专题1 基因工程.ppt

现代生物科技专题,选修3,西安交通大学生命学院,目 录,胚胎工程,生物技术的安全性和伦理问题,生态工程,专题 3,基因工程,专题 1,专题 4,专题 5,专题 5,细胞工程,专题 2,期末成绩,70%,20%,60%,20%,平时成绩,专题综述,实验成绩,实验报告 实验操作，打扫卫生，考勤,期末每人写一篇综述 不得成段抄袭,不定期的课后作业，制作ppt 到课情况,专题1 基因工程,基因工程的诞生过程,DNA双螺旋结构和中心法则的确立 1950. 查哥夫（E. Chargaff）法则 1953. 沃森 (J. D. Watson) & 克里克 (F. Crick) 1958. 梅塞尔松 & 斯塔尔 DNA半保留复制,遗传密码的破译 1963. 尼伦伯格 & 马太 1966. 霍拉纳,DNA是遗传物质的证明 1928.格里菲思 & 1944.艾弗里 肺炎双球菌转化实验,基础理论的重大突破,相关技术的飞速发展,基因工程的诞生过程,相关技术的飞速发展,DNA体外重组实现 重组DNA表达实验成功 第一例转基因动物问世 1980. 转基因小鼠 1983. 转基因烟草,基因转移载体的发现 1967. 罗思 & 海林斯基 质粒 工具酶的发现 1970. 阿尔伯,内森斯 & 史密斯 发现限制性核酸内切酶,DNA合成和测序技术的发明 1965.桑格（E. Sanger）氨基酸序列分析 1977.DNA序列分析,PCR技术的发明 穆里斯（K. Mullis）,大鼠的生长激素基因及其调控区,1998年，加拿大的一个研究小组展示了一只能在荧光下变绿的小鼠。这种小鼠被做了遗传改造，携带了一个水母绿色荧光蛋白基因。荧光鼠已被用来研究胚的生长和细胞内蛋白的运动。,基因转移载体,特点,裸露、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外的双链环状DNA； 自我复制能力； 可插入外源DNA片段； 标记基因。,质粒,注意： 真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。,氨苄青霉素,四环素,噬菌体载体 酵母人工染色体 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,分布：,限制性核酸内切酶,主要在原核生物中,特异性,磷酸二酯键,识别序列,切割位点,举例：,切点：,作用特点：,限制性核酸内切酶,黏性末端和平末端,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个),主要是原核生物。,4000种。,（1）来源：,（2）种类：,（3）作用：,（4）结果：,形成两种末端,（小结）,限制性核酸内切酶,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,命名,切割外源DNA，保护自身。 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,？,限制酶在原核生物中的作用,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考：,1、种类： 2、作用部位：,磷酸二酯键,DNA连接酶,都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。,Bt毒蛋白基因,1、获取目的基因,2、构建表达载体,3、导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的步骤,1、目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9第一段,一、目的基因的获取,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,1.基因文库,(一)从基因文库中获取目的基因,文库构建步骤,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,2.从基因文库中获取目的基因,鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,重组DNA,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(直接分离法),（基因组文库）,反转录法：,供体细胞的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA,2.从基因文库中获取目的基因,（cDNA文库）,重组DNA,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,DNA合成仪,2.从基因文库中获取目的基因,2.从基因文库中获取目的基因,(二)利用PCR技术扩增目的基因,K. Mullis ( 1944 ),5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,1.基本工作原理,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs,2. PCR体系基本组成成分,3. PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C, 概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术； 原理：DNA复制； 条件：已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、一对引物、DNA聚合酶。 方式：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数） 结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,4. 小结, 过程： a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA； b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,4. 