南农生物技术制药第六章基因治疗.ppt

1 人基因组计划和基因治疗 2 人类历史上三大工程 阿波罗登月计划（19611972） 曼哈顿原子弹计划（19421945） 人类基因组计划（19902003） 也反映了生命科学后来居上。 曼哈顿原子弹计划（19421945） 美国陆军部于1942年6月开 始实施的利用核裂变反应来研制 原子弹的计划。为了先于纳粹德 国制造出原子弹，该工程集中了 当时西方国家(除纳粹德国外)最 优秀的核科学家，动员了10万多 人参加这一工程，历时3年，耗 资20亿美元，于1945年7月16日 成功地进行了世界上第一次核爆 炸，并按计划制造出两颗实用的 原子弹。 阿波罗登月计划（19611972） 美国于20世纪60、70年代 组织实施的载人登月工程，它是 世界航天史上具有划时代意义的 一项成就。工程开始于1961年5 月，至1972年12月第6次登月成 功结束，历时约11年，耗资255 亿美元。在工程高峰时期，参加 工程的有2万家企业、200多所 大学和80多个科研机构，总人数 超过30万人。 人类基因组计划（19902003） 1986年，著名生物学家、诺贝尔奖获得者 雷纳托.杜尔贝科（Renato Dulbecco）在 Science杂志上率先提出“人类基因组计划”。 1990年10月，美国政府正式启动人类基因 组计划，后有德、日、英、法、中等6个国家 的科学家先后正式加入，有16个实验室及1100 名生物科学家、计算机专家和技术人员参与。 2003年4月14日，六国科学家宣布人类基 因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有 目标全部实现。已完成的序列图覆盖人类基因 组所含基因区域的，精确率达到99.9 ，这一进度比原计划提前两年多。至此，人类 基因组计划共耗资27亿美元，比原先预计的30 亿美元明显节省。 人类基因组计划的启动 1985年，美国能源部（Department of Energy, DOE）提出，要将共包含约 3×109碱基对的人类基因组全部碱基序列 分析清楚； 1986年，美国宣布启动“人类基因组计划 （Human Genome Project, HGP）”。 l人类基因组包括分布于人46条染色体30 亿核苷酸的30,000-35,000个基因。 l人类基因组计划最终目的是测定基因组 的全部序列，弄清整个基因组的结构、 功能及其表达产物，彻底了解人类生命 活动本质。 人类基因组计划要测定的是人体人类基因组计划要测定的是人体2323对染色体中的所有对染色体中的所有 DNADNA的序列，它由的序列，它由31.64731.647亿个碱基对组成，共有亿个碱基对组成，共有3 3万至万至 3.53.5万个基因。换句话说，生命天书是由万个基因。换句话说，生命天书是由3030多亿个字写多亿个字写 成的，如果将这成的，如果将这3030多亿字排版到一张报纸上，那么大约多亿字排版到一张报纸上，那么大约 需要需要2020万页纸才能排完这部巨著。万页纸才能排完这部巨著。 由此可以想见，读由此可以想见，读 取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。 解读生命的“天书”-人类基因组计划 6国科学家组成的国家人类 基因组中心主要研究比例 美国：WASHMIT等7家研究中心，贡献率为54。 英国：SANGER一家研究中心，贡献率为33。 日本：RIKEN等两家研究中心，贡献率为7。 法国：GENOSCOPE研究中心，贡献率为2.8。 德国：IMB等3家研究中心，贡献率为2.2。 中国：北京华大研究中心、国家南北方基因研究 中心等三家，贡献率为1。 中国人类基因组计划 1993年，中国人类基因组计划（CHGP） 启动，首先开展了“中华民族基因组中若 干位点基因结构的研究”。 1997年，我国启动了“重大疾病相关基因 的定位、克隆、结构与功能研究”项目。 之后，在上海和北京相继成立了国家人 类基因组南、北两个中心。 中国人类基因组计划研究成果 1. 1%测序任务， 第三条染色体3000万bp 2. 精确度99.99% 3. 发现142个基因， 其中80个为预测基因 人类基因组计划1%测序中国实验室 人类基因组计划的发展 1999年12月1日，首条人类染色体完成测序 ，人类第22号染色体DNA全序列测定宣 布完成。 2000年4月6日，美国Celera遗传信息公司 宣布，该公司已破译出一名实验者的完 整遗传密码。 2000年5月，科学家聚集美国冷泉港，宣 布人类基因组草图的完成。 二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成 人类基因组计划首席科学家、 美国国家人类基因组研究所所长 弗朗西斯·柯林斯在介绍情况。 