上升而上升。,蛋白质的分离纯化方法,利用溶解度差别的纯化方法,脲或盐酸胍的变性作用,7.5.3 根据电荷不同的纯化方法 7.5.3.1 电泳 Electrophoresis 在外电场作用下，带电颗粒，如不处于等电点的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳,蛋白质的分离纯化方法,Electrophoresis,区带电泳(zone electrophoresis)可分四类： a 滤纸电泳和薄膜电泳； b 粉末电泳； c 细丝电泳； d 凝胶电泳，适于分离蛋白质和多核苷酸、核 酸。,电泳装置主要包括两个部分：电源(电泳仪）和电泳槽。 电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。,Electrophoresis,蛋白质的分离纯化方法,蛋白质的分离纯化方法,Electrophoresis,7.5.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶） 不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有3种物理作用： 1.样品的浓缩效应 2.分子筛效应 3.电荷效应,蛋白质的分离纯化方法,Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE),The greater the net charge the faster the molecule will move. In PAGE the electrophoretic separation is carried out in a gel which serves as a molecular sieve. Small molecules move readily through the pores in the gel, whereas larger molecules are retarded.,The pore sizes in the gel can be controlled by choosing appropriate concentrations of acrylamide（丙烯酰胺） and the cross-linking reagent, methylene bisacrylamide（甲叉双丙烯酰胺）. The higher the concentration of acrylamide used , the smaller the pores size in the final gel.,SDS-PAGE原理,蛋白质的分离纯化方法,Acrylamid 丙烯酰胺 N,Nmethylenebisacrylamide N，N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在330之间。 低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3-4的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于等电聚焦或作为PAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA。 高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用， 可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如1020的凝胶常用于PAGE电泳的分离胶。,SDS-PAGE原理,蛋白质的分离纯化方法,SDS-PAGE,In sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE, the proteins are denatured and coated with an overall negative charge (due to bound SDS) and thus the basis for their separation is only their mass,SDS-PAGE,The protein mixture is first treated with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol（巯基乙醇） or dithiothreitol（二硫叔糖醇） to break all the disulfide bonds. The strong anionic detergent SDS is then added which disrupts nearly all the noncovalent interactions in the protein, unfolding the polypeptide chain.,SDS-PAGE,Approximately one molecule of SDS binds via its hydrophobic alkyl（烷基） chain to the polypeptide backbone for every two amino acid residues, which gives the denatured protein a large net negative charge that is proportional(成比例 的) to its mass,蛋白质的分离纯化方法,7.5.3.3 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis 电泳是在微内径管（一般为50um内径和300um外径）内进行的. 一般管长50100 cm，电压1050 kV，时间1030 min。,蛋白质的分离纯化方法,Capillary Electrophoresis,虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用(electroendosmosis)使他们向负极移动。由于电渗流很强，其速度一般比样品的电泳速度大，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。,/ ,蛋白质的分离纯化方法,蛋白质的分离纯化方法,Capillary Electrophoresis,7.5.3.4 等电聚焦 （isoelectric focusing, IEF） 等电聚焦或称电聚焦(electric focusing,EF) 两性电解质 pH梯度,蛋白质的分离纯化方法,The principle of isoelectric focusing,在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。 同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。 在电场内经过一定时间后，等电点不同的蛋白质混合物的各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。,蛋白质的分离纯化方法,The principle of isoelectric focusing,蛋白质的分离纯化方法,The apparatus of isoelectric focusing,蛋白质的分离纯化方法,Application of isoelectric focusing,1分离等电点不同的蛋白质。 2测定某个未知蛋白质的等电点。 3研究蛋白质微观不均一性。 4. 蛋白质纯化制备。 5用于IEF/SDS-PAGE双向电泳。,蛋白质的分离纯化方法,The principle of isoelectric focusing,Isoelectric focusing electrophoretically separates proteins on the basis of their relative content of positively and negatively charged groups. When a protein is at its pI, its net charge is zero and hence it will not move in an electric field,The principle of isoelectric focusing,In isoelectric focusing, a polyacrylamide gel is used which has large pores and contains a mixture of polyampholytes (small multicharged polymer that have many pI values). If an electric field is applied to the gel, the polyampholytes migrate and produce a pH gradient. Each protein will migrate through the gel until it reaches a position at which the pH is its pI .,双向电泳（2-DE）与蛋白质组学 Two-dimensional gel electrophoresis and proteomics,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。 