环境生物学——共代谢.ppt

第四章 微生物对污染物的作用,1.微生物的降解作用 2.共代谢 3.微生物的去毒作用 4.微生物的激活作用,第一节 微生物的降解作用,降解微生物 基质代谢的生理过程 污染物生物降解的动力学,降解微生物,降解微生物的种类繁多，细菌、真菌和藻类都可以降解有机污染物,细菌,细菌是不具有细胞核的微生物 细菌大约有29门 包括：真细菌（bacteria） 蓝细菌（cyanobacteria） 古细菌（archaea） 很多种类都可以对有机物进行降解 见表4-1（1）（3） 细菌是降解有机污染物的“主力军”,细菌,细菌的基本形态 （1）球菌：按其排列方式又可分为单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌，葡萄球菌、链球菌 （2）杆菌：细胞形态较复杂，有短杆状、棒杆状、梭状、月亮状、分枝状。 （3）螺旋状：可分为弧菌（螺旋不满一环）和螺菌（螺旋满26环，小的坚硬的螺旋状细菌）。此外，人们还发现星状和方形细菌。,细菌,细菌,细菌与真菌的不同 生物类型不同 细胞结构不同 细胞大小不同 增殖方式不同 名称组成不同,细菌,细菌的结构,细菌,梭菌属,脱硫肠状菌属,细菌,代表性蓝细菌,细菌,一些产甲烷细菌,细菌,表4-1 主要降解细菌及其作用基质举例（1）,细菌,表4-1 主要降解细菌及其作用基质举例（2）,细菌,表4-1 主要降解细菌及其作用基质举例（3）,细菌,表4-1 主要降解细菌及其作用基质举例（4）,细菌,海岸石油污染的清除,费时、费力、成本高、清除不完全,细菌,细菌的应用实例（废水处理）：,日本的科研人员在土壤中发现一种细菌，具有把工业废水中的三氯乙烯分解成二氧化碳和别的无害物质，使浓度极高的废水得到净化。据称，利用这种细菌是迄今为止最有效的分解含氯溶剂的办法。 德国科研人员在一座铜矿中发现了一种被称为“氧化铁硫杆菌”的细菌，它能将大量珍贵的重金属从废水中分离出来，得以重新利用，废水经过细菌净化后，再用其他方法将这种细菌杀死，这样的废水就不会对环境造成任何危害了。 英国利兹大学研究人员新发现一种爱吃工业染料的细菌。这种在工厂排水管中发现的腐败细菌，喜食染料，并能最终将染料完全分解。研究人员在试验室中进行的测试显示，仅需少量的细菌即可在一天内净化25升含染料的废水。,真菌,真菌是一大类真核异养微生物 包括：酵母 霉菌 大型真菌 能降解有机物的一些真菌列于表4-2。,真菌,单细胞酵母,面包酵母,真菌,曲霉的分生孢子,曲霉引起的真菌性角膜炎,真菌,青霉,孢子囊,黑曲霉,真菌,双孢菇,真菌,金针菇,杏鲍菇,真菌,表4-2 几类能降解有机污染物的真菌举例,藻类,藻类是含有叶绿素并能产生氧的光能自养菌 生活在水中，利用CO2合成有机物，但在黑暗时也会利用少量有机物。 利用藻类和菌类共栖可降解有机物 氧化塘(稳定塘)是降解有机物的例证 藻类可降解酚类化合物 苯酚、邻甲酚、1,2,3苯三酚等 20种不同藻类培养物具有氧化降解萘的能力。,藻类,小球藻(Chlorella vulgaris)对大部分偶氮染料有一定的脱色能力 藻类对偶氮染料的脱色程度与染料化学结构有关 藻类降解偶氮化合物的特点 对pH、光强度及温度均有较宽的适应范围 能保持较高的降解活性 在水中的藻菌共生体系中可以彻底矿化有机物 在污水生物净化中应用较多,基质代谢的生理过程,有机物（基质）受微生物作用而分解的过程。一般分好氧分解（主要是好氧细菌活动的结果）和厌氧分解（主要是厌氧细菌活动的结果）。,基质代谢的生理过程,以污染物质作为基质的代谢基本过程和其他化合物的代谢相似，可能包括如下过程： 向基质接近 对固体基质的吸附 分泌胞外酶 可渗透物质的吸收和胞内代谢 通常采用的研究方法 用单一菌种在高浓度纯品下进行的间歇式培养。这种方法虽然很重要，但会掩盖自然界的很多真相。,基质代谢的生理过程,（一）向基质接近 生物体要降解基质必须先与之接近并接触 接近意味着 (1)微生物处于这种物质的可扩散范围之内 (2)胞外酶处于这种物质可扩散范围之内 (3)微生物处于细胞外消化产物扩散距离之内 不同环境微生物的作用差别很大 液体环境(湖泊、河流、海洋)混合良好 固体环境(土壤、沉积物)基本不相混合 运动扩散障碍对土壤中微生物的移动有显著影响。,基质代谢的生理过程,某些微生物表现出朝向基质的趋向性，许多丝状真菌表现为朝向基质生长。 