人类基因组草图基本信息 由31.65亿bp组成 含33.5万基因 与蛋白质合成有关 的基因占2% 人类基因组人类蛋白质 61%与果蝇同源 43%与线虫同源 46%与酵母同源 人类基因研究的最新发现 v 人类基因总数在33.5万个之间，低于原来估计数目的 一半。这说明人类在使用基因上比其它物种更为高效。 v 基因组中存在着基因密度较高的“热点”区域和大片不携 带人类基因的“荒漠”区域。 v 大约1/3以上基因组包含重复序列，这些重复序列的作用 有待进一步研究。 v 所有人都具有99.99%的相同基因，而且不同人种的人比 同一人种的人在基因上更为相似，任何两个不同个体之 间大约每1000个核苷酸序列中会有一个不同，这称为单 核苷酸多态性(SNP)，每个人都有自己的一套SNP，它对 “个性”起着决定的作用。 人类基因组研究能明白什么？人类基因组研究能明白什么？ 搞清楚人类基因组序列后，可以通过各搞清楚人类基因组序列后，可以通过各 种分析手段将所编码的基因进行定位，就好种分析手段将所编码的基因进行定位，就好 象将一架钢琴的象将一架钢琴的8888个键的音频搞清楚（或者个键的音频搞清楚（或者 说要将基因的说要将基因的元素周期表元素周期表定出来）。但对这定出来）。但对这 架钢琴是如何演奏出动听的乐曲架钢琴是如何演奏出动听的乐曲, , 不能提供不能提供 什么信息。什么信息。 同一种基因组可以有同一种基因组可以有 不同的演奏法不同的演奏法 21 生物技术与人基因组 计划的研究策略 22 测序策略：鸟枪法 23 测序组装 过程 8个随机测读片 段（10-20bp） 计算机进行组装 最后得到长 72bp长片段 24 Sequencing a genomic by using an overlapping clone map 测序构建重叠群与组装 25 构建亚克隆库 26 末端配对测序 27 ideoxynucleotides （双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与 复制，一旦链入DNA 中，其后就不能再继 续连接。 反应体系中dNTPs的浓 度远高于ddNTPs(一般 1：34) 测序方法：双脱氧法 28 基因组学家们巧妙地将 在制造业中使用的机器 人扩大化利用以增加测 序的通量，提高可靠性 和精确性 29 亚克隆测序的创新 放射性标记 平板凝胶电泳 两大革新： 荧光标记 毛细管电泳 大大提高了测序的效率 1.4个链终止反应可以在同一 个体系中进行也可以在同一个 泳道中进行电泳 2.实时地自动检测 1.无需费时的灌胶点样工序 2.同一个毛细管可以被多次 使用 3.整个测序反应都是机器人 操作进行 革新点 30 早期的DNA测序分成4个独立的 反应进行延长后的DNA片段被 放射性同位素标记（主要是 32P和35S）曝于X射线下进行 DNA的检测 不同颜色荧光标记的 ddNTPs半自动化的测序机 器进行DNA的测序 31 人基因组测序完成 32 33 人類基因體計畫 34 人类基因组 计划的意义及影响 人类基因组计划的意义 一、获得人类全部基因序列将有助于人类认识许 多遗传疾病以及癌症等疾病的致病机理，为 分子诊断、基因治疗等新方法提供理论依据 。 二、破译生命密码的人类基因组计划有助于人们 对基因的表达调控有更深入的了解。 三、人类基因组图谱对揭示人类发展、进化的历 史具有重要意义。 人类基因组研究与未来药学 基因组药物学 通过研究个体对包括药物在 内的外界化学物质（有毒外源物)反应的遗传 多样性和差异性，达到科学合理用药的目的 。 发现和开发新的蛋白质和多肽类药物。 提供大量药物作用新的靶点，供新药的筛选 、研究用。 人类基因组研究的应用 人类基因组计划不仅可以揭示生命活动的奥秘，而且人类6千多种单基因遗传 性疾病和多基因易感性疾病的致病机理有望得到阐明。寻找与特定遗传疾病有关 的基因的工作变得容易。 、 在医学领域的应用 （1）对特殊疾病基因的确定 通过认识特殊疾病的基因序列，为疾病的诊断和治疗提供了可能。如家族性早 老年痴呆症、视网膜母细胞瘤、亨廷顿舞蹈症。 可提供病人DNA样品序列数据库。通过正常和患者DNA有效分析比较，达到对 疾病基因定位的目的。 （2）有利于优生和产前诊断 通过基因检测，识别出带有遗传疾病的胚胎细胞。在不久的将来，胎儿期的检测 也许能够预测一般的常见病，比如：肥胖症、抑郁症和心脏病等。 （3）加强对癌症的认识和治疗 癌症是由于细胞生长失控造成的。而失控是因特定基因的异常造成的。遗传的缺 陷会使人体对特定的癌症具有高的易感性。一旦确定了易感基因，就可以进行癌 前或早期癌症的特殊监护和治疗。 