Westernblot.ppt
2010.8.2 Clinx Science Instruments,Western blot,主要内容,Western blot 介绍 Western blot 应用 Western blot 实验过程,印迹法（blotting）,blotting，Southern blotting，Northern blotting ，Western blotting 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到NC膜上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,流程图,Western blot,蛋白质印迹 (Western blot) 又称免疫印迹 (immunoblotting) 蛋白质印迹分析(Western Blot Analysis),Western Blot,Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,Western blot 特点,蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。,Western blot -ECL,早先Western Blot主要采用同位素标记 酶促反应比同位素安全且快速，逐渐成为Western Blot的主流检测方法。 酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen 随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素,ECL化学发光,化学发光ECL Western Blotting，主要是依据检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种分析方法,ECL化学发光,多数特异抗原检测方法以辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP) 二级抗体 耦联物为基础。信号可通过感光胶片或专用的成像设备来采集。化学发光底物用于免疫印迹技术已有十几年的历史，目前大部分实验室做转印时都会采用化学发光技术进行检测。,发光液,ECL( Enhanced Chemiluminescence) 一般的发光试剂含鲁米诺（luminol）和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，增强剂在HRP-鲁米诺-H2O2体系中扮演着核心角色。,发光液,理想的发光液： 发光灵敏，目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上，可以检测pmol甚至fmol级别的HRP，发光的灵敏度实际上已不是问题。 发光稳定，这是目前研究的重点之一，发光不稳定的增强剂，容易在一些情况下发生“淬灭”，即快速消耗发光试剂，在几秒钟内发强光，又在几秒钟内迅速消逝，不容易被检测的现象。 本底或背景低，这是发展的方向之一，由于化学发光反应对增高本底的因素很敏感，因此，化学发光分析欲得到准确可靠的结果，就必须确保试剂的特异性，在无HRP或很少HRP的情况下，不发光或很少发光。,应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western blot 流程,转膜,戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜1530min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置,电泳,常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,封闭,用5脱脂奶粉或3BSA （含0.1Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温2h或4ºC过夜,显色,显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定,
