第四章食用菌遗传学基础与育种技术.ppt

第四章 食用菌遗传学基础与育种技术,第一节 食用菌的繁殖方式,第二节 食用菌的生活史,第三节 选种技术,第四节 育种技术,食用菌的繁殖方式主要有无性繁殖和有性繁殖。,第一节 食用菌的繁殖方式,2.以产生无性孢子的方式繁殖：如香菇产生节孢子，双孢蘑菇产生次生孢子，草菇产生厚垣孢子，黑木耳产生钩状分生孢子等；,一、无性繁殖,不通过有性生殖细胞的结合，而由亲代直接产生新个体的生殖方式叫无性繁殖，食用菌的无性繁殖主要有以下几种形式：,1.以菌丝断裂的方式繁殖；,3.以出芽方式繁殖。,通过有性生殖细胞的结合，产生新个体的繁殖方式，叫有性繁殖。,孢子核基因的不同就决定了其所萌发成的单核菌丝的不同性别。有性繁殖根据进行质配的单核菌丝的性别，又可以分为以下两种形式。,二、有性繁殖,（一）同宗结合 （二）异宗结合,（一）同宗结合（10%）：由单个担孢子萌发形成的单核菌丝，不须与另外的担孢子萌发的单核菌丝进行质配，核不发生配合，而可自交形成正常的双核菌丝，并有产生子实体的能力，这类食用菌称为同宗配合。,其担孢子的基因性完全一致。,（1）初级同宗配合：草菇：单个担孢子双核化 （2）次级同宗配合：双孢菇：单个担孢子 （有二个不同核）,初级同宗结合：担孢子只含有一个减数分裂产生的细胞核，此单核担孢子萌发生成的同核菌丝能进行双核化并完成有性生活史的全部。 次级同宗结合：每个担子上产生两个担孢子，每一担孢子内含交配型不同的两个核，双核担孢子萌发后形成可孕的多核的异核菌丝体，从而不经不同来源菌丝的交配即可自行完成有性生活史。,（二）异宗结合（90%）：同一担孢子萌发产生的初生菌丝带有一个自交不亲和的细胞核，不能自行交配，只有2个不同交配型的担孢子萌发生成的初生菌丝之间的交配，才能完成有性生活史。这类食用菌称为异宗配合。,无论是同宗结合或异宗结合，都是细胞质的结合，细胞核并不结合，只是紧靠地排列成对。这些偶对胞核继续不断地分裂，形成大量的新细胞，使菌丝体迅速地生长发育。,4.质配形成异核的双核菌丝。多数种类的双核菌丝通过锁状联合菌丝细胞分裂伸长；,第二节 食用菌的生活史,食用菌的生活史，是指从孢子萌发，经历菌丝体、子实体阶段，以及又由子实体产生孢子的循环过程。,一、伞菌的生活史,1.担孢子萌发；,2.单核菌丝（初生菌丝）开始发育；,3.两条可亲和的单核菌丝进行质配；,8.各个单倍体核分别移至担子小梗的顶端，形成担 孢子。至此，完成了一个完整的生活史。,5.在适宜的环境条件下，双核菌丝体组织化，开成各种食用菌所特有的子实体；,6.来自两个亲本的一对交配型不同的单倍体核在担子中融合，进行核配，形成一个双倍体核；,7.双倍体核进行减数分裂，结果产生四个单倍体核，原担子变成担子；,三是核配马上进行减数分裂，每个细胞中都有4个单倍体核，称为单核期，此期亦短暂。,二、有性生殖过程中细胞核的变化,一是质配后开始的异核双核阶段，即异核双核期。具有产生子实体的能力；,二是核配后开始的短暂的双倍核期；,食用菌的种性是通过菌丝体的繁衍逐代传递的，所以自然选择就侧重于在不同菌株之间进行，而不是在同一菌株的后代中进行。,第三节 选种技术,一、选种的原理和方法,1.原理,食用菌自然选育的基本流程：,收集品种资源,生理性能测定,品种比较试验,扩大、示范推广,尽可能的收集有足够代表性的野生菌株。确定采种的目标，采集点的地理条件，并做好详细的采集记录。,2.方法,品种资源的收集.,生理性能测定,标本采集后应尽快采用多种分离方法获取菌株，随后，立即用平板做拮抗试验（即分离的菌株菌丝两两配对接入同一平板培养基内），适温培养，经十余日，不同菌株的菌落内是否出现拮抗线，同时还可在平板或生长测定管上测定菌丝生长速度及对温度的反应。,比较各菌株的优劣，详细记录各菌株的产量、菇形、温性、干鲜比、始菇期、菇潮间隔、形态等。为了试验的准确性，要保证菌种的质量，培养基配方，接种，管理措施等可能影响结果的因素，尽可能使之一致。试验还应按生物统计原理进行安排。,菌株比较,经扩大试验后，将选出的优良品种放到有代表性的试验点进行示范性生产，待试验结果进一步确定之后，再由点到面推广。,扩大试验,上述的品种评比结果仅是个阶段性的成果，还应和当地的当家菌株同时进行栽培，证实它是更优良的菌株。,示范推广,将有价值的子实体的局部组织、孢子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得纯培养菌丝的操作称为菌种分离。,二、菌种分离,什么是菌种的分离呢？,种子资源的获得有野外采集和栽培场所采集两种途径。野外标本的采集，主要适用于食用菌的野生种驯化、遗传育种、生理生态以及各种研究用的一级种的分离。而在食用菌栽培上的一级种的分离，其种菇的来源主要是从栽培场中经留种获得的。,（一）种子资源的获得,分离对象应从当地当家品种，或从外地引进并经大面积栽培后表现出高产、稳产的菌株中选择。留种种菇要求菇形理想，长势健壮，无虫无病的子实体。,种菇（耳）的选择,成熟度的选择,组织分离一般选择幼菇，即器官分化尚未结束时采摘。此时菇体正在生长。从最旺盛的“生长点”挑取组织，其菌丝萌发快，长势好，而且操作时，组织块纤维化程度低，容易挑取。,通常使用PDA培养基。特殊分离培养时，常采用相应的培养基。