、在基础理论研究方面的应用 （1）确定人类基因组中基因的序列、组织和物理位置，有利 于研究基因的功能以及基因转录与转录后的调控。 （2）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转 录序列在染色体结构、DNA复制、基因转录和表达调控中的影 响和作用。 （3）研究正常基因与突变基因的差别，尽快地确定出疾病基 因，对该基因的蛋白产物及其细胞生物学效应进行深入的研究 。 （4）发现新的基因和蛋白质。迄今仅有少数参与正常和疾病 的人类基因被确定。对人类基因组作图和测序将会确定出大量 新的人类基因及其编码的蛋白质。另外，物理图谱将有助于对 那些已大体定位在染色体上，但尚未分离出的基因进行精确定 位。 、在生物学研究领域的应用 生物进化研究 如果知道了人和其它生物基因组的全序列，就有可能追溯出人类基因 的起源。人胚胎的有序发育需要特定的场所和时间的活化，使多潜能细 胞成为新类型的细胞，这一过程至少部分地受控于位于基因附近的调节 顺序。 对人类基因组进行顺序分析，并将与其它哺乳动物进行比较，将使我们 能确定出大量的调节顺序。此外，我们将了解基因调控的规律，及其在 人从其它哺乳动物分化出来的过程中在分子水平上所发生的变化。 人类基因组计划相关的伦理学问题。 一是人类基因组数据的共享， 二是人类基因组信息应用于医学保健方面所产生的问题。 人类基因组所包含的遗传信息是人类的共同遗产，应该为全人类所有。 国际人类基因组科学主流的组织曾发表过多次声明，垄断数据的做法违背 公众的利益，若独占或延误公布将阻碍科学的发展，也不应申请专利。但 不反对对中、下游成果，如功能明确又有工业用途的基因工程产品等申请 专利。这一立场得到各国政府的响应。1996年由国际各大测序中心联合作 出百慕大协议：基因组序列应在24小时之内公布。 2000年3月14日，美国总统克林顿和英国首相布莱尔联合声明支持基因组数 据公开的政策。 2000年6月28日，江泽民主席就人类基因组研究发表的重要讲话中也指出“ 人类基因组序列是全人类的共同财富，应该用来为全人类造福”。 人类基因组计划为推动医学进步带未了空前的机遇。但同时 也可能带来一系列伦理、法律和社会学问题。 例如：病人的隐私权如何得到保护？ 他们的就业和保险是否会受到影响？ 是否会在社会上受到“遗传歧视”？ 社会和法律能够为他们提供何种帮助和保护？ 41 抢基因的世纪之战 目前世界上正在进行一场“抢基因”的“世 纪之战” ,其根本动力是基因可以淘金， 从一个肥胖基因能价值9000万美元中， 人们更悟清了这个道理。 2. 基因淘金与基因经济 42 DNA双螺旋与淘金车 43 基因版图 44 哮喘病相关基因的研究材料 取自仅有301个居民的南大西洋一个小岛(全 部是近亲婚配，13的人患有严重哮喘)； 我国浙江象山的一个大家系在内的几个大家 系； 通过对芬兰发现的诸多大家系研究，已成功 地克隆了至少12个基因。 目前，实际上已形成了一个被普遍接受的简 单关系式，即: 遗传病家系基因money（钱） 45 人类基因组 计划与伦理 46 基因有没有好坏之分? 当我们说某个基因引起疾病时，称它为“致病基因” 或“有害基因”。但有时被认为致病的基因也可以在 一定情况下对机体起保护作用。 例如在非洲，许多人患有镰形细胞症，这是基因引 起的。但非洲又有致命的恶性疟疾，带有可引起镰 形细胞症基因的携带者却比不带有该基因的健康人 更能抵御恶性疟疾。 这样，“致病基因”在此时变成了“御病基因”。 47 人们在谈论“自私的基因”、“侵略基因”，“利他主 义基因”、“精神分裂基因”、“嗜赌基因”、“嗜酒基 因”、“同性恋基因”时 美国哲学家Nozick R(1990)想象未来的基因超级市 场可提供未来父母购买他们想要孩子所具有性状( 如性别和眼睛颜色)编码的基因。 48 对于可能携带不利基因的任何人，都应公正对待 ，不得歧视；对于基于基因组特征的歧视，应采取 一切适当措施禁止和结束，必要时立法。 保护个人和家庭的基因隐私 HGP一个独特的问题是，谁能得知DNA? 亲人、工 作单位或雇主、保险公司?应该保护个人及其家庭 的基因隐私。 HGP将给人类带来的好处 1、将带动一场医学革命 用基因图谱看病 基因药物治病 基因检测预防隐患 基因治疗疾病 2、获取了操纵生命的工具 控制生命的孕育优生优育 延长人的寿命 选择最佳生活环境 3、得以进行精确的个体鉴定 基因身份证 生物考古 4、将带来巨大的商机 生物制药 器官培植 HGP 可能给人类带来的隐患 社会平等与基因歧视 科技进步与基因技术滥用 社会公正与基因成果利益的均等分配 技术的不确定性和基因安全 后基因组时代 人类基因组计划基本目标与任务只是一个 以测序为主的结构基因组学研究，随着该 目标的实现，“功能基因组学”、“蛋白 质组学”兴起，HGP研究的重心逐步由结构 向功能转移，即基因组功能信息的提取、 鉴定和开发利用。 