蛋白质的结构和功能.ppt

蛋白质的结构和功能 Structure and Function of Protein,发现和定位：26000 不超过40000 人有而小鼠无：300,生物学功能的主要体现者是蛋白质 蛋白质组学，功能蛋白质组学,HGP,Protein 这个词来自希腊文 proteios, 原始的，首要的。,一、蛋白质（Protein）的概念,概念：由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生命的物质基础 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,2.蛋白质的重要生物学功能,结合,催化,开关,结构蛋白,二、蛋白质的组成,（一）蛋白质的元素组成,碳（C） 5055% 氢（H） 68% 氧（O） 19%24% 氮（N） 13%19%，平均16% 100g样品中蛋白质含量（g%）:氮克数/克样品*6.25*100 硫（S） 03 其他（磷、铁、铜、碘、锌和钼等）,（二）蛋白质的基本结构单位氨基酸,1、结构通式,L- -Amino Acid,蛋白质氨基酸均为L型，D型多存在于细菌产生的抗菌素或植物的生物碱中,通常位于蛋白的内部,G,A,V,L,M,I,P,2、氨基酸的分类,非极性、脂肪族R基氨基酸,按照R基的性质分类,亚氨基酸,芳香族R基氨基酸,内部,表面/内部,主要存在于蛋白的外部,不带电荷的极性R基氨基酸,内部,通常位于蛋白外部，有时位于内部，与带负电荷的氨基酸形成盐键,K,R,H,带正电荷的R基氨基酸（碱性氨基酸）,D,E,带负电荷的R基氨基酸（酸性氨基酸）,通常位于蛋白外部，有时位于内部，与带正电荷的氨基酸形成盐键,按照疏水性分类,疏水性氨基酸,仅参与范德华力相互作用，疏水作用的基础。多出现在螺旋中，脯氨酸除外（主链碳原子与自身R基形成氢键。）,亲水性氨基酸,可以与主链、极性有机分子和水分子形成氢键。,两亲性氨基酸,同时具有极性和非极性，是理想的界面分子。,修饰氨基酸： 蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。 非生蛋白氨基酸： 蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。,特殊氨基酸,3、氨基酸的理化性质,两性解离及等电点,等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH质称为该氨基酸的等电点（isoelectric point, pI）。等电点时氨基酸既不向阳极也不向阴极移动。,碱性亚氨基,酸性羧基,紫外吸收,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等含共轭双键氨基酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这几种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3、氨基酸的化学反应,成盐成酯反应 成酰氯反应 脱羧基反应 叠氮反应,用途：常用于氨基酸的定性或定量分析；用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸；用于修饰蛋白质。,（二）蛋白质的分类,分子组成：单纯蛋白质 结合蛋白质 分子形状和空间构象: 纤维状蛋白 球状蛋白 功能：酶蛋白、调节蛋白、运输蛋白等 家族分类法：螺旋-环-螺旋超家族、锌指结构蛋 白、PDZ结构域蛋白等。 特定模体或结构域常与某种生物学功能相关联，根据结构与功能的关系，将具有相同或类似模体或者结构域的蛋白质归为一大类，一类或一组，分别称为超家族（super family）、家族（family）或亚家族（subfamily）。,三、蛋白质的结构,序列决定结构，结构决定功能,（一）蛋白质分子的一级结构,1.蛋白质一级结构的概念,多肽链上各种氨基酸从N端到C端的排列顺序,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,胰岛素一级结构,2.肽键和二硫键,一个氨基酸分子中的氨基与另一个氨基酸分子中的羧基脱水缩合形成的酰胺键称为肽键。 两个氨基酸通过肽键连接形成最简单的肽，二肽。10个以内，寡肽（oligopeptide）,10以上称为多肽，多肽链。 多肽链中氨基酸分子因为脱水缩合而稍有残缺，称之为氨基酸残基（residue）。 