,（二）菌种分离,菌种分离可以分为孢子分离、组织分离和基内菌丝分离三种。,1.分离前的准备,培养基的选择,种菇采摘后，若种菇水分太高，菇盖沾粘，可适当风干后再进行分离。胶质耳只能用无菌水多次冲洗，无菌滤纸吸干，然后让耳片子实层上重新产生成熟的孢子供分离，这样可降低污染率。,种菇的预处理,菌 种 分 离,孢子分离法,组织分离法,菇木分离法,孢子弹射分离法,整菇插种法,钩悬法,贴附法,菌褶上涂抹法,孢子印分离法,单孢子分离法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,平板稀释法,连续稀释法,子实体组织分离法,菌核组织分离法,菌索分离法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,在无菌操作条件下利用食用菌的有性孢子或无性孢子在适宜的培养基上萌发成菌丝体，而获得纯菌种的方法称为 孢子分离法。,特 点,菌丝菌龄短，因是有性繁殖产物，其菌丝生命力强。,侵染病毒的菌类可用孢子分离法脱毒。,这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。 孢子分离法分为单孢分离法和多孢分离法。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法 -多孢分离法,种菇的选择,在生产中必须选择优良品系中的优良个体作分离材料。,选取八、九分成熟的，健壮无杂的第一或第二茬的子实体。,多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。根据获取孢子的方法不同，主要有：孢子弹射法： 菌褶涂抹法： 钩悬法： 贴附法等。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法,孢子弹射分离法 它是利用孢子能自动弹射出子实体层的特性来收集孢子。,整菇插种法,孢子收集器来收集孢子,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法,整菇插种法,将钟罩上的孔加上棉塞或包上6-8层纱布，放在垫有46层纱布(浸过01升汞液)的塘瓷盘上，纱布上放一培养器，内放一个不锈钢支架。,把收集器包装好，灭菌备用。,将菌幕未破裂的成熟子实体洗干净，用01升汞溶液或025的新沽尔灭浸泡2-3min，以杀死表面的杂菌。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法,整菇插种法,对于菌幕破裂、子实层已外露的子实体或无菌幕包裹的子实体，可用棉花蘸75酒精涂擦子实体表面消毒。,按无菌操作要求移人孢子收集器，插在支架上，在适宜的温度中培养。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法,整菇插种法,2-3天后孢子散落在培养皿中，加入无菌水，用针筒吸取孢子液，接种在斜面培养基中央，置于22-26恒温箱中培养即可。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法, 钩 悬 法,在生产上，采集木耳、银耳孢子常用此法，伞菌也可采用此法。,先将新鲜成熟的耳片用无菌水冲洗，然后用无菌纱布将水吸干，取一小片挂在灭菌的钩子上(伞菌则消毒后挂上，钩子的另一端挂在三角瓶口。,食用菌分离技术,（二） 菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法,瓶内装有培养基，在25下，培养24H。孢子落到培养基上后，取出耳片，塞上棉塞继续培养，然后再转入试管中培养。, 钩 悬 法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(1)孢子弹射分离法,取一小块成熟的菌褶或小块菌盖，用溶化的琼脂或胶水、浆糊(需先灭菌)贴附在试管斜面的上方或培养皿皿盖上，经612h，待孢子落下后，立即将试管或培养皿中的培养基移到另一消毒过的空试管或培养皿中进行培养。, 贴 附 法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(2)菌褶上涂抹法,将伞菌子实体用75酒精表面消毒，按无菌操作用接种环直接插入两片菌褶之间，轻轻地抹过褶片表面，然后用划线法涂抹于试管培养基上。,(3)孢子印分离法,取成热子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20-24静置一天，大量孢子落下形成孢子印，然后移少量孢子在试管培养基上培养。,孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂菌的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法 -多孢分离法,孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。一般菌类如平菇、凤尾菇、香菇、金针菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(4)单孢子分离法,进行单孢子分离后，在人工控制的条件下，使两个优良品系的单孢于进行杂交，从而培育出新品种。