第14章DNA的生物合成.ppt

遗传信息的传递与表达,生物化学主要研究内容,基因（gene）： 生物活性产物编码的最小的DNA功能片段。其产物为各种RNA或蛋白质。 基因组（genome)： 某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。 基因表达（gene expression）： 指DNA分子中的遗传信息通过转录和翻译合成出蛋白质的过程。,中心法则（the central dogma）,第 十四 章 DNA的生物合成,导 学,1. 掌握DNA复制的基本规律。 2. 掌握参与DNA复制的各种主要酶的功能。 3. 掌握DNA生物合成的基本过程。掌握端粒的概念、合成和意义。 4. 掌握逆转录的概念。了解逆转录的应用。 5. 掌握DNA损伤修复的类型及特点。了解DNA突变的类型。,14.1 DNA复制的特征 14.2 DNA复制的酶学 14.3 DNA复制的过程 14.4 端粒DNA的合成 14.5 逆转录作用 14.6 DNA的损伤与修复 14.7 基因重组和克隆,14.1 DNA复制的特征,半保留复制 (semi-conservative replication) 双向复制 (bidirectional replication) 半不连续复制 (semi-discontinuous replication),14.1.1 DNA的半保留复制,全保留式 半保留式 混合式,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,半保留复制的实验证据：,Meselson & Stahl, 1958 同位素15N标记放射CsCl密度梯度离心实验。 首先验明了DNA的半保留复制的假说。,14.1.1 DNA的半保留复制,半保留复制（semi-conservative replication）： 复制时，每一条DNA链在新链合成中充当模板，按碱基配对方式形成两个新的DNA分子，每个分子都含有一条新链和一条旧链。,14.1.1 DNA的半保留复制,生物学意义： 半保留复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。,14.1.1 DNA的半保留复制,复制叉（replication fork） 复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成的Y字状结构。,14.1.2 DNA的双向复制,双向复制,双向复制验证试验,单向复制,第一次脉冲标记： 低放射性 （蓝色）,第二次脉冲标记： 高放射性 （红色内环）,1963年Cairns，3H掺入放射自显影实验。,14.1.2 DNA的双向复制,双向复制 DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,14.1.2 DNA的双向复制,原核生物双向复制型复制 只有一个复制起始点。,14.1.2 DNA的双向复制,复制子（replicon） 真核生物双向复制中两个起始点之间的DNA片段。 复制子是独立完成复制的功能单位。 染色体DNA有多个复制起始点。,合成方向和速度 方向： 新生DNA链的合成方向为：53。 速度： 原核生物复制叉移动快（约105 bp/min） E.coli的5×106个碱基在30min内可以完成一次复制。 真核生物复制叉移动慢（约5×1025×103 bp/min） 人的3×109个碱基在8h内可以完成一次复制。 （0.8min可以复制一次人的5×106个碱基）,为什么不是35？,为什么真核生物复制叉移动快却没有真核生物复制效率高？,14.1.2 DNA的双向复制,14.1.2 DNA的半不连续复制,DNA复制的几种可能方式,长片段,短时间 3H掺入,长片段 +短片段,短片段,自显影& 提取DNA,长片段,长片段,短片段,长时间 3H掺入,Okazaki，1968,DNA的半不连续复制 （semi-discontinuous replication）： 前导链（ leading strand ）的连续复制和后随链（ lagging strand ）的不连续复制方式。,14.1.2 DNA的半不连续复制,冈崎片段（Okazaki fragment）： 在不连续的后随链DNA合成中形成的DNA短片段。 在原核生物有10002000核苷酸，真核生物约100200核苷酸。,14.1.2 DNA的半不连续复制,14.1 DNA复制的特征小结,1、三种特征：半保留、双向、不连续性。 2、生物科学问题研究方式 提出问题建立假说实验验证,底物: dNTP (A/G/C/T) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶 其他酶: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、连接酶。,14.2 DNA复制的酶学,DNA复制的体系,模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3-OH末端的寡核苷酸,DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol）： 以单链或双链DNA为模板，催化由脱氧核苷三磷酸合成DNA的酶。 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 种类： 大肠杆菌：DNA聚合酶、和。 真核生物：含有DNA聚合酶 、和。,14.2.1 DNA聚合酶,14.2.1 DNA聚合酶,聚合活性的化学反应,Polymerase,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合活性的作用特点,4种dNTP底物（A/G/C/T）,与之有高度亲和力； 接受模板指导； 遵循碱基互补原则，识别是否是正确的碱基； 无法催化2个游离的单核苷酸形成磷酸酯键； 需引物提供3-OH； 新链生长方向： 53。,14.2.1 DNA聚合酶,14.2.1 DNA聚合酶,核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物和突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,14.2.1 DNA聚合酶,DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol）： 以单链或双链DNA为模板，催化由脱氧核苷三磷酸合成DNA的酶。 