小结,历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献钱嘉韵,1998年钱嘉韵在台湾国立政治大学讲座,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,二、基因表达载体的构建-核心,基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,三、将目的基因导入受体细胞,1、导入植物细胞：农杆菌转化法,土壤农杆菌 冠瘿瘤，发状根,1、导入植物细胞：农杆菌转化法,（1）农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上。 （2）转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达。,（1）方法：显微注射法 （2）程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞,3、将目的基因导入微生物细胞,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,（1）原核生物特点： 繁殖快、单细胞、遗传物质少 （2）方法：CaCl2法 （3）常用菌：大肠杆菌,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法：,方法：,方法：,DNA-DNA分子杂交,DNA-RNA分子杂交,抗原-抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,目的基因的检测示意图,放射自显影照片,基因操作的基本步骤,基因工程与医药卫生,生产基因工程药品,用于基因诊断与基因治疗,基因工程与农牧业、食品工业,培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种,培育具有各种抗逆性的动植物新品种,为人类开辟新的食物来源,基因工程与环境保护,用于环境监测,用于被污染环境的净化,基因工程的应用,基因工程与医药卫生,抗生素的合理使用,抗生素一般是指由细菌、霉菌或其它微生物在繁殖过程中产生的，能够杀灭或抑制其它微生物的一类物质及其衍生物，用于治疗敏感微生物（常为细菌或真菌）所致的感染。,抗生素史话,1928年，弗莱明 1940年，弗洛里、钱恩 1941年，青霉素首度进行人体试验。 1943年，青霉素得到量产与应用。 1945年，三人获诺贝尔生理学奖。,1944年，瓦克斯曼（Selman Abraham Waksman, 1888-1973）在灰色链霉菌中发现链霉素（streptomycin），由于链霉素是当时第一个能够有效治疗肺结核的药物，瓦克斯曼因而获得1952年的诺贝尔生理学奖。 他的成功，再一次引起全世界科学家对利用微生物生产抗生素的研究热潮。,抗生素史话,人们找到6000多种抗生素 广泛应用的抗生素大约200种 全世界每年抗生素产量超过1.0X108kg 产值约100亿美元,抗生素史话,抗生素的分类,抗生素的作用机制,抗生素的不良反应,副作用如恶心和呕吐 毒性反应如肝、肾及其它器官损害 后遗反应如链霉素引起永久性耳聋 过敏反应如青霉素引起过敏性休克 药物相互作用引起不良反应 二重感染（病菌抗药性产生）*,抗生素的不良反应,抗生素的不良反应,五、抗生素的不良反应,合理使用抗生素,严格掌握适应症 发热原因不明者不宜采用抗生素 病毒性疾病不宜采用抗生素 使用前做药敏试验 新生儿、老年人、肝肾功能不全者慎用毒性大的抗生素 严加控制预防性应用抗生素 应尽量避免在皮肤、黏膜等局部使用抗生素，易导致过敏反应。,基因工程与医药卫生,基因诊断与基因治疗,基因诊断,基因,基因 诊断,性状,蛋白质,生化 诊断,临床 诊断,基因诊断,基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）或DNA芯片。 是一块带有DNA微阵列涂层的特殊玻璃片，在数平方厘米的面积上安装数千或数万个核酸探针，经由一次测验，即可提供大量基因序列相关资讯。 它是基因组学和遗传学研究的工具。研究人员应用基因芯片就可以在同一时间定量分析成千上万个基因表达的水平，具有快速、精确、低成本的生物分析检验能力。,基因芯片,Two color - DNA microarray,Can place 20,000 gene pieces in a small space at one time,基因治疗,1.基因治疗： 将特定外源基因导入有基因缺陷的细胞来治疗疾病。 2.基因治疗过程：,体外基因治疗,体内基因治疗,911天,美国医学家W·F·安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。,1990年9月14日，安德森对一例患重症联合免疫缺陷病的4岁女孩进行基因治疗。这个4岁女孩先天ADA缺乏，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上正常人的生活，并进入普通小学上学。,基因治疗对癌症的治疗方案,抑制癌细胞增殖基因导入癌细胞 抑制癌细胞转录DNA片断导入癌细胞 提高机体免疫力基因导入免疫系统,阻断癌细胞繁殖,提高免疫力,人体的器官移植,定义：将某一个体的器官移植到自体或另一个体体内的手术方法。 器官移植的历史：,幻想阶段： 实验研究阶段：19世纪20世纪初 进入临床阶段 临床发展阶段,公元前200年左右，扁鹊曾给两位病人进行了心脏移植？,罗纳德·赫里克和理查德·赫里克,进入临床阶段,1963年，美国的医学家进行人类历史上的第一例肝移植 1963年，美国另一位医生做了第一例肺移植 1967年，南非完成了第一例心脏移植（存活18天） 1968年，美国几位科学家又进行了第一例心肺联合移植 截止到2003年底全球器官移植已突破百万例，包括肾、肝、心、肺、骨髓、小肠、关节、甲状旁腺、胰腺等33种器官或组织。 目前我国每年约有6000例肾移植手术,累计已达86800例 。,临床发展阶段,2004年9月17日上午1点至晚上11点，湖北省华中科技大学同济医院陈知水教授主刀切除了陈某肝、胆、脾、胰腺等上腹部七大组织器官，并彻底清扫腹膜后淋巴结，然后将供体的肝脏、胰腺、十二指肠原位移植入患者腹腔。