氨基端或N末端 羧基端或C末端,3.天然活性肽,通常具有重要的生物学活性： 肽类激素：催产素、抗利尿激素 神经肽：P物质、脑啡肽 抗生素肽：短杆菌素S、短杆菌素A、博来霉素,功能： （1）解毒 （2）辐射防护 （3）保护肝脏 （4）抗过敏 （5）改善某些疾病的病程和症状 （6）美容护肤 （7）增加视力 （8）抗衰老作用,谷胱甘肽(glutathione, GSH),4.蛋白质一级结构的测定,(1) 传统氨基酸测序法,1955年Frederick Sanger测出胰岛素（insulin）的一级结构，获得1958年诺贝尔化学奖。方法：先将胰岛素多肽链切成小段，以化学方法定出小段序列后，由各小段重叠的部分将原序列重组出来。,Insulin protein sequence,蛋白质一级结构测定的步骤,1、蛋白质的分离纯化 Purification 2、二硫键的拆分与保护 S-S cleavage & blocking 3、(亚基分离） Subunit separation 4、多种方法的部分水解 Partial hydrolysis 5、分离水解后得到的多肽 Peptide separation 6、测序 Sequencing 7、重叠 Overlapping 8、二硫键位置的确定 Disulfide bond po.,N端的测定方法,1、Sanger法 2、Edman法 3、Dansyl chloride/Edman法 4、酶降解法,Edman 降解法(I),DABITC：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团,pH 9,CF3COOH/无水,DABITC: 4-N,N-二甲氨基偶氮苯4'乙内酰硫脲,Edman 降解法(II),无冕英雄 Pehr Victor Edman,瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19 1946-47年在美国留学时想到改进1930 年Abderhalden 60年代后期Moore & Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是Edman没有和他们分享Nobel化学奖.,以质谱仪测定蛋白序列,质谱仪是利用分子的质量大小来检定样本，因此可以精确测出某分子的质量。若把蛋白质在质谱仪中与氮气撞击，产生一群具有各种不同长短的片段，然后用质谱仪一一测出这些片段的分子量，由所得各种片段分子量的差别，就可推出相差氨基酸的种类，乃至整段氨基酸的序列。,质谱法 Edman循环后看分子量的变化,(2) 由cDNA序列确定蛋白序列,DNA上的碱基序列与它所编码蛋白质的氨基酸顺序呈线性相关,分离纯化蛋白质,酶切部分水解后分离短肽,对短肽进行测序,构建cDNA文库,根据序列设计探针,筛选cDNA文库,根据cDNA序列推测蛋白质的一级结构,蛋白质序列数据库 www.ncbi.nlm.org,（二）蛋白质分子的二级结构,1.蛋白质二级结构的概念,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该肽链主链骨架原子相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象,稳定因素：氢键,肽平面,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元(peptide unit)。 由于肽键（peptide bond）具有双键特性，所以主链中只有两个单键可以旋转。,两个肽平面以一个C为中心发生旋转,多肽链的所有可能构象都能用和两个构象角（conformational angle)或称二面角（dihedral angle)来描述。,扭转角：一个可旋转化学键两侧两个基团间所成的角度。 扭转角：N-C键与相邻肽键形成的夹角 扭转角：C-C键与相邻肽键形成的夹角 从肽链N端看，顺时针方向为正，逆时针方向为负,和均为零时的构象，由于相邻肽平面的H原子和O原子之间在空间上重叠，此构象实际上并不允许存在。和同时旋转1800，则转变为完全伸展的肽链构象(前页)。,和均为1800，为完全伸展的肽链构象。,左手螺旋,原子和原子团物理大小限制了和转角的大小，根据允许的和值可以做出Ramachandran图。