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 种类： 大肠杆菌：DNA聚合酶、和。 真核生物：含有DNA聚合酶 、和。,1959 年获诺贝尔生理学或医学奖 在大肠杆菌中发现DNA聚合酶I。,奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg,14.2.1 DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶（pol) 性质： 53聚合酶活性， 53外切酶活性， 35外切酶活性。 生理功能： 校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。,14.2.1 DNA聚合酶,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸, 5 核酸外切酶活性 5 3 DNA聚合酶活性,N 端,C 端,DNA pol,14.2.1 DNA聚合酶,Klenow片段,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,大肠杆菌DNA聚合酶（pol） 性质： 53聚合酶活性， 3 5外切酶活性。 无 53外切酶活性。 生理功能： 只是在无pol及pol的情况下暂时起作用； 对模板的特异性不高,主要参与DNA损伤的修复。,14.2.1 DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶（pol） 组成： 至少由10种亚基组成，二聚体，其中、和组成 核心酶； 性质： 53聚合酶活性，3 5外切酶活性。 无 53外切酶活性。 生理功能： 真正起复制作用的酶，主要负责DNA链的延伸。,14.2.1 DNA聚合酶,核心酶,亚基：53聚合酶活性； 亚基：35外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶复制DNA的保真性； 亚基：可能起组建的作用。,亚基：犹如夹子，识别引物夹住DNA分子向前滑动； 其余的亚基：构成 -复合物，可增强核心酶活性的 作用。,夹子 装配复合体, 亚基：促使核心酶二聚化,核心酶二聚化,DNA聚合酶III有两个夹子装配复合体。,DNA 聚合酶 pol pol pol 亚基数目 1 7 10 53聚合酶活性 + + + 35外切酶活性 + + + 53外切酶活性 + - - 聚合速度(核苷酸/分) 1000-1200 2400 15000-60000 持续合成能力 3-200 1500 500000 生理功能 切除引物 修复 复制 修复,大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较,14.2.1 DNA聚合酶,DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol）： 以单链或双链DNA为模板，催化由脱氧核苷三磷酸合成DNA的酶。 种类： 大肠杆菌：DNA聚合酶、和。 真核生物：含有DNA聚合酶 、和。,14.2.1 DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶,14.2.1 DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,1. 遵守严格的碱基配对规律(错配率10-410-5)； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 (错配率10-410-5)； 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,14.2.1 DNA聚合酶,解螺旋酶（unwinding enzyme）： 又称解链酶（helicase）或rep蛋白。 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。 种类： 目前发现至少存在两种解螺旋酶。,14.2.2 解螺旋酶,单链DNA结合蛋白（single strand binding protein，SSB） 一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。 生理功能： 维持单链状态，防止复性；对抗核酸酶水解，保护单链完整。 作用原理： SSB可结合32个核苷酸单位，在DNA 解链中不断结合，脱离再结合。,14.2.3 单链DNA结合蛋白,拓扑异构酶（topoisomerase）： DNA复制时，负责调整DNA超螺旋的圈数。,DNA拓扑异构酶& ：,14.2.4 拓扑异构酶,(注: 拓扑一词的含义是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。),DNA连接酶（ligase）： 催化两段DNA片段之间形成磷酸二酯键，而使两段DNA连接起 来，不能将两条游离的DNA单链连接起来。 DNA连接酶催化的条件 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链必须是完整的； 需要消耗能量，原核生物中由NAD+供能，真核生物中由ATP供能。,14.2.5 DNA连接酶,14.2 DNA复制的酶学小结,14.3 DNA复制的过程,复制的起始 复制的延伸 复制的终止,14.3.1 复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端；形成引发体。,1、预引发 解旋解链，形成复制叉：,由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白结合在两条单链DNA上，形成叉状结构。,14.3.1 复制的起始,引发体组装： 由蛋白因子识别复制起始点，并与其他蛋白因子及引物酶一起组装形成引发体，含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构。,14.3.1 复制的起始,2、引发 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。