52The sequence of the human genome 人類基因體計畫 基因变异致病类型 内源基因的变异： 基因结构突变 基因表达异常 外源基因的入侵： 基因诊断和基因治疗 遗传性疾病 肿瘤、心脑血管病等 （生殖细胞） （体细胞） 病毒感染性疾病：HIV、SARS、HCV、HPV 第 一 节 基 因 诊 断 Genetic Diagnosis 特点： 针对性强：病因学检测 特异性强：分子杂交技术 灵敏度高：PCR、分子杂交放大效应，样品量少 适应性强：内源、外源基因 早期快速诊断： 一、基因诊断的概念和特点 定义： 是用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA分子做探针 ， 利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上遗传信息， 达到检测疾病的目的。 二、基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链反应 (PCR) （三）基因测序 （四）基因芯片 不同的DNA探针具有不同的核苷酸序列，用其与 被测样品杂交，根据杂交后分子双链的程度确定 被测样品与探针碱基序列的相似程度 二、基因诊断常用技术方法 限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)间接分析 （一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术原理： 核酸分子杂交的流程示意图 待测核酸制备 滤膜上核酸固化 杂 交 去除未参与杂交的探针 检 测 杂 交 信 号 制备探针核酸片段 探 针 标 记 加入标记核酸探针 × Mst酶切位点(GCTNAGG) 5´3´ 正常基因 5´3´ 突变基因 1.15kb 1.35kb 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 0.2kb 正常珠蛋白基因： 5CCTGAGG3 镰刀型贫血 ： 5CCTGTGG3 + + 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带着患者 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 DNA多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异 限制性长度多态性分析： 突变发生在酶切位点上，酶切DNA片段不同长度 RFLP：孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁 ，作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因 应用：甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症 2. DNA限制性长度多态性分析 RLFP分析法 单基因病-苯丙酮尿症I I 型型 病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanina Hydrozylase,PAH）缺乏。缺乏。 主征：智力低下，尿有霉味主征：智力低下，尿有霉味 治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮 食控制血中苯丙氨酸浓度，食控制血中苯丙氨酸浓度，改善脑子的发育，改善脑子的发育， 而而“ “危险期危险期” ”一过，病婴后来就基本正常。一过，病婴后来就基本正常。 PAHPAH仅仅仅仅存在于肝存在于肝脏细脏细脏细脏细 胞中，在胞中，在绒绒绒绒毛、羊毛、羊 水水细细细细胞和胎儿血中均不表达，故不能通胞和胎儿血中均不表达，故不能通 过测过测过测过测 定定酶酶活力及代活力及代谢产谢产谢产谢产 物来物来进进进进行行PKUPKU的的 产产产产前前诊诊诊诊断只能依断只能依赖赖赖赖于家系分析，找出与于家系分析，找出与 PKUPKU致病基因相致病基因相连锁连锁连锁连锁 的的RFLPRFLP，进进进进行基因行基因 分析做出分析做出产产产产前前诊诊诊诊断断 （二）聚合酶链链反应应 （polymerase chain reaction PCR） nPCR定义：指由一对引物介导的基因或克隆 的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程，是 DNA的体外扩增技术，本质是DNA的体外复制 。 