,挑取少许孢子在无菌水中形成孢子悬浮液，取几滴涂于培养基上，用无菌玻璃三角架推平。经48-72h后，镜检孢子萌发情况。在单个孢子旁做好标记，然后将其转接到斜面培养基上，待菌落长到lcm左右时进行镜检，观察有无锁状联合；初步确定是否是单核菌丝。, 平 板 稀 释 法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,1、孢子分离法,(4)单孢子分离法,挑取一定量孢子，经连续稀释后，直到每滴稀释液中只有一个孢子，然后滴人试管中保温培养。当发现单个菌落时，转到新试管中继续培养，并通过镜检以确定是否为单孢菌落。, 连续稀释法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,2、 组织分离法,组织分离法 是利用子实体内部菌肉组织来获得菌种的一种最简便的方法，是生产上常用的一种分离菌种的方法。,组织分离是一种无性繁殖过程，所得到的菌种是营养后代，后代不易变异，菌株可保持原品种的优良品质。但如采用感染病毒的子实体进行组织分离时，常得到带病毒的菌丝体。,（1）子实体组织分离法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,2、 组织分离法,选择优良的种菇作为分离材料，用无菌水冲洗后，用75%的酒精溶液表面消毒。取消毒过的刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织(火柴头大小)，接种到PDA培养基上3-5天后，接种块上产生白色绒毛状菌丝。,2、组织分离,伞菌组织分离法 组织分离时，用75%酒精棉球擦拭双手及接种工具。点燃酒精灯，将尖头镊子烧灼灭菌；随后将种菇纵向撕成两半，于菌柄、菌肉交界处切取火柴头大小的组织块，迅速抖落到试管中，烧灼管口及棉塞，塞上棉塞。这些操作都是在酒精灯火焰无菌区域进行的。,一种方法是将耳片反复用无菌水冲洗，切成0.5cm小块移入培养基，于28下进行培养； 另一种方法是剖取尚未展开耳片的耳基团内的组织块进行分离。,胶质菌类组织分离法,（2）菌核组织分离法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,2、 组织分离法,茯苓、猪苓等的子实体不易采集，而它们的菌核却易获得，利用菌核分离，能得到该菌的纯菌种。,将菌核表面洗净，用75酒精溶液消毒，切开菌核，取中间一小块组织接种在PDA斜面培养基上，塞上棉塞，在25下培养。,在挑取组织块时，应取大一点，因菌核是贮藏器官，其大 部分是由贮藏物质一多糖物质构成，仅有少量菌丝。若挑得过小，只挑到贮藏物质而没有挑到菌丝，分离就不成功。,（3）菌索分离法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,2、 组织分离法,蜜环菌、假蜜环菌等子实体难得，也无菌核，可用菌索来分离获得其菌种。,操作方 法为：,用沾有75酒精溶液的棉花将菌索表面黑色皮层轻轻揩擦23次，在无菌操作条件下去掉黑色外皮层(菌鞘)，抽出其中白色菌髓部分，用无菌剪刀将菌髓剪下一小段，移植在培养基上，保温培养，即可获得菌种。,菌索比较细小，在分离时极易污染，因此在培养基中应加入适量的抑菌的青霉素或链霉素。,特殊的组织分离,2. 菌 索 分 离,3. 子 实 层 分 离,1. 生 长 点 分 离,利用食用菌生长发育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。,基内菌丝分离培养法,此种分离方法适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得子实体的品种。基内分离法与组织分离法不同之处是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等。,就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇（耳）木在分离之前，必须进行无菌处理。可以把菇（耳）水表面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉菌的孢子，或用0.1的升汞水浸泡几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意：接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以，菌丝生长缓慢的种类应浅取；菌丝生长快的种类可以深取。同时，还应根据菇菌的种类、木材质地、菇（耳）木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些，以减少杂菌感染机会，提高菌种的纯度。接种块移到培养基上，就应该放到适合菌丝生长的2226 的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。