红色：不会引起空间位阻的转角组合；粉色：空间位阻发生一定程度的张弛时的转角组合,作用力 破坏因子 氢键： -螺旋，-折叠 尿素，盐酸胍 （guanidine hydrochloride ） 疏水作用： 形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂 Van der Waals力：稳定紧密堆积的基团和原子 离子键：稳定-螺旋，三、四级结构 酸、碱 二硫键：稳定三、四级结构 还原剂 配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA,维持蛋白质空间构象的作用力,H2NC(:NH)NH2 HCl,稳定折叠蛋白的化学键,除氨基酸之间连接的肽键和二硫键两个共价键外，折叠蛋白质的其他稳定能则来自于共价键之外的非共价弱极性相互作用，主要包括盐桥、氢键、范德华力和长距离静电相互作用。,范德华力（van der Waals force）：当一个原子或成键的几个原子上电子云的变化诱导邻近的非成键原子产生相反的变化的偶极时，就产生非常弱的静电吸引，即为范德华力，对维持活性中心的构象尤为重要。疏水性侧链范德华力最大,原子间距离小于5Å,氢键（hydrogen bond)：当氢原子与一个负极性更强的原子形成共价键时，它便具有了部分正电荷的性质，可以被邻近的带有负电荷的原子吸引，从而形成氢键。两个非氢极性原子之间距离小于3.5Å，而其中一个连接了一个氢原子时，就认为它们之间存在氢键。,与氢原子共价连接的原子称为供体原子，未共价连接的原子称为受体原子。当受体和供体都完全带有电荷时，键能显著提高，这时形成氢键的离子对称为盐桥。,水形成氢键的特性对于蛋白质结构具有重要的影响,供体,受体,蛋白质结构中几乎所有潜在的氢键供体和受体都参与蛋白质自身极性基团或与水分子间的氢键作用。最普遍的氢键基团是C=O和N-H，在蛋白质内部这些基团不能与水形成氢键，倾向于彼此间形成氢键，结果构成了稳定蛋白质折叠状态的二级结构。,受体,疏水作用（Hydrophobic effect),在水中的非极性基团相互作用以尽量减少同极性溶剂接触表面积的趋势，称为疏水作用。 非极性基团相互聚集，位于多肽链的内部，极性基团位于表面，与水形成氢键，而聚集在内部的多肽链主链分子不能与水形成氢键，只能相互间形成氢键，导致多肽链折叠更加紧密，结构更加稳定。,3.蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),-螺旋 ( -helix )，由主链氢键网络稳定的具有多面性的柱状结构,N,C,螺旋帽:N末端氨基酸残基未饱 和的氢键供体（N-H基 团）通常与一个极性侧 链形成氢 键，这个氨 基酸残基称螺旋帽,螺旋帽,5.4 （3.6aa）,特点：右手螺旋；3.6aa/圈，每个aa上升1.5，螺距5.4；n氨基酸上羧基氧与n+4氨基酸上亚胺基上的氢形成氢键。,螺旋偶极,偶极矩,螺旋是一种普遍的蛋白质二级结构,螺旋是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。螺旋中的每个氨基酸残基C的成对二面角的和各自取同一数值，=-570、=-480，即形成周期性有规则的构象。多肽的主链可以按右手方向或左手方向盘绕形成右手螺旋或左手螺旋。每周螺旋占3.6个氨基酸残基、沿螺旋轴方向上升0.54 nm、每个氨基酸残基绕轴旋转1000，沿轴上升0.15 nm。螺旋中氨基酸残基的侧链伸向外侧，相邻螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向与中心轴几乎呈平行关系。氢键由肽键上的N-H的氢与其后面（N端）的第四个氨基酸残基上的C=O的氧之间形成。,- 螺旋的特性（物理参数）,氢键取向与主轴基本平行,右旋，3.6个氨基酸一个周期，螺距0.54 nm,第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。,-螺旋俯视图,两亲性-螺旋 ：在许多-螺旋中，极性和疏水性残基以间隔3或4个残基的方式分布在序列中，就会产生具有一个亲水面和一个疏水面的-螺旋。位于蛋白质表面，与水形成氢键或位于界面，极性基团彼此作用。结构预测时利用该特征可以寻找-螺旋,脯氨酸由于缺少N-H，很少出现在-螺旋中，但多聚脯氨酸螺旋具有特殊的性质。多聚脯氨酸肽键为反式时，形成左手螺旋，很容易被其他蛋白识别，因此多聚脯氨酸通常作为蛋白质识别模块的锚着位点，如信号转导的SH3域。,蛋白质的-螺旋几乎都是右手螺旋,蛋白质中的-螺旋几乎都是右手的，右手的比左手的稳定。前提是螺旋都是由L-氨基酸残基组成的，因此右手螺旋和左手螺旋不是对映体。