Ø应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的23小时扩 增至百万倍。 （二）聚合酶链链反应应 Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize PCR技术的基本原理 n模板DNA的变性：94热变性，使DNA双链解 离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应 作准备； n模板DNA与引物的退火(复性)：55左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； n引物的延伸：DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保 留复制链 PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n (n 为循环次数) 以爱爱滋病的临临 床检测为检测为 例， 简简要说说明一下 PCR在病毒感染 的基因诊诊断中的 应应用。 组织组织 中总总RNA的提取 利用反转录转录 酶合成cDNA PCR反应应： 反应缓应缓 冲液 模板（上述合成的cDNA） 底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物（爱爱滋病病毒特异性引物） TaqDNA聚合酶 50l 循环环：95，30sec（变变性） 55，1min（退火）30循环环 72，1min（延伸） （三）基因测序技术 他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝 尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类 基因组测序做出了卓越贡献。 Fred Sanger 发明的末端合成终止法 (sanger法) Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法 末端合成终止法 (sanger法)原理 2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通dNTP不同 之处在于其脱氧核糖的3位置少一个羟基，可在DNA聚 合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，但ddNTP因缺乏3羟基而不能同后续的dNTP形成 磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为 ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样， 在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一 种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止 展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决 于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位 置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止 于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。 双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核 苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。 