例如：担子菌垂幕菇属(Hypholoma)和原毛平革菌属(Phanerochaete)能够“探查”环境，找到没有接种过的木块，然后在其上定殖。,Hypholoma,Phanerochaete,基质代谢的生理过程,（二）对固体基质的吸附 吸附作用对于保证污染物质代谢是必不可少的。 研究发现 土壤中微生物通常聚集在微团聚体中 用水或土壤分散剂浸提的微生物数量不同 纤维素消化过程需要有物理附着 在沥青降解菌的分离过程中，发现细菌和固体基质之间有非常紧密的结合。,基质代谢的生理过程,（三）胞外酶的分泌 一般来说，不溶性的多聚体不论是天然的(如木质素)还是人工合成的(如塑料)都难降解。 不能降解的原因 分子太大 生物采取的办法 （1）微生物分泌胞外酶 （2）将其水解成小分子量的可溶性产物 影响胞外酶活动性的障碍因素 胞外酶被吸附、胞外酶变性、胞外酶蛋白生物降解以及产物被与之竞争的生物所利用。,基质代谢的生理过程,（四）基质的跨膜运输 基质通常要由特定的、诱导性的运输系统吸收到细胞内。这在自然环境中尤其重要。 在环境中基质浓度很低，通常只有微摩尔级，而微生物生理学家的研究经常在毫摩尔级。在低浓度下需要有积累机制。 高浓度污染物对微生物是有害的，将影响细胞膜的正常结构和生理功能。,基质代谢的生理过程,营养物质必须通过细胞膜才能进入细胞，细胞 膜为磷脂双分子层，其中嵌合蛋白质分子。 细胞膜控制着营养物进入和代谢产物的排出。 细胞膜以四种方式控制物质的运输 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团转位,基质代谢的生理过程,1.单纯扩散(simple diffusion) 又称被动运输(passive transport) 细胞膜这层疏水性屏障可以让很多小分子、非电离分子尤其是亲脂性分子通过物理扩散方式被动地通过。 主要包括 氧、二氧化碳、乙醇和某些氨基酸。 C12以下的烃类可以扩散进入细胞膜 被动扩散方式不需要载体蛋白，不需要提供能量，扩散动力是内外浓度梯度差。 被动运输在自然环境中不多，它不是主要的基质转移方式。,基质代谢的生理过程,2.促进扩散(facilitated diffusion) 和单纯扩散一样，必须是从环境中的高浓度向细胞内的低浓度扩散，同样不需要额外提供能量。 与单纯扩散的主要差别 基质越过细胞膜要依靠膜上特异性的载体蛋白通道。 载体蛋白具有酶的性质，又称透性酶、移位酶或移运蛋白，可以通过诱导产生。 这种方式只能在高营养物浓度时发挥作用。,基质代谢的生理过程,促进扩散模式图,基质代谢的生理过程,3.主动运输 (active transport) 是微生物吸收基质的主要方式 特点 需要特异性载体蛋白作为载体，需要能量(质子势、ATP)，溶质和载体结合发生构象变化，可以逆浓度梯度运输，从而使生活在低基质环境中的微生物获得营养物。 可运送的营养物有 无机离子，有机物分子，一些糖类,基质代谢的生理过程,基质代谢的生理过程,4.基团转位 是一种既需要特异性载体蛋白又要耗能的运送方式。 基质在转运前后分子结构会发生变化 因此，不同于主动运输。 基团转位主要作用 用于葡萄糖、果糖、甘露糖、核苷酸等物质的运输。,基质代谢的生理过程,基团转位：细菌PTS运输系统,基质代谢的生理过程,基质代谢的生理过程,（五）细胞内代谢 环境污染物质进入细胞后可以通过周边代谢途径被降解。 这类代谢通常是有诱导性的，并且有些是由质粒编码的。 初始代谢产物通常汇集到少数一些中央代谢途径之中。 例如 在芳香族化合物的代谢中，通过B-酮己二酸盐途径，进入中央代谢途径。,基质代谢的生理过程,1.遗留代谢物 基质生物降解，除去完全矿化或共代谢作用外，还可以有遗留代谢物产生，它们可以被其他生物作为代谢基质或作为共代谢基质所利用。 例如 以葡萄糖为基质，间歇式培养大肠杆菌的生长过程中会有乙酸盐暂时积累。 难降解的环境污染物在代谢过程中多数会有遗留代谢物产生。,基质代谢的生理过程,2.终死产物 终死产物会短暂地积累，不能继续代谢。 芳香化合物上的甲基氧化产生的甲醇 终死产物本身是持久性化合物（POPs） 如：多聚儿茶酚 3.副反应产物 有益的副反应产物可以被其他生物利用 有害的副反应产物不被利用 卤代酚由微生物的甲氧化反应形成，有很强的生物积累潜力并且有毒。,基质代谢的生理过程,4.致死性代谢物 由氟取代的基质通过酶促反应形成氟代乙酸盐，它可抑制三羧酸循环。 可以通过突变作用避免产生致死性代谢物。