左手螺旋中L-型氨基酸残基侧链的第一个碳原子（C)过于接近主链上C=O的氧原子，以致结构不舒适，能量较高，构象不稳定。而右手螺旋中，空间位阻较小，较为符合立体化学空间要求，在肽链折叠中容易形成，构象稳定。左手螺旋虽然稀少，但偶尔也有出现。,左旋和右旋的判断,-构象将多肽链组织成片状结构,-构象也称-折叠、-结构、-折叠片，是蛋白质中第二种最常见的二级结构。两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的-NH和C=O之间形成有规则的氢键，这种构象为-构象。在-构象中，所有的肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽链的长轴接近垂直，在肽链的长轴方向上具有重复单位。除作为某些纤维蛋白质的基本构象外，-构象还普遍存在于球状蛋白质中。-构象分为两种类型：平行式(parallel)和反平行式(antiparallel)。,-折叠 (-pleated sheet ),除边界两侧的C=O和N-H外，其它极性酰胺基团之间构成氢键。反平行更稳定。,（1）是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110°角。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。 （2）依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的CO与HN形成氢键，使构象稳定。 （3）两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。 （4）平行片层结构中，两个氨基酸残基的间距为0.65 nm；反平行片层结构，则间距为0.7 nm。,片层结构的特点,-折叠（ -pleated sheet）,通过链间的氢键作用两个蛋白质形成复合物Rap-Raf,桶（视黄醇结合蛋白） 最后一条链和第一条链形成氢键，形成闭合圆柱。,-转角（ -turn）,第二个氨基酸通常为脯氨酸，此外甘氨酸、天冬氨酰、天冬氨酸和色氨酸也常出现在-转角中,蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是转角(turn或bend)，一般含有216个氨基酸残基。含有5个氨基酸残基以上的转角又常称之环（loops）。,没有确定规律性的部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列，属于松散的卷曲(coil)。 这类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其他蛋白质特异的功能部位，例如铁氧还蛋白和红氧还蛋白中结合铁硫串的肽环以及许多钙结合蛋白中结合钙离子的E-F手结构的中央环。 无规卷曲（random coil）:溶液中变性蛋白质的折叠完全展开后形成的无序且快速变动的构象。,卷曲（coil）,4.二级结构的预测,长侧链,C分支,亚氨基，N-H不参与形成氢键,无侧链,不同软件对同一氨基酸序列二级结构的预测。h表示螺旋，e表示折叠，c表示环，t表示转角,蛋白质一级结构是空间结构的基础 一级结构决定二级结构,一级结构决定了二级结构： Chou和Fasman对29种蛋白质的一级结构和二级结构关系进行统计分析，发现： Glu、Met、Ala和Leu残基是-螺旋最强的生成者， Gly、Pro是-螺旋最强的破坏者 Gly、Ala、Ser是折迭最强生成者 Gly、Pro、Asp、Ser是转角最强生成者， Ile、Val、Leu是转角最强破坏者。 一级结构决定了三级结构： 如牛胰核糖核酸酶 一级结构决定了四级结构： 如血红蛋白的四级结构，见球状蛋白质。,超二级结构（supersecondary structure）,多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近并相互作用，形成规则的二级结构聚集体，称为超二级结构,模体（motif）也称为基序，模序 具有特定功能的一段氨基酸序列，顺序基序 锌指基序：CXX(XX)CXXXXXXXXXXXXHXXXH 具有特定功能的一组二级结构元件，在空间上互相接近，形成特殊的空间构象，结构基序,锌指结构,螺旋-转角-螺旋,蛋白质中的几种超二级结构,Rossman折叠,（螺旋处于折叠片上侧）,发夹,曲折,希腊钥匙拓扑结构,细胞色素C的结构,是一种螺旋束，经常是由两股平行或反平行排列的右手螺旋段相互缠绕而成的左手卷曲螺旋或称超螺旋。