chapter5分子磷光和荧光.ppt

一、分子荧光与磷光产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 二、激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure 四、影响荧光强度的因素 factor influenced fluorescence,molecular luminescence analysis,molecular fluorescence and phosphorescence,第五章 分子发光分析法,第一节 分子荧光和磷光,光分析法及其特点,概念,基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法,相互作用方式,发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等,电磁辐射基本性质,(1) 吸收 物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能 级跃迁到高能级； (2) 发射 将吸收的能量以光的形式释放出； (3) 散射 丁铎尔散射和分子散射； (4) 折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同； (5) 反射 (6) 干涉 干涉现象； (7) 衍射 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象； (8) 偏振 只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。,电磁辐射范围：射线-无线电波所有范围,光分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可取代的地位,三个基本过程,（1） 能源提供能量 （2） 能量与被测物之间的相互作用 （3） 产生信号,基本特点,（1）所有光分析法均包含三个基本过程 （2）选择性测量，不涉及混合物分离 （3）涉及大量光学元件,三、光分析法分类,1、光谱法,基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长强度进行分析的方法,（1）原子光谱：常见三种,基于原子外层电子跃迁: 原子吸收光谱（AAS）、原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS）,基于原子内层电子跃迁: X-射线荧光光谱（XFS） 基于原子核与射线作用: 穆斯堡谱，能量分辨率可高达10-13,（2）分子光谱,基于分子中电子能级、振-转能级跃迁,紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS） 核磁共振与顺磁共振波谱（NMR）,2、非光谱法,不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变转播方向等物理性质；,偏振法、干涉法（测膜厚和折射率）、旋光法等,各种光分析法,1. 原子发射光谱分析法,以火焰、电弧、等离子炬等作为光源，使气态原子的外层电子受激发射出特征光谱进行定量分析的方法,2. 原子吸收光谱分析法,利用特殊光源发射出待测元素的共振线，并将溶液中离子转变成气态原子后，测定气态原子对共振线吸收而进行的定量分析方法,3. 原子荧光分析法,气态原子吸收特征波长的辐射后，外层电子从基态或低能态跃迁到高能态，在10-8s后跃回基态或低能态时，发射出与吸收波长相同或不同的荧光辐射，在与光源成90度的方向上，测定荧光强度进行定量分析的方法,4. 分子荧光分析法,某些物质被紫外光照射激发后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法,5. 分子磷光分析法,处于第一最低单重激发态分子以无辐射弛豫方式进入第一三重激发态，再跃迁返回基态发出磷光。测定磷光强度进行定量分析的方法。,6. X射线荧光分析法,原子受高能辐射，其内层电子发生能级跃迁，发射出特征X射线（ X射线荧光），测定其强度可进行定量分析。,7. 化学发光分析法,利用化学反应提供能量，使待测分子被激发，返回基态时发出一定波长的光，依据其强度与待测物浓度之间的线性关系进行定量分析的方法。,8. 紫外吸收光谱分析法,利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。,9. 红外吸收光谱分析法,利用分子中基团吸收红外光产生的振动-转动吸收光谱进行定量和有机化合物结构分析的方法。,10. 核磁共振波普分析法,在外磁场的作用下，核自旋磁矩与磁场相互作用而裂分为能量不同的核磁能级，吸收射频辐射后产生能级跃迁，根据吸收光谱可进行有机化合物结构分析。,11. 顺磁共振波谱分析法,在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁，根据吸收光谱可进行结构分析。,12. 旋光法,溶液的旋光性与分子的非对称结构有密切关系，可利用旋光法研究某些天然产物及配合物的立体化学问题，旋光计测定糖的含量。,13. 衍射法,X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具有不同衍射图 电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的基础，研究物质的内部组织结构。,一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence,1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在两个轨道中自旋方向平行的电子，这时S=1，M=3，这种状态称为三重态或三线态。,平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；,2.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁（热）等方式失去能量；,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大； 荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；,S2,S1,S0,T1,吸 收,发 射 荧 光,发 射 磷 光,系间跨跃,内转换,振动弛豫,能 量,l 2,l 1,l 3,外转换,l 2,T2,内转换,振动弛豫,1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR) 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 2)内转化( Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。,非辐射能量传递过程,3)系间跨跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1T1就是一种系间跨跃。通常，发生系间跨跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。 有时，通过热激发，有可能发生T1S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 4)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光；而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为 2的荧光。时间 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态 （ T1 S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程（ S0 T1）是禁阻跃迁，几率小。 发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。所谓的“在黑暗中发光“的材料通常都是磷光性材料，如夜明珠。,二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum,荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？ 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下荧光强度的变化。以激发波长（）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。,激发光谱中荧光强度最大处所对应的激发波长称为最大激发波长。激发光谱的形状与测量时选择的发射波长无关，但其相对强度与发射波长有关。通常用最大激发波长辐射样品。,2.荧光光谱(或磷光光谱),固定激发光波长和强度(选最大激发波长), 让物质发出的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以荧光的波长（）为横坐标，荧光强度（IF）为纵坐标作图，便得荧光光谱。(图中曲线II或III)。,荧光光谱中荧光强度最大处所对应的发射波长称为最大发射波长。,3.激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，经过内转化和振动弛豫但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,解释2：位能曲线(Frank-Condon原理) 由于电子吸收跃迁速率极快(10-15s)，此时核的相对位置可视为不变(核较重)。当两个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽的激发光谱和荧光光谱,三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure,1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构, 才能吸收激发光； （2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示 荧光量子产率（）：,在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间跨跃和外转移等。因此，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。 如外转换过程速度快，不出现荧光发射。,2 .化合物的结构与荧光 (1)跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历或n(非键电子轨道)激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。 跃迁常能发出较强的荧光(较大的量子产率)。这是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数(一般比n大100-1000倍)。 其次，跃迁的寿命约为10-710-9s，比n跃迁的寿命10-510-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃至三重态的速率常数也较小，有利于荧光的产生。 S1T1能级差较大，这也有利于荧光的发射。 总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。,(2)共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭体系化合物除外)。 此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。 例如：在多烯结构中，Ph(CH=CH)3 Ph和Ph(CH=CH)2 Ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28。 共轭效应使荧光增强的原因 ： 主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。,(3)刚性平面结构 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。 (4)取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。 给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。 吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。,卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显著的影响。 5 、金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。