P OH dNTP ddNTP P OH OH P P P P OH 末端合成终止法 (sanger法)原理 53 53 引物 模板DNA dNTP DNA聚合酶 ddATPddTTPddGTPddCTP 末端合成终止法 (sanger法)原理 末端合成终止法 (sanger法)原理 DNA自动测序结果 （四）基因芯片技术 n快速、高通量、平行化、自动化 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将 大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物 表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检 测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信 息） （四）基因芯片技术 1芯片的制备 Gene probes （cDNA、DNA） substrate Ready-to-use microarray Oligo probes AGCT or arrayer Sample cells 1)Extract RNA or DNA 2) RT or PCR amplification 3) Fluorescent labeling Reference cells Sample ready combine Labeled RNA or DNA (Sample ) Labeled RNA or DNA (Reference) 2)1)3) 1)2) 3) 2.基因表达谱双色标记 3.分子杂交 1) hybridize Apply sample 2) rinse 4. 检测分析 Laser 1 Laser 2 Detector 1 Detector 2 Scanner 芯片的扫描芯片的扫描 5.图 像 处 理 Detector 1 Detector 2 False-color differential image 图 像 分 析 基因诊断方法 经典基因诊断 .限制性内切酶法 .RFLP分析法 .寡核苷酸分析法 优点缺点 .特异基因诊断 .未知基因诊断 .直接，过程简单 .过程繁杂 .准确性低，过程繁 .条件严格 基因诊断进展 .PCR方法 .PCR-序列分析法 .DNA芯片技术 .简单、经济、敏感 .操作直接、准确 .集成度高、快速、并行 .假阳性高 .价格高 .尚无成熟产品问世 三、基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定 定义 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组 ，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转 移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以 达到治疗疾病目的的方法。 一、基因治疗的概念 基因治疗 v 基因病可分为三大类：第一类为单基因病；第二类为多基因病，涉 及两个以上基因结构或表达调控的改变；第三类为获得性基因病， 由病原微生物通过感染将其基因入侵到宿主的基因引起。 v 人体中某种基因发生突变、不能表达和产生正常产物，就会导致 一种基因病。基因病的最终解决途径有赖于基因修复 （ “基因治疗 ”，gene therapy）。 19871987年诺贝尔生理学及医学奖得主、日本分子年诺贝尔生理学及医学奖得主、日本分子 生物学家利根川进（生物学家利根川进（Susumu TonegawaSusumu Tonegawa）认为，）认为， 人类所有疾病都与基因受损有关，并第一次提出人类所有疾病都与基因受损有关，并第一次提出 人体疾病的新概念人体疾病的新概念“ “基因病基因病” ”。 多基因病多基因病 多基因病也与外界环境和心理因素有关 ，遗传因素所占的程度称之为遗传度 如：哮喘病遗传度为80、精神分裂症 为80、高血压遗传度为62 、冠心病 遗传度为65 、糖尿病遗传度（幼年型 ）为75、糖尿病遗传度（老年型）为 35、唇裂腭裂遗传度为76 One Gene, One ProteinOne Gene, One Protein One Gene, One Polypeptide ChainOne Gene, One Polypeptide Chain 镰刀形细胞贫血症。正常HbA四条多肽链（2条链，两条链） Vernon M. Ingram证明链第六位氨基酸HbA是谷氨酸，HbS是缬氨酸。 