,14.3.1 复制的起始,3,5,3,5,引物,引物酶,复制的延伸指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,14.3.2 复制的延伸,OH 3',3',特点： 由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。 在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶、和。,14.3.2 复制的延伸,过程 引发体移动 前导链的延长 滞后链的延长 环状结构；前一个冈崎片段的尾巴，切除引物。,14.3.2 复制的延伸,前导链,滞后链,引发体,14.3.2 复制的延伸,前导链和随从链同时合成的过程,阶段一,阶段二,14.3.2 复制的延伸,阶段三,阶段四,去除引物，填补缺口 连接冈崎片段： 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,14.3.3 复制的终止,细菌环状染色体： 两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。,细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子位点，大肠杆菌有7个终止子位点。 复制速度不同。,14.3.3 复制的终止,顺时针,逆时针,顺时针,逆时针,14.3.3 复制的终止,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。 在端粒酶（telomerase）的催化下，可进行延长反应。,14.3.3 复制的终止,真核生物染色体：,14.3 DNA复制的过程小结,复制过程简图,14.3 DNA复制的过程小结,14.3.4 原核与真核生物DNA复制的差异点,端粒（telomere）：真核生物线性染色体末端所具有的特殊结构，通常膨大成粒状。,14.4 端粒DNA的合成,14.4 端粒DNA的合成,功能,维持染色体结构的完整性； 端粒的存在使每次丢失的仅为端粒的一部分，从而保护了染色体内部的结构基因。 维持DNA复制的完整性。,结构特点,由末端DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,14.4 端粒DNA的合成,端粒DNA的合成： 在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,端粒酶： 一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 组成： 端粒酶RNA 端粒酶协同蛋白 端粒酶逆转录酶,14.4 端粒DNA的合成,端粒酶的分子结构,端粒的合成机制：不依赖模板，以爬行方式合成。,14.4 端粒DNA的合成,母链藉非标准碱基配对回折,DNA聚合酶复制子链,端粒合成完成,进一步加工,14.4 端粒DNA的合成,端粒及端粒酶的生理意义 成年人端粒比胚胎细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。,抗肿瘤靶点,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,Elizabeth Blackburn,Carol Greider,Jack Szostak,14.4 端粒DNA的合成,2009年诺贝尔医学奖,14.5 逆转录作用,逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程，又称反转录。,逆转录酶 (reverse transcriptase) 从RNA病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶。,有三种活性： RNA指导的DNA聚合活性 DNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性（专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5' 3'和3' 5'两个方向起核酸外切酶的作用。 ）,14.5 逆转录作用,14.5 逆转录作用,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,14.5 逆转录作用,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA complementary DNA,cDNA法,14.5 逆转录作用,逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现； 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能； 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,14.6 DNA的损伤（突变）与修复,14.6.1 DNA的损伤(突变) 14.6.2 引起DNA突变的因素 14.6.3 DNA损伤的修复,DNA损伤 （DNA damage）： 泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和DNA链的断裂。 DNA突变（DNA mutation）： 由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,14.6.1 DNA的损伤（突变）,14.6.1 DNA的损伤（突变）,DNA突变的类型,DNA突变的效应,14.6.1 DNA的损伤（突变）,同义突变：基因突变导致mRNA密码子第三位碱基改变，其意义不发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。 错义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。 无义突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换而改变成终止密码子，引起多肽链合成的终止。 移码突变：基因突变导致mRNA密码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。