多器官移植技术是器官移植领域最为复杂的尖端技术，全球仅有近60例手术报告，且手术绝大部分由美国和法国世界著名大型器官移植中心进行，在亚洲等其他地区十分罕见。该手术在中国仅有三例，第一例由同济医院于1994年实施，但患者术后一周左右即死亡。第二例由广州中山大学附属第一医院于2004年5月实施，成为亚洲首例成功的多器官移植病例。本次手术为第三例，其手术难度较第二例更大，标志着我国多器官移植技术水平提高到一个新阶段。,临床发展阶段,器官移植肾移植,血液透析,器官移植角膜移植,角膜是覆盖在有色的虹膜和瞳孔上的透明层,器官移植角膜移植,移植适应症,严重角膜感染、外伤、损害、或瘢痕形成 光线不能通过角膜；以及感染和角膜的遗传性疾病,器官移植角膜移植,角膜移植术在局麻下进行，患者意识清醒，但是丧失痛觉。沿角膜外缘做切口,器官移植角膜移植,切除损伤的角膜后，将要移植的角膜缝到适当位置。移植角膜取自脑已经死亡、仅靠仪器维持生命的捐赠人,器官移植角膜移植,移植角膜的存活时间长，术后视力改善明显,器官移植的所要解决的主要问题,血管吻合技术（手术技巧） 器官供体来源问题 排异反应（本质上是免疫反应） 为什么同卵双生间器官移植容易成功？ ABO血型抗原适合 HLA抗原系统一半以上相同 免疫抑制剂（尤其是环孢霉素A的诞生） 免疫抑制剂可能带来什么问题？（平衡？）,人造器官,美第一颗人造心脏获批使用，价格10万美元,手术中医生将把它和上心房缝接起来。辛卡迪亚人造心脏只能在医院里使用，患者被植入人造心脏后不能离开医院，因为接受人造心脏的患者必须同电脑控制台保持连接，以便调节血液流量，将病人的血压恢复到正常值，并且支持一些生命器官，如肾和肝。对81位患者的临床试验中，79的人在人造心脏的支持下完全能活到接受心脏移植手术时，平均维持了79天，最长的甚至在心脏移植手术前活了400天。,1995年，Massachusetts 的研究者们在一个可生物降解的人耳形状的模子表面接种上人软骨组织细胞，然后将模子移植到裸鼠身上（裸鼠因为存在天然的免疫系统缺陷，而不会对模子产生免疫排斥反应）。人软骨组织细胞从小鼠的血液中得到营养，不断生长并填满模子，最终造出了一个“耳朵”。,人耳鼠,胚胎干细胞 成体干细胞,干细胞,一、植物基因工程硕果累累,转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.,基因工程与农牧业、食品工业,1.抗虫转基因植物,基因工程与农牧业、食品工业,2.抗病转基因植物,基因工程与农牧业、食品工业,3.其他抗逆转基因植物,基因工程与农牧业、食品工业,4.利用转基因改良植物的品质,基因工程与农牧业、食品工业,基因工程与农牧业、食品工业,繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。 该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中。,基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？,二、动物基因工程前景广阔,1.用于提高动物生长速度,基因工程与农牧业、食品工业,转生长激素基因鲤鱼（左）,2.用于改善畜产品的品质,3.用转基因的动物生产药物,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),基因工程与农牧业、食品工业,1、环境监测 基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。 利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。,2、环境污染治理 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,基因工程与环境保护,1、有些转基因食物含的一些物质，可能会影响人体健康。 2、大量的转基因生物进入自然界后很可能会与野生物种进行杂交，产生一些超级生物，从而造成基因污染。 3、如有些作物插入抗虫基因，杀死环境中有益的生物。,基因工程的弊端,蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。,基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,前提：,原理：,目的：,了解蛋白质的结构和功能,改造基因（基因修饰或基因合成）,定向改造或制造蛋白质,蛋白质工程的概念,蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。,基因 DNA,氨基酸序列 多肽链,蛋白质 三维结构,预期功能,生物功能,mRNA,转录,翻译,折叠,DNA合成,分子设计,蛋白质工程的基本原理,讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。,某多肽链的一段氨基酸序列是： -丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-,2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合 成或改造目的基因（DNA）？,可以通过基因的定点诱变技术来改变的。,丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：UGG 赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：UUU、UUC,基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。,突变点：,人工合成的引物上,手段：,PCR技术,目的：,获得定点突变的基因,蛋白质工程的前景,曙光初现，任重道远,曙光初现：,胰岛素的变迁,牛胰岛素,人胰岛素,胰岛素类似物,短效胰岛素： 中效胰岛素：,起效慢，持续时间长，餐后高血糖，下一餐前低血糖。,有作用高峰，夜间低血糖。,速效胰岛素类似物： 长效胰岛素类似物：,无作用高峰，无夜间低血糖。,起效快，持续3-5小时。,改变个别氨基酸,任重道远：,