螺旋束中还发现有三股和四股螺旋。卷曲螺旋是纤维状蛋白质如角蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白的主要结构元件，也存在于球状蛋白质中。,肌球蛋白（Myosin）,肌球蛋白是一种马达蛋白(motor protein)，在肌肉收缩和细胞分裂中起重要作用，由Kuehne于1864年在研究骨骼肌收缩时发现并命名 。Mr 550000，6个亚基：2条重链(Mr 200000)，4条轻链(2L2 18000，L1 16500，L3 25000)，状如“Y”字，长约160 nm。在肌球蛋白超家族中，头部区域都有相当高的同源性，特别是ATP和肌动蛋白的结合位点非常保守，头部具ATP酶活性。两条重链的氨基末端分别与两对轻链结合，形成两个球状的头部和颈部调节结构域，称为S1(subfragment 1)，余下重链部分组成肌球蛋白长杆状的尾部。,Meromyosin:酶解肌球蛋白,Ribbon representation of myosin S1 fragment. The heavy chain is in grey, the two light chians in two shades of blue.,超二级结构,最简单的组合是由二段平行的-链和一段连接链组成，此超二级结构为单位。连接链或是-螺旋链或是无规则卷曲。最常见的组合是由三段平行的-链和二段-螺旋链构成-Rossmann-折叠。 -曲折和回形拓扑结构是（）组合的两种超二级结构。 -曲折(mander)是另一种常见的超二级结构，相邻的三条反平行-链通过紧凑的-转角连接而成。,折叠在蛋白质中的不同形式,在蛋白质中(Rossmann折叠),理论上四条折叠有12种组合， 但是,Greek key 的由来,回形拓扑结构，反平行-折叠片中常出现的超二级结构，这种结构直接用希腊陶瓷花瓶上的一种常见图案命名，称为“Greek key”拓扑结构。有两种可能的回旋方向，实际上只存在一种，什么基础还没有确定。, - sheet 模式之一,- sheet 模式之一, - sheet 模式之二, - sheet 模式之三,细胞核抗原的结构,纤溶酶原的结构,（三）蛋白质分子的三级结构,1.三级结构（Tertiary structure）：整条多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。,相同的二级结构单元可以有多种排列方式,丙糖磷酸异构酶 二氢叶酸还原酶,8个折叠通过螺旋连接：TIM桶和具有混合折叠片的两相缠绕,折叠蛋白表面结合的水分子是其重要的结构部分,水与主链和侧链的极性基团形成氢键，彼此间也形成氢键，每个残基上都有几个这样的水分子，其中有些位置确定，每次测定时都可以观察到，因此这些水分子也应该视为三级结构的一部分,猪胰弹性蛋白酶表面的水合壳,膜蛋白的结构（孔或离子通道）,30Å,非极性 20 非极性aa,螺旋是膜蛋白中最常见的二级结构,细胞色素bcl复合物三维结构,全折叠的转运蛋白FhuA的三维结构，桶,钾离子通道三维结构,结构域（domain）：在较大蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成两个或者多个空间上具有明显区别的区域，这种局部区域就称为结构域。结构域之间是共价键连接。,Lac阻遏物四聚体,四聚化的域,DNA结合域,有疏水性核心，200aa，一个蛋白质最多13个域,按照包含的主要二级结构，将域折叠分成5类 域：主要由域组成 域：主要由域组成 /域：包含螺旋连接的链 +域：包含分离的螺旋和折叠 交联域：只有很少或没有二级结构，但由金属离 子或二硫桥稳定,域常见基序,四螺旋束,转运氧、结合核酸、转运电子生长激素,珠蛋白折叠,结合血红素肌红蛋白,域常见基序,免疫球蛋白轻链,果冻卷,流感病毒神经氨酸酶,希腊钥匙,前白蛋白,螺旋桨,细菌叶绿素A蛋白,/域常见基序,/桶，闭合结构，当有八条链时最稳定，称为TIM桶，磷酸丙糖异构酶。 /扭转，开放结构，6个链5个连接的螺旋。在酶中出现时，转折的区域总是蛋白质催化位点的一部分。核苷酸结合折叠。,+域常见基序,+马鞍,TATA结合蛋白，与DNA小沟结合,交联域常见基序,二硫键相连的蛋白质,通常为毒素，包括眼镜蛇的神经毒素，蝎子毒素。抗蛋白酶，热稳定。,锌指,（四）蛋白质分子的四级结构,体内许多蛋白质含有一个以上的肽链才能执行其功能，每条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基，多条肽链组装的蛋白质称为寡聚体。