,(1)螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。 如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。 (2)螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd*跃迁和ff*跃迁，最终发射的是dd*跃迁和ff*跃迁光谱。,四 影响荧光强度的因素 溶剂对荧光强度的影响 溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应：溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应：荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂同一种,荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显著不同。 有的情况，增大溶剂的极性，将使n跃迁的能量增大， 跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。 但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。 如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的电性状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。, 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。 其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。 另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。 溶液pH值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。 具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构 可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。,对于金属离子与有机试剂形成的发光螯合物，一方面pH会影响合螯物的形成，另一方面还会影响螯合物的组成，从而影响它们的荧光性质。 内滤光作用和自吸收现象 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。如色胺酸中的重铬酸钾。 如荧光物质的荧光发射光谱的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠，产生“自吸收”现象，而降低了溶液的荧光强度，如蒽化合物 。,顺磁性物质的存在，使激发单重态的系间跨跃速率增大,因而会使荧光效率降低。 5、溶液荧光猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。 能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。 导致荧光猝灭的主要类型： 碰撞猝灭 碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。, 静态猝灭(组成化合物的猝灭) 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。 转入三重态的猝灭 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应。是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。, 发生电子转移反应的猝灭 某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。 荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。,一、 仪器与结构流程 instrument and general process 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application,第二节 分子荧光与磷光分析法,molecular luminescence analysis,molecular fluorescence and phosphorescence analysis,第五章 分子发光分析法,一、仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,光源：氙灯、高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区) 样品池：石英(低荧光材料) 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 检测器：光电倍增管。,仪 器 光 路 图,仪器框图,该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；,同步扫描技术,根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；,同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。,可获得三维光谱图的仪器,可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图,黄酒的荧光光谱研究,获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息,采用FLS920稳态荧光光谱仪,磷光检测,荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。,测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。,二、荧光分析方法与应用,1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级； 检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 （3）试样量少 缺点：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。,2. 定量依据与方法,(1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc,（2）定量方法,标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；,3.荧光分析法的应用,(1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 见表,三、磷光分析法的应用,1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表 2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.药物分析和临床分析 见表,第五章 分子发光分析法,一、基本原理 principle 二、化学发光分析的特点 characteristics 三 装置与技术 instrument and technology,第三节 化学发光分析法,molecular luminescence analysis,chemiluminescence analysis,一、基本原理 principle,1. 化学发光反应 在化学反应过程中，某些物质由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt 分析物参加反应的速率；,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：,dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。 定性依据： （1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。 a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875 nm，灵敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200 nm；灵敏度1 ng/cm-3；,O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：4001400 nm；灵敏度1 ng/cm-3； 氧原子与CO的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：300500 nm；灵敏度1 ng/cm-3；,氧原子与NO的发光反应：,（2）火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：660770 nm； 最大发射波长：690 nm； 在富氢火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速；,b.硫化物,挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 发射光谱范围：350460 nm； 最大发射波长：394 nm； 灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,（3）液相化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。,鲁米诺作为一种有效的化学发光试剂。 利用金属离子或过渡金属离子的不饱和配合物对鲁米诺发光体系有很强的催化作用，可以测定金属离子或有机配体。 苯甲酸与Cu(II)形成的不饱和配合物对鲁米诺-H2O2体系的催化作用，建立了测定苯甲酸的流动注射分析方法。 利用有机化合物或稀土离子对鲁米诺化学发光反应的抑制作用，测定对化学发光反应具有猝灭作用的有机化合物或稀土。 碱性条件下扑热息痛对鲁米诺-铁氰化钾体系发光反应的强烈抑制作用，可化学发光测定痕量扑热息痛。 通过偶合反应可以间接测定无机或有机化合物。,5. 化学与生物发光分析的应用,（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样,氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,生物发光分析应用 1,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP· LH2 · E +Mg ppi + 2H+,pH7 - 8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP· LH2 · E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O 氧化荧光素* 氧化荧光素 + h 最大发射波长562 nm；,生物发光分析应用 2,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：,NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2,NADH脱氢酶,FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,二、特点 characteristics,1. 灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正； 3. 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰； 4. 线性范围宽 5. 分析速度快 缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,三、装置与技术 instrument and technology,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,采用FLS920稳态荧光光谱仪光源为450 W 的弧光Xe灯,黄酒的荧光光谱研究,儿茶素与DNA分子间的相互作用机制研究,儿茶素本身具有较强的内源性荧光，但随着加入DNA浓度的增大而有规律的猝灭。这是由于儿茶素嵌插进DNA的双螺旋结构，产生电荷转移，进而改变了自身激发态的电子态，导致荧光降低。,稀,浓,日立F4500荧光光度计,荧光光谱用荧光分光光度计(SPF-500C，SLMAMINCO)测定，激发光源为300 W 高压氙灯。,