证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据 两个紧密 连锁的基 因几乎总 是一起传 给下一代 图3-9 连锁和非连锁基因的遗传形式 A B A B A B a b a b a b A B a b A B A b a b a b 重组产物 A B a b a b A B A b a B （a）连锁基因 （c）在不同染色体上的基因 （b）在同一染色体上相距很远的基因 在同一条染色 体上，相距很 远的两基因常 常同时遗传， 但重组会使它 们分开 在不同染色体 上的两个基因 随机分离 如图所示为3个家族 代表男性 代表女性 图3-10 乳腺癌基因图谱分析 D17S74 17号染色体 （80Mb） D17S1325 D17S1321 BRCA1 甲型血友病的基因诊断（连锁分析1） 53 引物1 引物2 99 bp43 bp Bcl I 因子VIII 基因142 bp 片段 甲型血友病的基因诊断（连锁分析2） 142 bp 99 bp 43 bp 异常带 先症者胎儿 BACK 图3-11 转染干细胞的分化，使所有成熟血细胞都含有新的基因 分离的干细胞 新基因 感染 重新植入 分化 T细胞 B细胞 嗜碱性粒细胞 嗜酸性粒细胞 中性性粒细胞 单核细胞 基因的识别为治疗遗传性疾病提供生物化学基础， 并为进一步设计药物提供依据 识别缺陷基因中发生的突变，用来设计筛选程序， 检测缺陷基因携带者的突变基因 遗传疾病相关基因的识别是进行基因治疗的先决条件 基因治疗的基本方法 基因矫正 (gene correction) 基因置换 (gene replacement) 基因增补 (gene augmentation) 基因失活 (gene inactivation) 几种常见的基因失活技术 反义核酸技术 核酶技术 三链技术 干扰RNA技术 基因治疗的其他方法：如“自杀基因” 的应用，基因疫苗等 如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体 药物前体 无毒 Gene酶 药物复合物 有毒 细胞死亡 多抗药基因疗法 由于多抗药性（MDR）基因已被克隆，因此人 们设想分离患者的造血干细胞，将MDR 基因从体外 转导进去，使这种干细胞获得多药耐药性，再回输 给患者，使得由此类被修饰的干细胞繁衍的白细胞 具有多药耐药性，而肿瘤细胞未获得MDR基因，不 具备耐药性或耐药性较差，这样在加大化疗剂量或 在持续较长时间化疗的情况下，可大量杀死肿瘤细 胞而白细胞较少受损，以此达到治疗肿瘤的目的。 抑癌基因疗法 野生型抑癌基因的失活和肿瘤的发生密切相 关，因此人们设想将正常的野生型抑癌基因导入 肿瘤细胞以代替和补偿有缺陷的抑癌基因，从而 抑制肿瘤的生长。 二、基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移 外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因 回输体内 病毒载体 非病毒载体 体细胞 生殖细胞 间接体内疗法 直接体内疗法 基因治疗的发展过程 1980-1989年的准备期，基因治疗能否进入 临床存在很大争议。临床前研究 1990-1995年的狂潮期，基因治疗进入临床 试验，从专业刊物到大众媒体，都给人留 下了基因治疗即将成为临床治疗的一种成 熟方法。 1996年后的理性期，NIH1995年重新评估已 经进入临床的方案，发现100多个方案中确 证有疗效的仅有几个。 基因治疗存在的问题及解决办法 导入基因的持续表达问题 因为外周血淋巴细胞和皮肤成纤维细胞都有 一定的寿命限制，所以需不断的给患者回输含目 的基因的细胞。 现已有许多实验室正在研究寿命较长的靶细 胞，如造血干细胞和骨髓前体细胞。 导入基因的高效表达问题 迄今所有导入细胞的目的基因表达率都不十分 高，这与基因转移方法、靶细胞的选择等有关。 目前有不少实验室正在研究将高效的启动子构建 入逆转录病毒载体。 如:人巨细胞病毒的启动子。 由于存在组织特异性，并非一个启动子适于所 有基因的高效表达，所以其它的高效启动子也在 研究中。 安全性问题 安全性问题是基因治疗临床试验前首先要重 视的问题。 反转录病毒基因转移系统的安全性问题仍然 必须重视； 目前基因治疗研究尚未发展到定点整合、置 换缺陷或有害基因的阶段，治疗基因在基因组中 随机整合，有可能激活原癌基因或失活抑癌基因 ，从而引起细胞恶性转变。 但迄今为止所有的基因治疗都是 在体细胞水平。体细胞的基因治 疗只是影响病人本身，而对种系 细胞的干预，由于基因被植入到 精子、卵细胞或胚胎细胞，所以 它的影响会传递给下一代，影响 到整个人类的进化。 基因药物的制备 制备大量纯度较高的超螺旋质粒DNA， 培养含表达质粒的工程菌。 工程菌的发酵培养 培养基中含抗生素，提高质粒copy。 加氯霉素，能抑制细菌生长，不影响质粒。 离心获得菌体 基因药物的纯化 破壁，除去细胞碎片、蛋白、脂类、RNA，质粒纯化 1、PEG沉淀法 PEG溶液高速离心，质粒DNA超螺旋双链闭合环状，沉降系 数高，其他RNA，线状DNA低 。对碱裂解法提取的质粒效果 好。 