,组装体中亚基的数目和种类，连同他们在结构中的相对位置，接触部位的布局和构象形成了蛋白质的四级结构（Quaternary Structure）,所有特异性的分子间相互作用都依赖于互补性,氢键供体-受体 非极性基团-极性基团 正电荷-负电荷,白细胞介素-4及其受体,红色：负电 深蓝色：正电 浅蓝色：组氨酸 青色：谷氨酰胺 天冬酰胺 紫色：酪氨酸 黄色：丝/苏氨酸 绿色：疏水性氨 基酸,构型（configuration）：一个有机分子中各个原子特有的固定的空间排列。这种排列不经过共价键的断裂和重新形成是不会改变的。构型的改变往往使分子的光学活性发生变化。 构象（conformation）：指一个分子中，不改变共价键结构，靠单键的旋转所产生的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不要求共价键的断裂和重新形成，只是次级键断裂。构象改变不会改变分子的光学活性。,蛋白质的柔韧性,由于维系蛋白二级和三级结构的作用力很弱，体温下就有足够的能量破坏任何一种特定的相互作用，当已有的弱的作用力破坏后，被释放的基团就会发生新的相互作用，导致蛋白质的构象改变。,原子波动：原子间振动 甲基基团旋转 原子团运动：侧链摇摆 肽环翻转 配体诱导的构象变化,快,慢,底物或抑制剂结合诱导磷酸丙糖异构酶一个8aa环（红）移动10Å，覆盖在活性位点（蓝），将底物与溶剂隔开。,四、蛋白质结构与功能的关系,蛋白质的四种生物化学功能： 结合 催化 开关 结构元件,最基本的功能是结合，它是蛋白质其他功能的基础,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,1.一级结构是空间构象的基础,牛核糖核酸酶的结构,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,天然状态，有催化活性,蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。 Anfinsen （1972诺贝尔奖获得者）用极其简单的实验证明了 蛋白质的一级结构决定 其高级结构。,2.前体与活性蛋白质一级结构的关系,胰岛素的体内合成,胰岛素基因,mRNA,核糖体,B chain,A chain,胰岛素元 9kDa,胰岛素 5.5kDa,C 肽,GOLGI,分泌颗粒,血 液,Zn2+ MICROCRYSTALS,切割位点,A肽,B肽,30 aa,33 aa,21 aa,前胰岛素前体 11.5 kDa,RER,600 核苷酸,C肽,24 aa,信号肽,蛋白质以多肽链的形式被合成出来后，要形成特定的立体结构后才有生理活性。拥有生理活性的立体结构对每种蛋白质而言，是特定的和唯一的，通常称之为天然结构（native structure）。 蛋白质的天然立体结构在溶液中有一定的可塑性（弹性）。,有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形成自由能最低的立体结构，而需要一类蛋白质来催化，这类蛋白质称为分子伴侣 （ molecular chaperone）。它们普遍存在于真核生物和原核生物中，一般使用ATP的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的立体结构，但不改变自己。,蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸胍等化学试剂存在下会丧失活性，该现象称为蛋白质的变性（denaturation）。蛋白质变性的的化学本质是高级结构的破坏（一级结构不被破坏），特别是氢键的破坏。有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（renaturation）。,3.蛋白质一级结构的种属差异与分子进化,对于不同种属来源的同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但与功能相关的结构总是有高度的保守性。,脊椎动物的细胞色素C由l04个氨基酸残基组成；昆虫由108个氨基酸残基组成；植物则有112个氨基酸残基组成。其中有28个氨基酸残基是各种生物共有的，称为保守部位。包括第14和17位上两个半胱氨酸残基是细胞色素C与辅基血红素共价相连的位置；第70-80位上成串的不变氨基酸残基可能是细胞色素C与酶结合的部位。