它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等，是连接基因组序列与基因功能之间的桥梁。,蛋白质的分离纯化方法,双向电泳（2-DE）,低氧蛋白质组的2-D电泳图,蛋白质的分离纯化方法,7.5.3.6 离子交换层析,（Ion Exchange Chromatography，IEC）,蛋白质的分离纯化方法,Ion Exchange Chromatography,In ion exchange chromatography, proteins are separated on the basis of their overall (net) charge. If a protein has a net negative charge at pH7,it will bind to a column containing positively-charged beads, whereas a protein with no charge or a bet positive charge will not bind,The negatively-charged proteins bound to such a column can then be eluted by washing the column with an increasing gradient (increasing concentration) of a solution of sodium chloride (Na+ Cl- ions) at the appropriate pH.,Ion Exchange Chromatography,The Cl- ion compete with the protein for the positively-charged groups on the column Proteins having a low density of negative charge elute first, followed by those with a higher density of negative charge.,Ion Exchange Chromatography,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的不同带电组分与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的能力的差别（与离子交换剂结合力的差别）而进行分离的一种层析方法。 离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。,蛋白质的分离纯化方法,Ion Exchange Chromatography,纤维素离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂 盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。 因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成。 梯度混合器,蛋白质的分离纯化方法,Ion Exchange Chromatography,离子交换层析的原理,离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。,+,+,+,-,-,-,高分子聚合物基质,电荷基团,平衡离子,蛋白质的分离纯化方法,离子交换层析的原理,蛋白质的分离纯化方法,离子交换层析系统的组成,蛋白质的分离纯化方法,离子交换层析的操作流程,1。离子交换剂的选择和预处理 2。装柱 3。平衡 4。加样和淋洗 5。洗脱 6。收集、鉴定及保存 7。基质的再生,蛋白质的分离纯化方法,7.5.4 利用选择性吸附的纯化方法 吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。 材料：硅胶 （硅烷醇Si-OH） 氧化铝 活性炭,蛋白质的分离纯化方法,7.5.4.1 羟基磷灰石层析 结晶磷酸钙 分离蛋白质、核酸,蛋白质的分离纯化方法,7.5.4.2 疏水作用层析 蛋白质存在于分子表面的疏水氨基酸残基的数量是不同的。 连接在支持介质（如琼脂糖）上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。 使用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液。,蛋白质的分离纯化方法,7.5.5 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法- 亲和层析 (Affinity Chromatography),蛋白质的分离纯化方法,亲和层析的原理,蛋白质的分离纯化方法,Affinity Chromatography,Affinity chromatography exploits the specific, high affinity, noncovalent binding of a protein to another molecule, the ligand.,First, the ligand is covalently attached to an inert（惰性的） and porous matrix（基质）. The protein mixture is then passed down a column containing the immobilized（固定化的） ligand. The protein of interest will bind to the ligand, whereas all other proteins pass straight through the column.,Affinity Chromatography,After extensive washing of the column with buffer to remove nonspecifically bound proteins, the bound protein is release from the immobilized ligand either by adding soluble ligand which competes with the immobilized ligand for the protein, or by altering the properties of the buffer (changing the pH or salt concentration),Affinity Chromatography,亲和层析的原理,蛋白质的分离纯化方法,亲和层析的原理,蛋白质的分离纯化方法,加样淋洗,亲和层析的 应用,抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白 金属螯合亲和层析,蛋白质的分离纯化方法,7.5.6 高效液相层析和 快速蛋白液相层析 是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层析技术的发展。 对柱层析来说，载体的颗粒愈小、则分辨率愈高，但是洗脱液的流速也愈慢。为解决这一矛盾，采用高压和颗粒度小而均匀、机械性能强、化学性能稳定的固定项以及其他相应的设备。,蛋白质的分离纯化方法,蛋白质的含量测定与纯度鉴定,实用中经常是多种方法联合使用,7.6 蛋白质的含量测定与纯度鉴定 7.6.1 蛋白质含量测定 凯氏定氮法 双缩脲法 Folin酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法 染料结合法(Bradford法) 胶体金测定法,7.6.2 蛋白质纯度测定 电泳 等电聚焦, PAGE, SDS-PAGE, 毛细管电泳 纯的蛋白呈一条带或峰 沉降 纯的蛋白以单一沉降速度运动 HPLC 纯的蛋白为单一的对称峰 溶解度分析 纯的蛋白质溶解曲线只呈现一个折点,蛋白质的含量测定与纯度鉴定,7.蛋白质的分离、纯化和表征作业,名词解释 等离子点，沉降系数，盐析，盐溶， 密度梯度离心，透析，超过滤 Gel Filtration Chromatography SDA-PAGE， Isoelectric focusing Ion Exchange Chromatography Affinity Chromatography,回答问题： 1.试述根据分子大小不同、溶解度不同、电荷不同分离蛋白质的方法都有哪些? 2.蛋白质含量测定的方法都有哪些？ 3. 书 p317 第 1，5，7，8题 From “Biochemstry” 4. 翻译B4 Myoglobin and Hemoglobin(p48-55) 5.任选一节 翻译Key Notes,7.蛋白质的分离、纯化和表征作业,THE END,