碱性裂解细胞，PH12.6，SDS，DNA变性沉淀 PH7.0质粒复性 上清液DNA 取上清液 乙醇沉淀 2、氯化铯梯度平衡离心法 利用质粒DNA与大肠杆菌DNA、RNA、蛋白密度不同 3、柱层析：离子交换，凝胶色谱，反相色谱 PH7.0 （三）裸DNA的浓缩 乙醇沉淀， 异丙醇也可，但不易挥发，易共沉淀 基因药物的导入与靶组织 局部直接注射靶组织 (一) 靶组织 1、肌肉：摄取外源DNA 的能力强。肌纤维是有丝 分裂后细胞，转入的DNA不会因细胞 分裂而较快稀释或丢失。 血流丰富，13 天可表达，714天高峰， 持续数周数月。 2 、皮肤： 皮内、皮下注射，表皮涂抹。 在表皮、真皮、毛囊、毛囊腺细胞表达。 4小时表达，13天高峰，持续一周。 转移率低，基因枪导入可提高转移效率。 3、 黏膜： 呼吸道、消化道等。 注射、基因枪导入、口服、喷雾 表面无角质层，易被摄取，血液丰富，输送 至远离部位。24时表达，14天高峰，持续3周。 4、 静脉和腹腔 静脉：转移速度快，2分钟迅速分布在肝、脾、肺、 心、肾、脑。5分钟表达，412时高峰，持续24天。 腹腔：转移效率低，半衰期短。 导入系统 1、基因枪：将DNA用金或钨颗粒包裹，通过高压 电所产生的高能弧，有效穿透单细胞或靶器官 进入细胞浆，甚至细胞核，避免酶降解，需剂 量小 2、电脉冲：高压低电流脉冲电刺激，引起 细胞膜电荷的 变化，形成短暂可逆性的孔 隙，促进基因向细胞内转移，导入细胞、 肝脏、黑色素瘤、肌肉。 3、阳离子脂质体 原理：DNA包埋在脂质体内部，与带负电细胞膜 结合、介导基因转移 。 常用阳离子脂质体， 带正电脂类与中性辅助脂类混合物 中性脂质体或胆固醇促进内吞后的释放 脂质体商品化 （一） 基因转移的靶向性 许多细胞表面特异性表达或过表达某种受体 、抗原， 将含目的基因的载体与相应配体、抗体连接 如：含叶酸的脂质体，转染过度表达叶酸 受体的鼻咽癌上皮细胞，转染效率比不含叶 酸高20-30倍。 基因药物导入系统的靶向性和时相性 （二） 基因表达的靶向性 利用组织特异性的基因启动子限制目的基因 只在靶细胞内表达， 靶细胞内存在特异的转录激活因子，作用于 基因启动子，激活转录。 使用的组织特异性基因启动子： 正常细胞中特异性 蛋白质的启动子，疾病状态下过表达、特异表达的启 动子 如：氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因置于骨钙素 基因启动子控制下，转染骨髓细胞，仅在骨 组织中表达。 （三）基因表达的时相性 在一定时间内和水平上表达,不能过长 、过短、过高、过低。 构建某药物依赖性的转录活化因子， 调控基因表达 用外源性、可口服的非毒性的小分子药物，如四 环素、蜕皮激素，通过给药时间、药剂量调节基 因表达，不服用时不表达或低水平表达。 用纳巴霉素控制促红细胞生成素表达，纳巴霉 素与启动子上的某序列结合，能诱导基因表达。 TATA框等 RNA聚合酶等只能启动基础水平转录 ， 还有一类调控序列，通过结合其它转录激活 因子，提高转录水平，依赖药物 。 局限性： 配体的插入影响载体的空间结构; 肿瘤表达某种受体或抗原有相对专一性; 利用外源性DNA序列对于基因的长期表达有障碍 ，机体能识别并降解; 外源药物可能干扰人体正常生理反应 基因药物的安全性 裸DNA整合至宿主细胞基因组的可能性 危害： 产生插入性突变，激活肿瘤基因，或抑制 肿瘤抑制基因 整合分三类：随机插入、同源重组、逆转录病毒插入 同源重组最佳条件： （1）宿主细胞正在复制 （2）两者DNA上有大于600bp高度同源的片段 防范： （1）构建DNA基因药物时避免使用逆转录病毒或去除能 引起插入重组的已知序列。 （2）肌肉注射，因随机整合可能只在复制再生的细胞 中发生，肌肉细胞处于分裂后期。 整合的发生率比自发突变频率要低 。 乙肝：10%用重组疫苗无足够免疫反应、核酸疫苗诱导 高水平免疫,皮肤给药,诱导多种细胞因子激发 免疫 。 裸DNA基因药物的应用 肿瘤 a、IFN干扰素脂质体包被注入瘤体； b 、白介素脂质体包被注入瘤体； c、 气管吸入裸DNA抑制肺癌 乙肝、结核（结核杆菌疫苗卡介苗 ）、流感( DNA疫苗交叉保护)、疟疾 三、基因治疗的应用与展望 应用 展望 遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、 感染性疾病、神经系统疾病 进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响 基因治疗面临的挑战及展望 v目前全世界已知的遗传病有3000多种，但其中 只有3找到了致病基因，得到治疗的仅几千 人。 v外源基因多途径、多层次的表达调控更是严重 的挑战。 z无论如何，基因治疗的路还是会越走越宽广的 。 1990 1990年年9 9月月1414日，美国国立卫生研日，美国国立