,4.蛋白质的一级结构与分子病,几乎所有遗传病都与蛋白质分子结构改变有关，称之为分子病。在蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响，导致疾病的发生。这种变异来源于基因上遗传信息的突变，所以是可遗传的。,与血红蛋白相关的分子病,镰刀状细胞贫血病-血红蛋白或链突变,地中海贫血-血红蛋白或链缺失,被称之为“分子病”的镰刀状细胞贫血仅仅是血红蛋白（Hb）亚基574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基即N端的第6位的谷氨酸（酸性)被缬氨酸（非极性）取代，发生了变异所造成的。突变导致本是可溶性的血红蛋白聚集成丝，相互粘着，导致红细胞变形而成镰刀状，极易破碎导致贫血。,镰刀状细胞贫血病,血红蛋白分子病,地中海贫血,产生原因： 缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因； 一个或多个基因无义突变缩短的蛋白链；发生移码突变不能合成正确的多肽链； 编码区外突变转录阻断或mRNA不能正确加工。,类型： -地中海贫血 -地中海贫血,(二)蛋白质空间结构与功能的关系,蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。蛋白质变性时，由于其空间构象被破坏，故引起功能活性丧失，变性蛋白质在复性后，构象复原，活性即能恢复。 在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应(allostery)。蛋白质(或酶)的别构效应，在生物体内普遍存在，这对物质代谢的调节和某些生理功能的变化都是十分重要的。,4个亚基组成，两两相同，每个亚基都有一个血红素辅基和一个氧结合部位。 Hb分子近似球形，4个亚基占据相当于四面体的四个顶角。,1.血红蛋白(hemoglobin,Hb)结构与功能,肌红蛋白与血红蛋白,蛋白质四级结构与功能的关系 变构效应,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。,血红蛋白的变构作用,肌红蛋白和血红蛋白氧解离曲线,蛋白质的功能（识别和催化）依赖于互补,红色：负电 蓝色：正电,蛋白质和配体结合的特异性来自于配体和蛋白质结合位点间形状和电荷分布的互补，氢键供体和受体的分布。,丝裂原活化蛋白激酶（配体）与炭疽毒素致死因子的结合,识别、互补和活性位点,2.蛋白质功能的结构基础,分子识别依赖于蛋白质四级结构创造的微环境,特异性的结合发生在蛋白质上与配体结合的位点，如果该位点仅有识别功能，称为配体结合位点，如果促进化学反应，则称为活性位点。,蛋白质包装时形成的内部空穴或者表面的口袋和狭缝，这些结构的微环境可能与蛋白质周围溶液不同，如内衬残基是疏水性的，则微环境类似于非极性有机溶剂，易于结合高度疏水的配体，如脂类；如残基均带负电荷，微环境则可能带有非常强烈的局部静电场，可以与高度带电的配体如钙离子结合。,柔韧性和蛋白质的功能,四级结构的柔韧性使得蛋白质适应其配体,蛋白质激酶A催化亚基（蓝）与天然底物的肽类似物（橙）相互调整形成紧密地契合。,诱导契合：原指由于底物结合引起的使酶催化基团正确排列的结构变化，现泛指特定配体诱导蛋白质变化，导致结合作用优化的现象,与三个不同抑制剂结合的艾滋病病毒HIV蛋白酶,结合位点的位置,蛋白质表面大分子的结合位点可以是凹、凸或平的,生长激素和受体 a.彩带图b.实心球模型,阻遏蛋白与tox 转录因子DNA序列结合 Gal4与DNA结合,RNA或DNA的结合位点是突出的环或者螺旋。,蛋白质对大分子的识别通常涉及大的区域,小分子的结合位点是狭缝、口袋或者空穴,细胞色素P450结合了底物樟脑的结构,紫色：血红素 红色：樟脑,蛋白质的柔韧性为配体进入内部提供了可能,催化位点常常位于域和亚基的界面,细菌二聚体酶3-异丙基苹果酸脱氢酶,两个活性位点结合了NAPDH（黄色）位于亚基和域的界面,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,朊蛋白正确构象,正确形式，蛋白酶敏感，溶于非离子去污剂,非正确形式，易形成聚集体，蛋白酶部分抗性，不溶于非离子去污剂,朊病毒：具有传染性的蛋白质，序列上和正常细胞中的蛋白质一致，但具有错误的折叠形式，具有感染性。,人：克雅病；羊：瘙痒病；牛：海绵状脑病,库鲁病克-雅二氏症疯牛病,20世纪末，人们最害怕的动物是牛-从英格兰蔓延出来的疯牛病。