突变作用可使有机体不形成致死代谢物或可以抵抗致死代谢物。,污染物生物降解的动力学,研究动力学过程对评价微生物系统降解有机物质的能力具有重要意义。 降解动力学指靶化合物的微生物降解速率 由于生物系统包含许多不同的微生物，每种微生物又有不同的酶系，各自的降解反应可以有很大差异。因此，常用总的“表观速率常数”来描述生物体系的降解速度。 降解速率常数一般在实验室模拟测定,污染物生物降解的动力学,通过研究基质浓度与降解速率之间的关系，提出两类常用的经验模式： 幂指数定律 不考虑微生物生长的基质降解模式 根据幂指数定律，降解速率与基质浓度n次幂成正比(式4-1)： 式中: S为基质浓度 k为生物降解速率常数 n为反应级数,污染物生物降解的动力学,反应可以是零级反应，即反应速率与任何基质浓度无关，即(4-1)式可以表示为： (4-2) 对其积分，速率定律的形式转化为： St - S0 = - kt (4-3) 式中：S0为基质的起始浓度 St为任意时间t的基质浓度 零级反应适应于单一的反应物转变为单一的生成物的情况，或基质浓度很高的情况。,污染物生物降解的动力学,当基质浓度很低，又不了解系统的动力学关系的情况时，可假定n为1（一级反应）。 一级反应为反应速率与基质浓度成正比。降解速率取决于基质浓度，而基质浓度又随时间而变化。 一级反应中基质浓度随时间的变化如图4-1a所示。通过半对数坐标转换，基质浓度的对数随时间的变化为线性关系(图4-1b)。 在一级反应中,降解速率方程: (4-4),污染物生物降解的动力学,a. 基质浓度不做处理 b. 基质浓度取对数 图4-1 基质浓度随时间以一级反应速率消失,污染物生物降解的动力学,对方程(4-4)积分,得到速率的积分形式： St = S0e-kt (4-5) 或 ln(St/S0)=-kt (4-6) 根据ln(St/S0)和时间t的斜率即可求出k值。 半衰期(t1/2)： 原始基质浓度降解一半所需要的时间 t1/2 =ln2/k (4-7) 已经得到了一些不同基质条件下有机化合物的半衰期。 表4-3中，根据有机物在环境中的半衰期，对其生物降解性进行分类。,污染物生物降解的动力学,表4-3 有机物的生物降解作用与半衰期 在多种基质的混合废水中，每种基质的去除虽以恒速进行（零级反应），不受其他基质的影响，但基质的总去除量则为每个单一基质去除量总和。所以，可以认为整个系统的动力学循环仍然为一级反应关系。,污染物生物降解的动力学, 对二级反应，其反应速率方程式表示为： （4-8） 式（4-8）的积分形式为： （4-9） 在下列反应中，反应会呈二级反应： 2A（反应物） P（产物） （4-10） 在不同的环境中反应级数不同，可根据特定的一组浓度S和时间t的实验数据，根据式(4-3)、(4-6)和(4-9)来判断反应级数。,污染物生物降解的动力学,双曲线定律 考虑微生物生长的基质降解模式 在基质降解过程中，考虑微生物的生长时，基质浓度与微生物生长速率之间关系可以用双曲线定律来描述。 (4-11) 双曲线定律又称 Monod方程(1949年)，其形式与 Michaelis-Menten方程类似。,污染物生物降解的动力学,式中：为微生物的比增长速率，即单位生物量的增长速率，单位为(时间) -1； max为微生物的最大比生长速率，单位为(时间) -1； Ks为饱和常数，当=max /2 时所对应的基质浓度，单位为 mg/L。,污染物生物降解的动力学,图4-2 基质浓度与微生物比增长速率之间关双曲线方程,污染物生物降解的动力学,基质浓度与微生物种群生长速率之间的关系, 基质浓度较低时，微生物的比增长速率随基质浓度的增加呈线性增加。 在基质浓度较高时，比增长速率接近最大值，微生物的比增长速率与基质浓度无关。 微生物对基质的降解作用以及微生物的生长都要靠各种酶的催化作用。,污染物生物降解的动力学,Ks的物理意义 代表微生物与支持其生长的有机物的亲和力。 数值越小，细菌对基质的亲和力越大。 Ks值的跨度大 对一种细菌，不同的基质有不同的Ks 对同一基质，Ks值与细菌菌株有关， 同一个菌株在低浓度有一个Ks值，在高浓度有另一个Ks值。,污染物生物降解的动力学,表4-4 某些细菌或水样的Ks值,污染物生物降解的动力学,由表4-4的数据可以看出: Ks的差别很大，似乎无规律可循。 营养富集环境中的细菌比低有机成分的生境中的细菌有较高的Ks值。 在天然水中代谢的微生物可以迅速代谢加入的分子。