第五章分子生物学研究法上.ppt

第五章 分子生物学基本研究法（上）,DNA、RNA及蛋白质操作技术,现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,重组DNA技术发展史上的重大事件（三大成就）： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者（即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题）； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。,5.1 基因操作的基本工具 5.2 DNA操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆（clone）技术 5.6 蛋白质与蛋白质组学技术,（一）限制性核酸内切酶 能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端（不是整齐地切开，即在两条链上的切开位点不对称）的小片段。,5.1 基因操作的基本工具,图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点,（二）基因克隆的载体 基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子。在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节: 目的基因和载体的获得; 目的基因与载体连接,形成重组分子; 重组DNA分子导入宿主细胞; 含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增； 基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。,基因克隆载体的三要素： 自我复制能力； 携带外源基因片段大小； 插入位点多少； 易于鉴定识别程度。,大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。,大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。,是第一个真核基因克隆载体。 缺点：它是一种严紧型复制控制（在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有12个/每染色体。）的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。,2、ColE1质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总DNA的50%左右。,3、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。,5. 2. 1 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。,5.2 DNA操作技术,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。,生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。（溴化乙锭是高度灵敏的荧光染色剂，具有高致癌性! 普通浅黄色乳胶手套不能很好的阻挡，最好用蓝色实验用手套。）,DNA脉冲电场凝胶电泳（PFGE pulsed-field gel electrophoresis） 示意图,在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中，第一个脉冲的电场方向在另一侧成45°夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。,5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。,细菌转化及蓝白斑筛选,为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。,蓝白斑筛选原理图,两种增强转化的处理方法： CaCl2法 将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。 将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。 转化效率可达到5×1062×107个转化子/µg超螺旋质粒DNA（转化后的受体菌称为转化子transformant ）。, 电击法 电脉冲（电场强度、方向或电流的周期性变化）可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA易于进入细胞质。 电脉冲处理的具体方法：将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（2×1010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为4.55.5毫秒。 电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因（大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因），多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,5. 2. 3聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。,PCR技术的原理： 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。,步骤（三步）： DNA解链（变性） 引物与模板DNA相结合（退火） DNA合成（链的延伸） 经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数（两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数），理论上的最高值应是2n, 实得1.8n（n：循环次数）。,聚合酶链式反应（PCR）技术,PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较,DNA解链（PCR的第一步）：高温处理 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。,94加热，淬火,引物与模板DNA相结合（第二步）：退火 降低反应温度（退火，约50），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。,5060，退火 引物与模板DNA相结合,DNA合成（第三步）： 将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'3'方向延伸，合成新生DNA互补链。,PCR扩增，72左右, 按每 分钟1000个碱基对设计,循环往复,常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列，这就需要应用反向PCR（reverse PCR）技术。,先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的核酸限制内切酶，从距靶DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列。,反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。,用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA； 产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过23kb，经连接后重新环化； 按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；,经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子，它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成，其接点是所用限制性内切酶的识别位点。,5. 2. 4 实时定量PCR （real time quantitative PCR，Q-PCR） 由于PCR敏感性高（在几个小时内将特异的一段DNA序列扩增到数百万倍以上 ），扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。,混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。 随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。 非序列特异性荧光染料SYBR Green I , 激发光波长520nm。,SYBR Green I作探针的实时定量PCR实验过程示意图（荧光强度反映PCR产物的量）,Han P., Li Q., and Zhu Y.X. (2008) The Plant Cell 20:1482-1493.,（野生型拟南芥）,（野生型拟南芥的突变体）,P169,为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。 TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。,随着PCR反应的进行，TaqMan 探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。,TaqMan探针实时定量PCR技术,TaqMan探针具有三个要素。（见P168） 在此状态下两个荧光基团十分接近，不发荧光。,Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。,用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。（P169）,5. 2. 5 基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。,Clark和Carbon于1975年提出公式： N=ln(1-p) / ln(1-f) 式中：N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。 为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，基因组文库中的DNA片段常大于20kb。以人为例，其基因组大小为3×109bp若p=99%，平均插入片段大小为20kb，则N=6.9×105。,构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克隆能力约1520kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的噬菌体载体上。,用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。,噬菌体作为克隆载体,此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。,5. 3 RNA基本操作技术,真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。,细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。 一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中： 80%-85%为rRNA 15%-20%为tRNA及sRNA mRNA约占总RNA 的1%-5%,rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。,Li Q et al. (2006) J. Integr. Plant Biol. 48: 114-120.,图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图。,RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260为1时相当于浓度为40g/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。,由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我复制的载体中。,图5-15 cDNA合成过程示意图。,图5-16 定向cDNA 合成及分子修饰,因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。,cDNA文库的构建 cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。 