第五章蛋白质结构分析技术.ppt

第五章 结构分析,蛋白质的氨基酸序列分析 生物质谱 X-射线晶体衍射技术 核磁共振 溶液中蛋白质分子构象的研究方法 蛋白质组,第一节 蛋白质和多肽的 氨基酸序列分析,Synopsis: 1. A practical approach to determining amino acid sequence requires a method to remove one amino acid at a time from a polypeptide chain. 2. This is achieved by the use of phenylisothiocyanate（异 硫氰酸苯酯）as the N-terminal labelling reagent, the Edman method. 3. This technique can only deal with chains of 20 to 60 amino acids, and most proteins are much larger. 4. To complete the process, selective hydrolysis of the polypeptide chain cuts very long polypeptides into specific fragments of more manageable size.,N端序列分析 Sanger was the first person to determine a protein sequence, for insulin in 1953. The problem: after labelling the N-terminal amino acid, the polypeptide chain must be hydrolysed to isolate and identify the labelled amino acid. What's needed is a way to remove the first amino acid without having to hydrolyze the whole chain. This was solved by Per Edman, in Sweden in 1956, by using the reagent phenylisothiocyanate to label the N-terminal end of the polypeptide sample.,It works by cleaving the N-terminal AA off and leaving the rest of the peptide intact. The Edman method can be repeated on the peptide remaining after the reaction, so this is a very effective method for obtaining AA sequence information. In fact the whole sequence of a peptide containing many AAs can be determined by Edman method.,降解反应分三步 偶联 PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋白质。 裂解 PTC蛋白质在无水条件下酸裂解，切下反应的那个残基，暴露出下一个自由氨基。 转化 ATZ氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH氨基酸。 PTH氨基酸的鉴定 薄层层析，HPLC, GC(气相色谱），质谱分析等。,蛋白质N端测序仪器分析法： 1. 液相旋转杯序列仪 最早，很少用 2. 固相序列分析仪 有些氨基酸不能正确测定 3. 气相顺序仪 灵敏度很高，降低费用 4. 新型蛋白测序仪 快速可靠，高自动化,二. C端序列分析 适用 1. 鉴定重组蛋白是否正确表达 2. 大规模生产时质量控制 3. N端封闭蛋白的分析 4. DNA探针的设计 原理 化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应， 反应后的C末端衍生物被切割下来，通 过HPLC系统进行分析。,步骤 活化 酰胺化保护侧链羧基 烷基化 修饰Thr和Ser的羟基 裂解和衍生,第二节 生物质谱技术,Mass Spectrometry (MS) 是带电原子，分子 或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。 软电离技术： 离子化过程中不会破坏分子结构 电喷雾电离（ESI ) (Fenn et al. 1989) 基质辅助激光解析电离（MALDI) (Karas and Hillenkamp,1998) 质谱仪组成： 离子源，质量分析器，检测器,MALDI MS 电离基本原理： 将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。 The MALDI instrument is a matrix assisted laser desorption ionisation - time-of-flight （TOF) mass spectrometer，specifically for high throughput mass mapping of peptide digest fragments originating from proteins excised from 2D-gels i.e. proteomics.,MALDI离子源 电离技术的关键-基质的使用 基质的作用：样品离子形成过程中充当 质子化或去质子化试剂，使样品分子带 上正电荷或负电荷。 常用基质： SA(芥子酸） DHB(龙胆酸） CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸）,2. 质量检测器 1） 线性分析时间检测器（TOF) 优点：质量分析范围100Da100kDa 不足：分辨率和测量准确度低 2）反射分析时间检测器（RETOF) 分析质量数10kDa以下的离子 3. 样品制备,二. ESI MS 电离方法：靠强的电场使分子电离。分析 物溶液流经一个细细的进样针，针头上加 高电压用来产生正离子。高电压导致样品 液流分散为呈喷雾状的带电荷的微小滴。 当液滴从针尖通往入口时，在定向惰性气 体流作用下，溶剂蒸发，液滴缩小，电荷 密度增加，最终液滴爆裂，离子从液相中 释放出来进入气相。 ESI MS 优势：可与多种分离技术联合 使用，如LC MS, HPLC MS 等。,It is operated with electrospray ionisation and samples can be introduced into the mass spectrometer by a number of different techniques.,The Q-Tof is a tandem mass spectrometer (MS/MS) with two analysers 。,The first being a quadrupole analyser the second analyser is a reflectron time-of-flight analyser,In MS/MS mode, the two analysers are used together for structural studies by monitoring fragmentation patterns in molecules.,The TSQ 7000 is a tandem quadrupole mass spectrometer equipped with elecgtrospray and nanospray ionisation.,The TSQ 7000 has a range of MS/MS capabilities: precursor ion scanning, product ion scanning and constant neutral loss scanning, which make the instrument ideal for the structural characterisation of a wide range of bio- and organic molecules, and is particularly useful for identifying post-translational modifications.,分子量测定 肽谱测定 多肽和蛋白质序列测定 