,第二节 共代谢,共代谢基质与共代谢微生物 混合菌株的协同矿化作用 共代谢的原因 与共代谢相关的酶 共代谢的环境意义,共代谢,发现 早在20世纪60年代的研究中，发现一株能在一氯乙酸上生长的假单胞菌能够使三氯乙酸脱卤。然而，该菌株不能利用三氯乙酸作为碳源生长。 共代谢作用（Cometabolism） 某些有机物不能作为微生物培养的唯一碳源，必须有另外的化合物提供微生物碳源或能源，该有机物才降解，这类降解称共代谢作用。,共代谢基质与共代谢微生物,一、共代谢基质与共代谢微生物 1.共代谢基质 有许多化学品在培养物中可进行共代谢 例如 环己烷、PCBs、3-三氟甲基苯甲酸、氯 酚、3,4-二氯苯胺、1,3,5-三硝基苯、 毒草胺、甲草胺、禾草敌、2,4-D、 麦草畏等。,共代谢基质与共代谢微生物,表4-5 纯培养中的一些共代谢基质及其产物(1),共代谢基质与共代谢微生物,表4-5 纯培养中的一些共代谢基质及其产物(2),共代谢基质与共代谢微生物,2.实验室培养基中进行共代谢反应的细菌 假单胞菌属、不动杆菌属、诺卡氏菌属、 芽孢杆菌属、分枝杆菌属、节杆菌属、 无色杆菌属(Achromobacter)、产碱菌属、 甲基弯曲菌属(Methylosinus)、红球菌属、 黄色杆菌属(Xanthobacter)和亚硝化单胞菌届等。 3.进行共代谢反应的真菌 有青霉属(Penicillium) 丝核菌属(Rhizoctoia)等。,共代谢基质与共代谢微生物,4.共代谢中需要酶参与 一系列酶系在进行共代谢转化时进行着羟基化、氧化、去硝基、去氨基、水解、酰化或醚键裂等作用。 异养细菌和真菌进行的共代谢反应是多种多样的。 甲基营养菌的甲烷单加氧酶能够氧化烷烃、烯烃、仲醇、二(或三)氯甲烷、二烷基醚、环烷烃和芳香族等多种化合物。 珊瑚状诺卡氏菌(Ncorallina)可以共代谢三(或四)甲基苯、二乙基苯、联苯、四氢化萘和二甲基萘并产生多种产物。,混合菌株的协同矿化作作用,协同矿化作用 共代谢产物在培养液中积累，在自然界未必会积累。产物可在第二个菌株的作用下继续共代谢或完全矿化。 互补分解代谢 混合菌株能使基质完全矿化，使得基质完全降解。菌株互补分解代谢途径的出现启发人们通过遗传工程技术构建能够矿化母体化合物的新菌株。,混合菌株的协同矿化作作用,表4-6 一些双菌株的协同矿化作用(1),混合菌株的协同矿化作作用,表4-6 一些双菌株的协同矿化作用(2),共代谢的原因,一种有机物可以被微生物转化为另一种有机物，但它们却不能被微生物所利用，原因有以下几个方面(Alexander，1999)： (1)缺少进一步降解的酶系 微生物第一个酶或酶系可以将基质转化为产物，但该产物不能被这个微生物的其他酶系进一步转化，故代谢中间产物不能供生物合成和能量代谢用。这是共代谢的主要原因。,共代谢的原因,细胞中微生物酶对有机物矿化作用的过程如下: a b c ABCDCO2 +能量+细胞-C 在正常代谢过程中，a酶参与AB的转化，b酶参与BC的转化。 如果第一个酶a底物专一性较低，它可以作用许多结构相似的底物，如A或A，产物分别为B或B。酶b却不能作用于B或B使其转化为C或C,结果造成B或B积累， 即: a A B X,共代谢的原因,这种现象是由于最初的酶系作用的底物较宽，后面酶系作用的底物较窄而不能识别前面酶系形成的产物造成的。 这种解释的最初的证据来自对除草剂 2,4-D 代谢的研究。 2,4-D首先转化为2,4-二氯酚，但是只有部分酶或很少的酶能进一步代谢2,4-二氯酚。当发生这种情况时，共代谢产物几乎全部积累。,共代谢的原因,(2)中间产物的抑制作用 有机物在代谢过程中，最初基质的转化产物抑制了在以后起矿化作用酶系的活性或抑制该微生物的生长。 例如： 恶臭假单胞菌(Ps. putida)能共代谢氯苯形成3-氯儿茶酚，但不能将后者降解，因为它抑制了进一步降解的酶系。,共代谢的原因, 恶臭假单胞菌可以将4-乙基苯甲酸转化为4-乙基儿茶酚，而后者可以使以后代谢步骤必要的酶系失活。由于抑制酶的作用造成了恶臭假单胞细菌不能在氯苯或4-乙基苯甲酸上生长。,共代谢的原因,(3)需要另外的基质 有些微生物需要第二种基质进行特定的反应。 第二种基质可以提供当前细胞反应中不能充分供应的物质，例如转化需要电子供体。 有些第二种基质是诱导物，例如一株铜绿假单胞菌要经过正庚烷诱导才能产生羟化酶系，使链烷烃羟基化转化为相应的醇(王家玲，1988)。