cDNA文库常用Uni-zap XR（一种噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。 重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。,基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。,1、核酸杂交法： 核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。 将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。,取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。 80烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。,图 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图,2、PCR筛选法 将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。,3、免疫筛选法 该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。,图5-18 噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图,5. 4 SNP的理论与应用,SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，即单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，T，C和G）的突变而引起的多态性。,SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。,5. 4. 1 SNP概述 科学上把染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（RFLP）和微卫星标记（SSR）之后的第三代遗传标记。,染色体上共同遗传的SNP组合 图中SNP1和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点A和G，SNP2有等位位点G和T。因此，染色体对有两种可能的SNP组合。,玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较,据估计，人类DNA中每300-1000个碱基对就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型（haplotype），相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。,根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区SNP（pSNP）和非编码区SNP（rSNP）三类。 编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类SNPs。 cSNP分为同义cSNP（synonymous cSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。,5. 4. 2 SNP的检测技术 通过DNA测序法获得新的SNP。 基因分型（genotyping）是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究，主要包括基因芯片技术、Taqman技术、分子信标（molecular beacons）技术和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。,1基因芯片技术 通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。 优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。 缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测。,2Taqman技术 PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的分别与两个等位基因配对的探针。随着PCR的进行，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶的53外切活性所切割，荧光基团与3端的淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切割，供体荧光基团依然被淬灭。,3分子信标（molecular beacon）技术 是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5-8个碱基对组成，5端带有荧光发生基团，3端带有荧光淬灭基团。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光几乎完全淬灭。与靶分子相结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，分子信标的荧光恢复。,Taqman技术（上）及分子信标技术（下）原理示意图。,在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。,5. 5 基因克隆（clone）技术,在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,5. 5. 1 RACE技术(rapid amplification of cDNA ends),是由Frohman等(1988)发明的一项技术。是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。,一般分5 RACE和3RACE两种： 3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。 5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环再PCR。,巢式PCR（nest PCR）：是指利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 。,5 RACE,3 RACE,利用mRNA的3末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA；再用RNase水解模板链；然后用一个基因特异引物GSP作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。,RACE的另一种代表方法是自我连接法（Self-Ligation method）,1、反转录（RT）反应 2、Hybrid RNA的分解 3、单链cDNA的自身连接 4、PCR扩增5未知区域 5、目的DNA片段的切割回收 6、DNA序列测定,5. 5. 2 cDNA差示分析法 (RDA, Representation Difference Analysis) 充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。PCR产物的特异性和所得的cDNA片段纯度均高。 因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。,5. 5. 3 Gateway大规模克隆技术 Gateway技术利用噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。,Gateway大规模克隆策略,TOPO反应: 将目的基因PCR产物连入Entry载体。载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。5GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。（见图5-24a P186）,LR反应： 将目的片段从Entry 载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。（见图5-24b P186）,5. 5. 4 基因的图位克隆法（Map-based cloning） 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。,通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。,染色体步移法克隆基因示意图,在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM1000kb；拟南芥菜中，1cM290kb；小麦中，1cM3500kb。,用图位克隆法获得水稻脆杆基因BC1,将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间； B. 覆盖BCl位点的BAC大片段。 C. BCl位点的精细定位。BCl位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。 D. BCl基因结构。红色为编码区，白色为5和3非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。,Li, Y., Qian, Q., Zhou, Y., Yan, M., Sun, L., Zhang, M., Fu, Z., Wang, Y., Han, B., Pang, X., Chen, M., and Li, J. (2003). BRITTLE CULM1, which encodes a COBRA-like protein, affects the mechanical properties of rice plants. Plant Cell 15, 20202031.,5. 6 蛋白质与蛋白质组学技术,蛋白质组学是蛋白质（protein）和基因组（genome）研究在形式和内容两方面的组合，该技术致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。,蛋白质组与基因组既相互对应又有显著不同，基因组是确定的，每个个体只有一个基因组，而基因的表达调控水平（蛋白组）却会发生显著的变化。 由于蛋白质分离（双向电泳和高效液相层析技术）和鉴定技术（现代质谱）的进步，以及基因组学和生物信息学的交叉渗透，蛋白质组学研究在已经获得了长足的发展。,双向电泳（TwoDimensional Electrophoresis，2-D）技术 等电聚焦（Isoelectric focusing，IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）双向电泳技术。蛋白质是两性分子，在不同pH缓冲液中表现出不同的带电性，因此，在两性电解质电泳体系中，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上不同的区域（等电点）从而被分离。,蛋白质的分子量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率，因为聚丙烯酰胺凝胶中的SDS带有大量的负电荷，与之相比，蛋白质所带电荷量可忽略不计。因此，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其分子量。,2D-E map of protein from Arabidopsis seeds 30h after germination,野生型和突变体棉花胚珠总蛋白质样品的双向电泳图谱比较,蛋白质的质谱分析技术 现行质谱仪主要有三个连续的组成部分，即离子源，离子分离区和检测器。 较常用的有基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spectrometry，MALDI-TOF）和电喷雾质谱（Electrospray ionization，ESI-MS）。,MALDI-TOF的工作原理：将蛋白质酶解成小肽段后与基质（主要是有机酸）混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去。离子化气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值（m/z）决定。,MALDITOF分子质谱仪原理图,蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） 是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠方法。主要分为： a、蛋白样品的制备； b、SDS-PAGE分离; c、转膜载并封闭膜上未反应位点，减少非特异性吸附； d、与相应非标记抗体（一抗）反应； e、洗去多余的一抗，加酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。,免疫印迹 （Western Blotting）示意图.,