第03章细胞生物学研究方法.ppt

,第三章 细胞生物学研究方法,细胞生物学研究思路,进行初步观察,形成可验证的假说,设计对照试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已 有知识,Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster,Arabidopsis thaliana,生物学研究模式生物,生物学研究模式生物,微生物细胞,病毒,孟加拉斑马鱼,荧光斑马鱼,全身透明斑马鱼,不同物种享有共同分子机制,第三章 细胞生物学研究方法, 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,第一节 细胞形态结构的观察方法, 光学显微镜技术（light microscopy） 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描隧道显微镜 (scanning tunneling microscope ),一、光学显微镜技术（light microscopy),普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）,普通复式光学显微镜,光镜样本制作,分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。,荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）,原理与应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,荧光显微镜技术原理,体视荧光显微镜,微管呈绿色、微丝红色、核蓝色,直接荧光标记技术,现代生物学的北斗星,2008年度诺贝尔化学奖 授予美国科学家下村修、马丁-查尔菲，华裔化学家钱永健，他们因为发现和发展绿色荧光蛋白(GFP)而获奖的。,多种颜色荧光的大肠杆菌组成的“钱氏实验室”字样,激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）,激光共焦扫描显微镜技术原理,应用： 1. 排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，高品质的荧光成像; 2. 多维观察,重构样品的三维结构; 3. 可进行一二三标记; 4. 动、静态观察； 5. 定性与定量分析。,实 例,美国哈佛大学的吉恩·里维特(Jean Livet)使用共焦显微技术(confocal microscopy)，拍摄了一只基因工程小鼠的脑干组织切片(厚340m)。(即“脑虹”技术，Brainbow),美国北卡罗来纳大学惠明顿分校的索尼娅·派奥特(Sonja Pyott)拍摄到了小鼠内耳毛细胞 .毛细胞为绿色，与毛细胞有突触联系的细胞为红色，蓝色的则是细胞核,相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器,A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM. a)under bright-field; b)phase-contrast; c)DIC,录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。,二、 电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope),电镜与光镜的比较,电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,主要电镜制样技术, 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术（Negative staining）与金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology） 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).,扫描电镜,原理与应用： 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题,扫描电镜外观,三、 扫描隧道显微镜,Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。,透射电镜外观,透射电镜下的细胞,活细胞工作站可实现在细胞水平上的定性和定量分析、活细胞图像处理、活细胞动态示踪。在分子水平，可做到基因定位定量表达的动态分析、蛋白质合成降解运输和相互作用的动态研究、细胞骨架的代谢动力学测定和细胞周期各时相的动态观察等。 现在市场上使用的活细胞工作站由高级自动倒置显微镜、活细胞长时间孵育系统、Z轴微光切系统（数码共聚焦系统）、单色仪、高灵敏冷CCD、图像软件工作站组成。还需要加热控制器；温度控制器；CO2控制器；CO2培养箱。用于培养状态下细胞动态的研究。仪器可以自动聚焦、单细胞追踪、多位点成像。成像速度高、图像清晰度高。,四、活细胞工作站,用途： 1、活细胞荧光标记蛋白的长时程失踪观察 2、活细胞运动分化形态示踪观察 3、荧光共定位 4、荧光共振能量转移（FRET） 5、荧光图像处理、测量,第二节 细胞组分的分析方法, 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术,一、 离心分离技术,用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,差速离心,A 等速度沉降,B 等密度沉降,密度梯度离心,二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法,原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。,Feulgen Staining,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） 蛋白电泳(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应(Western-Blot) 免疫电镜技术： 免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,四、细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,五、放射自显影技术,原理及应用： 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪。 步骤： 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影,六定量细胞化学分析技术, 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry） 主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。,流式细胞术,第三节 细胞培养、细胞工程与 显微操作技术, 细胞的培养 细胞工程,一、细胞的培养, 动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） 细胞系（cell line） 有限细胞系，永生细胞系 细胞株（cell strain） 植物细胞 类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系（cell-free system）,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,获得细胞,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,动物细胞培养技术的应用,（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体等。 （2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。 （3）用于检测有毒物质 （4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,这只老鼠身上的“人耳”是由我国科学家曹谊林教授利用细胞工程技术复制出来的。,二、细胞工程,细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 单克隆抗体（monoclone antibody）技术 细胞拆合与显微操作技术 物理法结合显微操作技术(图1、图2) 化学法结合离心技术 制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 其它技术 遗传分析（mutant, knock out, knock in） 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,（一）植物、动物细胞融合的比较,细胞融合,单克隆抗体技术,(二)单克隆抗体,提出问题：长期以来，人们为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。,单克隆抗体的概念,（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？,思考：,（2）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？,（3）制备过程为何要经过两次筛选？,单克隆抗体有何应用？,主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现 致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。,绝大多数的单克隆抗体(mAb)是用小鼠开发的，虽然可作为研究和诊断的工具，但它们至少在一定程度上不是理想的治疗剂，因为它们在人类中有免疫原性。也就是说，小鼠抗体引入到病人体内，将被病人的免疫系统识别为外源物质，并将发生有损治疗抗体利用的人抗鼠抗体(HAMA)应答。已经通过将这些鼠的抗体人源化或直接制备人的mAb来解决。,最近，通过用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因创建了产生人抗体的小鼠。因此，当小鼠被免疫时它直接制造出对该抗原的人的抗体，并且产生这些抗体的B细胞可与骨髓瘤细胞融合，产生制造人mAb的杂交瘤。,单克隆抗体技术的改进,2007年3月26日，在韩国首都首尔，克隆狼在笼子内休息,（三）细胞拆合与显微操作技术,（三）细胞拆合与显微操作技术,多莉羊的培育过程,细胞核移植,三、生物芯片,1.定义 指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子（如核酸片段、多肽分子）等样品有序的固定于支持物（如玻片、硅片、尼龙膜等）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记得待测生物样品中靶分子，通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描显微镜或CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子数量的技术。,生物芯片,2.类型 基因芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片,生物芯片,3.应用 基因表达水平的监测 基因诊断 药物筛选 个性化治疗 测序 生物信息与研究,对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,细胞生命活动,突变体分析,突变体分析,蛋白修饰分析,基因表达,多肽定性分析,生物信息学,序列测定,双向电泳分析,DNA分离与克隆,机器人技术 (robotics),功能基因组学,蛋白质分离与制备,蛋白质组学,