,与共代谢相关的酶,有些酶的专一性较差，可以作用于多种底物，这样导致了共代谢。 一些作用于一系列底物的单一酶系 （1）甲烷营养细菌的甲烷单加氧酶 甲烷营养细菌生长在甲烷、甲醇和甲酸中时，能够共代谢多种有机分子，其中包括一些主要污染物分子（如下反应所示）。 在这些反应中，甲烷单加氧酶起催化作用。,与共代谢相关的酶, 发孢甲基弯曲菌可以转化氯代脂肪烃为反式或顺式1,2-二氯乙烯,1,1-二氯乙烯, 1,2-二氯丙烷,1,3-二氯丙烯 生长在甲烷中的其他一些细菌的酶可以催化正烷烃(C2-C8),正烯烃(C2-C6)和单或双氯脂肪烃(C5-C6),与共代谢相关的酶,(2)甲苯双加氧酶 (dioxygenase) 许多好氧细菌中存在甲苯双加氧酶 甲苯双加氧酶可使甲苯与O2结合 酶专一性较低 可以降解三氯乙烯(TCE) (Nelsonelal，1988；Li & Wackett，1992) 转化2-硝基甲苯、3-硝基甲苯为对应的醇 使4-硝基甲苯羟化 (Robertson，1992),与共代谢相关的酶,图4-3 甲苯双氧化酶催化的反应,与共代谢相关的酶,(3)甲苯单加氧酶 在一些好氧细菌存在有甲苯单加氧酶 只能使O2中一个原子和甲苯结合形成邻甲酚 酶的共代谢作用 可共代谢三氯乙烯 将3-硝基甲苯转化为苯甲基醇（醛） 将4-硝基甲苯转化为苯甲基醛（醇） 使其他芳香化合物加羟基 (Delgadoetal 1992；Shields 1991)。,与共代谢相关的酶,(4)丙烷利用菌加氧酶 利用丙烷作为碳源和能源的好氧菌加氧酶对作用的底物较宽 酶的作用(Wackett et al，1989) 可共代谢三氯乙烯（TCE） 氯乙烯 1,1-二氯乙烯 顺-1,2-二氯乙烯 反-1,2-二氯乙烯,与共代谢相关的酶,(5)欧洲亚硝化单胞菌的氨单加氧酶 欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eurolmea)是化能自养菌 在自然界以NH3为能源，以CO2为能源。 氨单加氧酶的共代谢作用底物 TCE、1,1-二氯乙烯、二氯乙烷、四氯乙烷、氯仿、一氯乙烷、氟乙烷、溴乙烷和碘乙烷(Rmsche et al，1990，1991)、各种单环芳烃(Keener 1994)、硫醚(Juliette et al，1993)以及氟甲烷和乙醚(Hyman et al，1994)。,与共代谢相关的酶,(6)卤素水解酶(halidohydrolase) 卤素酶可作用于简单卤代脂肪酸 酶可以裂解氟乙酸、氯乙酸、碘乙酸； 裂解二氯乙酸、2-氯丙酸、2-氯丁酸； 去除1-碘甲烷、1-碘乙烷、1氯丁烷、1-溴丁烷、l-氯己烷中的卤素转化为对应的正构醇； 依不同的菌其作用有区别,与共代谢相关的酶,(7)脱卤酶(dehalogenase) 脱卤酶去除CH2Cl2、CH2BrCl、CH2Br2和CH2I2中的卤素(Kohler-Staub & Leisinger，1985)，作用于4-氯苯甲酸、4-溴苯甲酸、4-碘苯甲酸(Thieleetal，1987)。 (8)儿茶酚双加氧酶 该酶氧化儿茶酚、3-和4-甲基儿茶酚、3-氟儿茶酚。 (9)苯甲酸羟化酶(hydmxylase) 该酶代谢苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-6硝基苯甲酸、4-氯苯甲酸、4-甲基苯甲酸。,与共代谢相关的酶,(10)腈裂解酶(lyase) 该酶裂解多种芳香腈类化合物的腈为氨。 (11)磷酸酯酶(phosphatase) 该酶水解对硫磷、对氧磷、二嗪磷、毒死蜱和杀螟硫磷。 (12)醇脱氢酶(dehydrogenase) 该酶氧化正脂肪醇(C1C11)。 (13)脱氨酶(deaminase) 该酶脱去多种嘌呤中的氨基。,与共代谢相关的酶,(14)烷基羟化酶 该酶可以羟化多种烷基苯以及直链、分支和环式烷烃(Van Beilen et al，1994)。 (15)烷基单加氧酶 该酶降解TCE、氯乙烯、二氯乙烯和丙烯(Ensigne et al，1992)。 (16)萘双加氧酶 该酶作用于二甲苯、硝基甲苯和乙苯的异构物(Lee & Gibson，1996)。 (17)联苯双加氧酶 该酶可以使几种PCB转化(Heraandez，1995),与共代谢的环境意义, 共代谢是微生物转化的一种特殊的类型 环境污染物造成不良的环境影响的原因 进行共代谢的微生物数量在环境中不会增加，物质转化速率很低。