,（1）材中菌丝分离法：,土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能挑取清洁菌丝索的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌生长的药物，如 40微克升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。,（2） 土中菌丝分离：,食用菌种类很多，许多土生的食用菌；孢子不易萌发。组织分离也不易成功，用土中菌丝分离获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,3、菇木分离法,利用菇木中菌丝的分离而获得纯菌种的方法。 这种方法污染较大,菇木分离法,能用孢子分离或组织分离的菌类，一般不用这种方法。,在自然界，银耳菌丝与香灰菌丝在一起才能产生银耳子实体，而用长有菌丝的段木来分离，能同时得到银耳菌丝及香灰菌丝，因此，生产上用的银耳菌种常采取菇木分离法，香菇、木耳等菌类也可采用菇木分离法,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,3、菇木分离法,（ l）菇木的选择与处理,菇木应在子实体发生季节采集，由于菇木含有很多水分，细菌繁殖较快，分离易受污染，需将分离材料风干，则分离成功率较高。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,3、菇木分离法,（ l）菇木的选择与处理,分离时仅需取1cm厚的一片或一块菇木，一般选取菇木的中间部位，不取两端，因两端裸露在外，污染率高。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,3、菇木分离法,（ 2）菇木表面消毒,将菇木切成2-25m3的小块，用01的升汞水浸泡0.25lmin，然后用无菌水冲洗，无菌纱布吸干。或用75的酒精溶液揩擦表面进行消毒。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,3、菇木分离法,（ 3）接种块的选择,取米粒大小一块接入PDA试管培养基上，接种块小，污染的机会小。接种后把试管放到25下培养,长出白色菌丝后，挑其尖端部位转接到新培养基上，即得到纯化的菌种。,食用菌分离技术,（二）菌种的分离,3、菇木分离法,菇 木 分 离 法,4、 子实体基部分离： 从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法，叫子实体基部分离。,第四节 育种技术,食、药用菌的杂交是指不同种或种内不同株系之间的交配，后者则较为重要。,一、杂交育种的原理,二、杂交育种的方法,1.选择亲本,2.单孢子分离,3.单孢子杂交配对,次级同宗结合食用菌（如双孢蘑菇），首先经过单孢子分离、培养，获取不孕菌丝。随后进行不孕性菌丝间的配对。,4.转管繁殖,将可亲和的组合移入新的斜面保存备用。,四极性的异宗结合的食用菌，由于自交不育，经配对后，凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实者，即证明杂交成功。,经过初步筛选，淘汰大部分表现一般的菌株。经初筛后再做出菇试验比较，选出优良菌株。,5.初次筛选,可采用拮抗试验，然后反复筛选和区域试验。,测定其最适生长温度、湿度等；,6.复筛,通过栽培比较，选出少数性能优良的菌株。出菇鉴定包括如下几个方面：,菌丝生长速度；,出菇菌块（袋）的表型特征；,子实体表型特征；,计算子实体的产量。,将复筛菌株置于不同地域的栽培区进行栽培，以考察其适应性与性状的稳定性，并做相关的详细记录。,7.小面积栽培试验：,9.为确定保留下来的杂交新品种正式定名，并申 请有关部门批准。,8.大面各示范推广：,逐步扩大栽培面积，进行示范性的推广，将种性优良、优质高产的菌株逐渐定为当家菌株。,高能辐射使DNA受损，碱基对顺序改变，发生突变 手段：化学（亚硝酸、氮介、甲基磺酸乙醋）、物理（辐射：紫外线、射线CO60）。 分离、筛选、鉴定：非常繁重,三、诱变育种,2、原生质体融合（初级生物工程技术）：体细胞杂交可实现远缘杂交，获更大的杂种优势。,四、生物工程,1、基因工程：目的基因切下来载体转入受体细胞整合在染色体（获新性状）。,目的性强，可减少后期工作，易有大突破。,细胞工程重点研究和开发的是细胞融合技术和细胞培养技术。细胞融合技术是人们按照需要，使两个不同遗传特性的细胞，融合成一个新的杂种细胞，从而人工构建新型细胞，这个细胞兼有两个亲代细胞的遗传特性。,细胞工程在食用菌育种中的应用,1：什么是同宗结合？什么是异宗结合？ 2：如何进行选种育种？ 3：何谓菌种分离？试述菌种分离的方法。,作业四,所谓锁状联合，是指双核菌丝上的横隔膜处产生的一个具有特征性的侧生突起。它往往发生在菌丝顶部双核细胞的两核之间。最初由细胞向侧面伸出一个钩状突起，向下弯曲，其顶端与母细胞接触，与此同时，两个核之一转移入突起之中，然后二核同时分裂，产生四个子核，二核留在细胞的上部，一核居下部，一核在突起中。这时，细胞产生横隔，将原来的细胞分成两个，上面细胞双核，下面细胞一核，突起的基部也同时产生横隔，其顶端则与下面细胞接触处融通，其中的一个核移入下面细胞内，因而就构成了上下两个双核细胞，侧面就留下了锁状联合。,