1985-4-25，英国农场原本温顺安静的乳牛变得有攻击性、紧张、动作失调。宰杀后作为饲料，18个月后，该农场又有7头母牛生病死亡。1987，疯牛病蔓延到英格兰和威尔士各地农场的牛群。1995年5月一只猫的死亡(症状与牛一样）引起了全国性恐慌，4年内死了62只猫。1993年，两名英国奶农死于克-雅二氏病。 库鲁病（新几内亚）仅发生于妇女和儿童（步态紊乱-颤抖-手足失济-瘫痪-不能吞咽-饿死或渴死），但头脑清楚、没有炎症。脑中有大量淀粉样蛋白（amyloid)。 1730最早报道的神秘疾病-羊瘙痒症，19世纪大流行，20世纪只是一种地方性疾病。 1963年，研究发现库鲁病的传播与富雷人食人有关（食用尸体是妇女和儿童的特权，所以男人很少得库鲁病），1965证实是一种传染病，且能跨种传播。,挑战 中心法则 ？,疯牛病研究,蛋白质的信息逆向地流向核酸？,1、朊病毒是蛋白质，没有通常我们认为是遗传物质的DNA、RNA等成分； 2、与朊病毒相对应的是具有正常功能的蛋白质，即朊病毒是正常功能的蛋白质空间结构变异所形成。,朊病毒,朊病毒的发现,朊病毒的发现 早在300年前，人们已经注意到在绵羊和山羊身上患的“羊瘙痒症”。其症状表现为：丧失协调性、站立不稳、烦躁不安、奇痒难熬，直至瘫痪死亡。 20世纪60年代，英国生物学家阿尔卑斯用放射处理破坏DNA和RNA后，其组织仍具感染性，因而认为“羊瘙痒症”的致病因子并非核酸，而可能是蛋白质。,1972年，由于Prusiner的一位病人死于克雅氏病，促使他开始研究这类疾病。经过10年努力，Prusiner与其同事终于在1982年从仓鼠脑中浓缩了羊搔痒病病原成分。是一种直径 25nm 长约100200nm 其浓缩成分的活性可被蛋白酶K，二乙酰焦碳酸、尿素、酚和SDS等失活的蛋白质，但不能被核酸酶E或紫外线照射破坏。所以Prusiner称之为Prion,意为蛋白性感染颗粒（Proteinaceous infectious particle）。这个成份中只含一种蛋白质，称为朊病毒蛋白（ prion protein, PrP），并命名为朊病毒（Virino）。,1997年诺贝尔生理学奖获得者是Stanley Prusiner，他发现了朊病毒，并提出一种新的生物学原理。,Gajdusek证实震颤病与羊搔痒症、人早老性痴呆属于同一病原感染，由此获得1976年诺贝尔生理学和医学奖。,1984年，Prusiner克隆了朊病毒基因病证明了正常的朊病毒蛋白是白细胞（淋巴细胞）的普通成分，可以在很多组织中找到。正常的朊病毒蛋白在大脑中的神经细胞表面分布特别多。他还发现很多遗传性的朊病毒疾病，是由于朊病毒基因突变所致。,朊病毒蛋白及其构型转变,PrPcPrPsc,PrPsc在N端切割可以产生PrP27-30，这种分子是一种蛋白酶抗性蛋白，能够聚集成为棒状淀粉样蛋白。,二级结构出现 转换 PrPc 螺旋含量达到42%， 片层仅占3%； PrPsc 螺旋含量降到30%， 片层达到45%； PrP27-30 螺旋含量则仅为21%，而片层达到54%。 片层含量的增加可能是聚合成淀粉样原纤维的最直接原因。,正常,异常,疯牛病就是牛的朊蛋白因某种原因变成了朊病毒,朊病毒蛋白形成过程,朊病毒的复制,朊病毒的复制模式,A：传染型和散发型的朊病毒复制模式； B：遗传型的朊病毒复制模式。,它没有核酸，能使正常的蛋白质由良性转为恶性，由没有感染性转化为感染性； 它没有病毒的形态，是纤维状的东西； 它对所有杀灭病毒的物理化学因素均有抵抗力，现在的消毒方法都无用，只有在136高温和两个小时的高压下才能灭活；这也许是人类战胜它的一个困难所在之处 病毒潜伏期长，从感染到发病平均28年，一旦出现症状半年到一年100死亡； 诊断困难，正常的人与动物细胞内都有朊蛋白存在，不明原因作用下它的立体结构发生变化，变成有传染性的蛋白，患者体内不产生免疫反应和抗体，因此无法监测。,朊病毒的特征,朊病毒（Prion）,也称传染性蛋白粒子/朊粒/朊病毒。是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚未定论的病原因子。其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白(prion protein, PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)的病原体。,一条肽链对应一个特定的空间结构，这条法则的破坏是灾难性的。导致疯牛病的prion就是一个例子。,正常prion,异常p