不像进行基质代谢的微生物随微生物繁殖而增加代谢率。 共代谢使有机产物积累，产物是持久性的。由于在结构上经常和母体化合物差别不大，如果母体化合物是有毒的，共代谢产物也是有害的。,与共代谢的环境意义, 对自然界能共代谢各个基质微生物的数量研究不多 土壤中能共代谢 2，4-D的细胞数为(0.3-0.8)x 106个g (Fournier，1981) 从污水中分离到的细菌中有20-75细菌能共代谢DDT 污水中有9x107个ml 的细胞可共代谢农药(Pfaender & Alexander，1973)。,第二节 微生物的去毒作用,去毒作用的概念 去毒作用的一般过程,去毒作用的概念,使污染物的分子结构发生改变，从而降低或去除其对敏感物种的有害性。 敏感物种包括:人、动物、植物和微生物 去毒作用导致钝化作用 即将在毒理学上具有活性物质转化为无活性的产物。 由于毒理学活性与化学品的本体、取代基团和作用方式有关，所以去毒作用也包括有不同类型的反应。,去毒作用的一般过程,促使活性分子转化为无毒产物的酶反应通常在细胞内进行，形成的产物通常有三种转归：,图4-4 被去毒的化学品的转归 1:去毒反应(产物的结构通常与母体化合物相似) 2: 矿化作用,去毒作用的一般过程,细胞内进行的去毒作用的产物通常有3种转归： 1.直接分泌到细胞外 2.经过一步或几步特殊的酶反应，进入正常代谢途径，然后以有机废物的形式分泌到细胞外 3.经过一步或几步特殊的酶反应，进入正常代谢途径，但最后以CO2的形式释放出来。,去毒作用的一般过程,(1)水解作用 (hydrolysis) 在微生物的作用下，酯键或酰胺键水解，使得毒物脱毒。经过羧酯酶水解的通式为：,去毒作用的一般过程,有机磷农药马拉硫磷在羧酯酶作用下，水解成一酸或二酸。经过氨酯酶水解的通式为： 酰胺类除草剂敌稗的水解，产物为3,4-二氯苯胺和丙酸。(箭头代表水解部位),去毒作用的一般过程,(2)羟基化作用(hydroxylation) 在苯环上或脂肪链上发生羟基化，即由OH代替H使毒物失去毒性，其通式为： RHROH 例如： 苯并咪唑类内吸杀菌剂多苗灵(MBC)和苯氧羧酸类除草剂2,4-D的羟化。2,4-D羟化后变为2,5-二氯-4-羟基苯氧乙酸。,去毒作用的一般过程,(3) 脱卤作用(dehalogenation) 脱卤酶可使许多含有氯或其他卤素的杀虫剂和有毒工业废物去除卤元素,使有毒化合物转化为无毒产物。 脱卤作用有三种形式 由氢取代(还原脱卤) 由羟基取代 (水解脱卤) 卤原子及其相邻的氢一齐被脱去(脱氢脱卤)。其反应通式分别是：,去毒作用的一般过程,在脱氢脱卤酶的作用下，DDT可以转化为DDE，林丹转化为2,3,4,5,6-五氯-1- 环己烯，氯代脂肪酸除草剂茅草枯双脱卤转化为丙酮酸。但是，DDE再进一步降解很难进行。,几种有代表性的脱卤去毒作用,去毒作用的一般过程,(4)去甲基(demethylation) 或去烷基作用(dealkylation) 许多杀虫剂含有甲基或其他烷基，这些烷基与氮、氧和硫相连，在微生物作用下会脱去这些基团变为无毒性的。 苯脲类除草剂敌草隆，在微生物作用下依次脱去两个N-甲基，变为无毒的化合物。 地茂散由于微生物的去O-甲基作用，被转化为无毒的产物。,去毒作用的一般过程,两种杀虫剂的去烷基作用,去毒作用的一般过程,(5)甲基化(methylation) 对有毒的酚类加入甲基可以使酚类钝化。其通式为： ROH ROCH3 例如 广泛使用的杀菌剂五氯酚以及四氯酚，它们的O-甲基化形成无毒的物质。,去毒作用的一般过程,(6)硝基还原(nitro reduction) 硝基化合物对各种高等或低等生物都是有害的，将硝基还原为氨基减轻了基质的毒性。 RNO2 RNH2 有毒性的2，4-二硝基酚转化为2-氨基-4-硝基酚和4-氨基-2-硝基酚 取代苯类杀菌剂五氯硝基苯转化为五氯苯胺 杀虫剂对硫磷转化为氨基对硫磷,去毒作用的一般过程,(7)去氨基(deamination) 有毒性的杀草剂醚草通在微生物的作用下脱氨形成对植物无毒害的产物。 (8)醚键断裂(ether cleavage) 卤代苯氧羧酸类除草剂含有醚键(COC)，醚键裂解可以消除它们对植物的毒性。 2,4-D的醚键断裂 CO之间的键能高达357.86kJmol，需要微生物提供能量断裂此键。