巯基和二硫键定位 蛋白质翻译后修饰 蛋白质复合体分析 蛋白质组研究,应用,Horse heart myoglobin can be analysed either with the haem molecule attached to the protein by non-covalent interactions using neutral aqueous conditions, or in the denatured state (without the haem molecule) using acidified organic solvents. Under neutral conditions (upper trace) the protein remains folded and so has only 8 or 9 sites which are exposed for ionisation; also the haem ligand remains bound and the mass measured is 17,564.9Da. Under denaturing conditions (lower trace) the protein is much more highly charged (n = 9 to 28) due to the higher number of sites exposed in the unfolded state, and as the haem ligand is no longer bound the mass measured is 16,951.6 Da.,Monitoring the modification of a Class I aldolase (MW 37979.3 Da) (lower trace)was achieved by ESI-MS. The modification involved the covalent addition of dihydroxy acetone phosphate, thus increasing the molecular weight to 38,134.3 Da (upper trace).,第三节 X射线晶体衍射技术,X ray diffraction method 使用X射线作为物理工具，间接地研究 蛋白质晶体的空间结构。 X ray diffraction techniques give information about the structure of solids, that is, the arrangement of the atoms that compose the solid.,X射线晶体衍射的基本原理,利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。,蛋白质X射线晶体结构测定的基本过程： 经基因克隆，表达后生成的蛋白质提纯； 晶体生长并经冷冻处理； 重原子衍生物制备； 衍射数据收集； 衍射数据分析和改进； 获得最后的结构模型（包括修正）。,Procedure Grow Crystal Collect diffraction patterns-intensities only Native Heavy atom derivatives Calculate phases Calculate electron density map Fit atoms into eletron density map Refine structure-modify atomic model until it fits diffraction patterns,1. 对原材料的要求 应具有高度均一性 2. 晶体生长的生化，物理条件 pH值，离子强度，温度等 3. 技术和方法 分批静置法(batch method) 悬滴法(hanging drop) 4. 蛋白质晶体的鉴定,一. 蛋白质结晶和晶体生长Crystallization,1. 晶体的收集和处理 2. X射线源的选择 阳极靶式 同步加速器辐射 3. 衍射线记录装置 照相底片或图像板（对X射线敏感） 计数管或面探测器 4. 衍射数据收集的全自动化,二. 衍射数据收集 Data collection,1. 数据的统一和还原 2. 同晶置换法 single/multiple isomorphous replacement(SIR/MIR) 3. 分子置换法 Molecular replacement (MR) 4. 多波长反常散射法 Anomalous scattering and multiple wavelength anomalous dispersion（MAD） 5. 差值电子密度法,三. 确定位相 Phasing核心问题,1. 电子密度修饰 2. 分辨率 3. 分析电子密度图 4. 全自动化程序发展,四. 电子密度图诠释 Map interpretation,1. R因子 2. 限制性最小二乘修正 3. 全自动化软件 4. 结构模型表达,五. 结构模型精化 Refinement,Resolution - Higher resolution allows more accurate positioning of atoms,第四节 核磁共振波谱技术,Nuclear magnetic resonance (NMR) 核磁共振是研究处在静磁场中的原子核 与电磁波相互作用的学科。 NMR技术是目前唯一能够用以测定蛋白 质溶液三维结构的方法。,NMR测定蛋白质三维结构的基本过程,核磁共振是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radio frequency, RF）辐射的物理过程。 近年来，NMR法测定小蛋白的三维结构得到了成功的应用。NMR法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小蛋白。,应用方面： 2D和3DNMR方法已提供相当数量的小蛋白质，寡核苷酸，寡糖的三维结构。 提供有关局部结构，构象动力学的信息。 用来表征电荷状态，构象，与配体结合的解离速度，研究蛋白质卷曲与折叠。 鉴定蛋白质分子中某些原子与配体分子中某些原子的相互接触，研究大分子之间以及它们与小分子之间相互作用和分子识别。,由NMR数据决定蛋白质结构的过程： 研究样品的选择与制备； NMR数据的采集与数据处理； 质子自旋系统的识别与信号归属； 决定结构约束因子和分析规则二级结构； 计算出符合约束因子的三维结构和进行结 构精修。,第五节 溶液中蛋白质分子构象的 研究方法,一. 紫外吸收法,二. 荧光光谱法,三. 圆二色性,第六节 蛋白质组学,Proteome一词由Marc Wilkins 于1994年在Italy Siena的一次2-DE电泳会议上首次提出的。 Proteome, 源于PROTEin与genOME的杂合，1995年文献中首次公开使用该词。 Proteome有三种不同的含义：一个基因组、一种生物或一种细胞组织所表达的全套蛋白质。,一般细胞含有数千种至上万种蛋白质。蛋白质组研究的宗旨是将组织或细胞所有蛋白质（至少是大部分）分离与鉴定。 引进下列技术：双向电泳、图像分析系统、蛋白质鉴定方法、HTS（high throughout system)系统与大规模样品处理机器人、数据库设置与检索系统。其中蛋白质鉴定采用了新型质谱技术。 大规模蛋白质组分析过程包括样品制备、图像分析、蛋白质的成分分析与鉴定。,蛋白质组学的前沿大致分为三大方向： 1. 针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即compositional proteomics; 2. 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理病理体系或过程的比较蛋白质组学研究，即comparative proteomics; 3. 蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。,国内外研究现状 2001年国际人类蛋白质组织（Human Proteome Organization, HUPO)成立，同时提出Human Proteome Project, HPP)。 HPP是继HGP之后最大规模的国际性科技工程，也是21世纪第一个重大国际合作计划。 首批行动计划包括：人类血浆蛋白质组计划（美国），人类肝脏蛋白质组计划（中国）。,蛋白质组研究方法 蛋白质组的研究远比基因组的复杂 蛋白质的数目远大于基因的数目； 基因是相对静态的，而蛋白质是动态的； 技术手段 基因研究有PCR技术可微量扩增 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术、质谱技术是蛋白质组研究的三大基本支撑技术。,