,突变的意义,突变是进化、分化的分子基础 突变导致基因型改变 突变导致死亡 突变是某些疾病的发病基础,14.6.1 DNA的损伤（突变）,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,14.6.1 DNA的损伤（突变）,DNA突变导致疾病（例子）,1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。,14.6.1 DNA的损伤（突变）,14.6.2 引起DNA突变的因素,自发性: 自然错配率约为10-910-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致癌剂。 生物因素: 抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。,物理因素,紫外线,14.6.2 引起DNA突变的因素,14.6.2 引起DNA突变的因素,常见的化学诱变剂,化合物类别,作,用,点,分子改变,碱基类似物,如：,5,-,BU,A,®,5,-,BU,®,G,-,A,-,-,T,-,-,G,-,-,C,-,羟胺类（,NH,2,OH,）,T,®,C,-,T,-,-,A,-,-,C,-,-,G,-,亚硝酸盐（,NO,2,）,C,®,U,-,G,-,-,C,-,-,A,-,-,T,-,烷化剂,如：氮芥类，,Nitromins,G,®,m,G,G,®,m,G,DNA,缺失,G,化学因素,修复 对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。 修复方式 直接修复：光复活修复、转甲基作用、直接连接； 取代修复：切除修复、重组修复、SOS修复。,14.6.3 DNA损伤的修复,转甲基作用： 在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。 直接连接： DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。,14.6.3 DNA损伤的修复,光复活： 能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。,光修复酶,14.6.3 DNA损伤的修复,切除修复,它是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.Coli 的切除修复机制,14.6.3 DNA损伤的修复,切除修复动画,14.6.3 DNA损伤的修复,切除修复对多种DNA损伤起修复作用： 碱基脱落形成的无碱基位点 嘧啶二聚体 碱基烷基化 单链断裂 碱基错配 庞大的化学附加物 链间交联,14.6.3 DNA损伤的修复,着色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP) 切除修复缺陷性的遗传病。 XP病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低，不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，因此易发生皮肤癌。,14.6.3 DNA损伤的修复,重组修复,14.6.3 DNA损伤的修复,跳过损伤部位,新链产生的缺口由母 链通过重组方式弥补,原损伤部位并没有切除，但在后代逐渐稀释。,SOS修复,这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,14.6.3 DNA损伤的修复,14.6.3 DNA损伤的修复,进化、变种、癌症、诱变育种等都是基于这一机理,14.7 基因重组和克隆,基因重组（gene recombinant）： 由不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合并形成新的DNA分子的过程。,接合作用 (conjugation),转化作用 (transformation),转导作用 (transduction),转 座 (transposition),同源重组 (homologous recombination),位点特异的重组(site-specific recombination),克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 基因克隆（gene clone）： 在体外对DNA按照即定目的和方案进行人工重组，将重组DNA导入靶细胞进行扩增以获得目的基因的大量拷贝的过程。,14.7 基因重组和克隆,基因克隆的技术DNA重组技术（DNA recombinant technology）,14.7 基因重组和克隆,基因工程（genetic engineering）： DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游的DNA重组技术和下游的基因工程菌或细胞（生物体）的大规模培养、基因产物的分离纯化及其应用等。,Stanley Cohen Herb Boyer,1986年Nobel生理医学奖,14.7 基因重组和克隆,基因克隆的基本过程,分,分离目的基因和载体基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,基因载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,14.7 基因重组和克隆,质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的、并能稳定遗传的双链闭合环状DNA分子。,14.7 基因重组和克隆,14.7 基因重组和克隆,萤火虫的荧光素基因 在烟草中表达,人生长素基因被导入并整合到右边小鼠的基因组中,番茄工程植株具有抗昆虫幼虫的能力,DNA复制的特点：半保留复制、半不连续复制、需要引物、复制起点与方向、复制有关的概念； DNA复制的条件：底物、模板、引发体、DNA聚合酶、DNA复制有关的酶和蛋白因子； DNA复制的过程：起始、延伸与终止、 DNA复制的保真性； 端粒DNA的合成：端粒酶和端粒的合成机制； 逆转录作用：反转录酶和逆转录过程； DNA的损伤与修复： DNA的损伤、引起损伤的因素、光复活修复、切除修复、重组修复、SOS修复。,