,去毒作用的一般过程,几种农药的去毒作用 (箭头代表作用部位),去毒作用的一般过程,(9) 腈转化为酰胺 腈类转化为酰胺可使毒性降低，其通式为： 例如 腈类除草剂2,6-二氯苯甲腈(敌草腈)在土壤微生物的作用下转化为2,6-二氯苯酰 胺，后者对植物无毒性。,去毒作用的一般过程,(10) 轭合作用 (conjugation) 生物体内的中间代谢产物和异生素可以进行合成反应，称为轭合作用。 结合后形成的产物一般没有毒性 动植物体内的糖类、谷胱甘肽、氨基酸、硫酸酯能与异生素进行轭合作作用。 对于微生物体内的这类反应注意得不够。,去毒作用的一般过程, 雅致小克银汉霉可以使芘与葡萄糖轭合产生无毒的葡糖苷轭合物。 一些微生物种可以使杀菌剂二甲基硫代氨基甲酸酯转化为毒性较低的物质。 几种真菌产生的葡萄糖和葡糖苷酸可以分别与菲轭合 细菌产生的谷胱甘肽可以与异丙甲草胺轭合。,第一节 微生物的激活作用,激活作用(activation) 激活反应 激活作用类型,激活作用,指无害的前体物质形成有毒产物的过程 从这种意义上说，微生物群落也可以产生新的污染物。 生物修复分解了靶标化合物未必就是消除了有害物质的危险性。 需要密切监视废物生物修复系统中有机物分子降解的中间产物和最终产物及其毒性。,激活作用,激活作用可以发生在微生物活跃的土壤、水、废水和其他任何环境。 产生的产物可能是短暂的，是矿化过程中的中间产物；也可能持续很长时间，甚至引起环境问题。 激活作用的结果是生物合成致癌物、致畸物、致突变物、神经毒素、毒植物素等。 激活的产物有时可改变基质的迁移性。 更容易迁移，或不容易迁移。,激活作用,图4-5 激活作用及其特点,激活反应,1.脱卤作用 三氯乙烯(TCE)在微生物的降解过程中会发生重要的激活作用，TCE使用很广泛，许多含水层受其污染。 TCE降解的主要产物是氯乙烯，后者为强致癌物。 Cl2C=CHCl ClHC=CH2 在受TCE污染的地下水中以及进行厌氧细菌生物修复过程中经常可检出氯乙烯。,激活反应,厌氧代谢中形成 1,1-二氯乙烯、反-1,2-二氯乙烯 也是致癌物 在甲烷营养的培养物中 氯原子会向邻近碳原子上转移，形成2,2,2-三氯乙醛。 三氯乙醛：致癌物、急性毒性 与乙醇饮料一起摄入会立即失去知觉 Cl2C=CHCl Cl3C-CHO,激活反应,2.亚硝胺的形成 亚硝胺类化合物的基本结构为 N-O，是强致癌、致畸和致突变物。 形成过程是仲胺的N-亚硝化作用 仲胺与亚硝酸盐结合形成亚硝胺 仲胺 是常见的工业合成产品，也是生物合成的天然产物。 亚硝酸 主要存在与天然水、土壤、植物中。,激活反应,微生物在激活中的作用 通过酶反应分别促使仲胺和亚硝酸的形成，再通过酶反应或其他方式形成N-亚硝胺。 仲胺和叔胺 仲胺和叔胺类产品在工业上大量应用 洗涤剂、农药 自然界中普遍存在 河水、废水和土壤中的植物体、鱼体、腐败的物质中的含量高。,激活反应, 在土壤、污水和微生物培养液中叔胺经 过脱烷基作用，可以转化为仲胺。 微生物作用导致三甲胺(叔胺)向二甲胺 (仲胺)的转化 (CH3)3N (CH3)2NH,激活反应,亚硝酸盐的形成 亚硝酸盐在自然界的含量一般很低 形成过程： 硝酸盐反硝化形成亚硝酸盐 NO3- NO2- 在环境中，通过微生物的作用也可将氨氧化为硝酸盐，再还原为亚硝酸盐。,激活反应,亚硝胺的形成 尽管环境中的亚硝酸盐浓度很低，但低浓度的亚硝酸已足以发生激活反应。 仲胺和亚硝酸盐结合发生N-亚硝化作用，形成高毒性的N-亚硝基化合物。,激活反应,亚硝胺污染 仲胺被激活后会引起污染。 例如 在加拿大的安大略Elmira的一家农药厂无控制地排放二甲胺，几年以后发现此处所有自来水厂的水中均含有亚硝基二甲胺 (CH3)2NN=O，含量大大超过饮水标准。,激活反应,亚硝胺反应否定了“凡是合成的就是危的，凡是天然的就是安全的”这一说法。 植物和鱼体内都含有仲胺和叔胺，而且鱼是三甲基胺和三甲基胺N氧化物的重要来源。 在消化道内微生物的转化使叔胺转化为仲胺，并使饮水和蔬菜中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，亚硝胺可以由微生物作用或在低pH值的胃中经非生物作用形成。,激活反应,3.环氧化作用 (epoxidation) 微生物可以使一些带双键的化合物形成环氧化物，其代表式为： 有一些农药的产物比前体对动物更具毒性，例如，七氯在土壤、培养液中转化为环氧七氯，艾氏剂在土壤微生物和在培养液中转化为环氧化物狄氏剂 。,激活反应,图4-6 土壤中的艾氏剂转化为 狄氏剂的环氧化作用,激活反应,4.硫代磷酸酯转化为磷酸酯 硫代磷酸酯(phosphorothionate)农药是广泛使用的一类杀虫剂，其通式为： 其中R为短链烷基，一般为CH3或C2H5，X的结构差异较大。这类物质本身没有毒性，但转化为对应的磷酸酯成为很毒的杀虫剂，并对人畜有毒害。,激活反应,激活反应能在动物体内发生，也能在自然环境中和农业土壤中发生。 毒虫畏在上壤中发生激活作用，氧化脱硫生成很强的胆碱酯酶抑制剂，其毒性增加大约1万倍。 对硫磷转化为氧化类似物对氧磷的反应在土壤中和在微生物培养物中均可发生。,激活反应,5.苯氧羧酸的代谢 苯氧羧酸中的2,4-D是很著名的除草剂，其结构的类似物不具活性，但它们在植物体内可以转化为2,4-D就具有活性。 在土壤中w-(2,4-二氯苯氧)己酸为母体化合物，经过二次氧化转化，先转化为4-(2,4-二氯苯氧)丁酸(2,4-DB)，最后转化为2,4-D 细菌培养物可有此反应，土壤中微生物可有此反应，非生物不可能有此反应。,激活反应,w-(2,4-二氯苯氧)己酸的转化 废水污泥中的微生物可将表面活性剂聚乙氧基壬酚去除侧键变为4-壬酚，后者对鱼和其他水生生物具有毒性，并且是弱的雌激素 (Routledge & Sumpter，1996)。,激活反应,聚乙氧基壬酚表面活性剂转化为4-壬酚,激活反应,6.硫醚的氧化 许多杀虫剂含有硫醚键即(C一S一C)，被氧化为对应的亚砜或砜，毒性比硫醚更高。 硫醚化合物氧化的通式为：,激活反应,7.酯的水解 一些酯类除草剂经水解酶作用成为游离酸，发挥其毒植物素的作用： 麦草氟甲酯、新燕灵和禾草灵施人土壤中会有此反应。,激活反应,8.甲基化 金属汞、砷和锡的甲基化是微生物激活作用 汞甲基化后，在鱼体内富集可比水环境中的汞高几个数量级。有机汞不仅有毒，代谢缓慢，且易生物积累。汞-甲基键在生物体内十分稳定，烷基增大了汞化合物的脂溶性，使得这类化合物在有机体内有很长的半衰期。甲基汞能穿过血脑屏障损害中枢神经系统。,激活反应, 亚砷酸盐和砷酸盐的激活作用 砷酸盐甲基化以后的挥发性： 微生物生长在含砷的壁纸上释放出甲基胂，可引起人吸入性中毒。土壤中形成的一甲胂(CH3AsH2)，二甲胂(CH3)2AsH和砷化氢(AsH3)都可挥发。 在海洋和淡水中以及微生物培养液中还可有：甲胂酸CH3AsO(OH)2，二甲胂酸(CH3)2AsO(OH)，三甲胂酸(CH3)3As。,激活反应, 锡的激活作用 无机锡基本上不具毒性，而甲基锡具有很高的毒性。 沉积物中的微生物和纯培养的许多微生物种可以将无机锡转变为一甲基锡、二甲基锡和三甲基锡。 实验证实，灭菌的沉积物不能形成甲基锡，说明这个过程是一个微生物过程。,激活反应,9.去甲基化 绿色木霉(Trichodenna viride)和亮白曲霉(Aspergillus candidus)可以使双苯酰草胺(即N,N-二甲基-2,2-二苯基乙酰胺)转化为一甲基和无甲基的二苯基乙酰胺。 前体物质是无毒的，而两种 产物均为毒植物素。 用土壤处理的双苯酰草胺也 会产生类似的产物。,激活反应,10.其他激活方式 在污染物的代谢中，激活作用并不普遍，但种类却很多，往往以特有的方式进行。 许多微生物可以分解硫酸酯，产物一般是无毒的。但是土壤细菌蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)可以将无毒的2,4-二氯苯氧乙基硫酸酯转化为2,4-D。 微生物可将杀真菌剂苯菌灵转化为苯并咪唑氨基甲酸甲酯。前体和产物均是杀菌剂。 由于某些真菌对其产物很敏感，因此对这些真菌来说是激活。,激活反应,多氯二苯并二噁英和多氯二苯并呋喃是最毒的化合物，其中以2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)为最。 在过氧化物酶的作用下，3,4,5-三氯苯酚和2,4,5-三氯苯酚可以形成二噁英类物质 (Oberg，1990；Svenson，1989)。 过氧化物酶还能把PCP转化为八氯二苯并-P-二噁英 (Morimoto&Tatsumi，1997)。然而，这种生物合成在自然界或在微生物中还未发现(Alexander，1999)。,激活作用类型,1.典型激活 严格意义上的激活是产物比前体更具有毒性。然而，对生物体的代谢毒害还可以表现在迁移性和持久性