第2-1章基因的概念.ppt

第2章 基因的概念 Concept of the Gene,2.1. 早期的基因概念,2.2. 经典的基因概念,2.3. 基因概念的演变与发展,2.4. 基因的分子结构,2.5. 基因概念的多样性,2.1. 早期的基因概念,2.1.1. 融合遗传理论 （Blending inheritane）,母本体液,父本体液,子代具有父，母双亲的性状,+,公元前5世纪 Hippocrates,公元前4世纪 Aristotle 认为残疾人的后代不一定是残疾者,获得的性状是由环境影响 (非遗传物质的改变),新性状一旦获得, 便能遗传给后代,2.1.2. 获得性遗传理论 (Inheritance of acquired characters L.B.Lamarck. 1809),2.1.3. 泛生论假说 （Hypothesis of the Pangenesis）,C. Darwin 1866,Panger,2.1.4. 种质论（Theory of germplasm A.Weismann 1883. ）,Germeplasm,Somatoplasm,Root, Stem, Leaf,Somatoplasm, Germplasm, Germplasm,2.1.5. 遗传因子假说 (Hypothesis of the inherited factor G. J. Mendel 1865. ),生物性状由遗传因子控制,亲代传给子代的是遗传因子(A,a.),遗传因子在体细胞内成双(AA,aa) 在生殖细胞内为单（A,a）,杂合子后代体细胞内具有成双的 遗传因子(Aa),等位的遗传因子独立分离 非等位遗传因子间自由组合地分配到配子中,缺乏细胞在有丝分裂和减数分裂过程中 染色体行为的有力证据,Mendel临终前说：,Gregor Mendel 1822-1884,同时发现并证实 Mendel 的两大规律,1900,Hugo de vires 1848-1935 荷兰 阿姆斯特丹大学 Erich von Tchermark 1871-1962 德国 土宾根大学 Carl Correns 1864-1933 奥地利 维也纳农业大学,Law of segregation,Law of independent assortment,Walter S. Sutton “The Chromosome in Heredity” (1903) 二倍体生物减数分裂后每个配子仅接受成对染色体中的一个 假定基因是染色体的一部分 第一次将遗传学和细胞学科学地结合起来 为Mendel遗传规律的解释提供了细胞学证据,2.2. 经典的基因概念,Theory of the gene,基因是染色体上的实体,基因象链珠(bead)一样，孤立地呈 线状地排列在染色体上,基因是 (Three in one) ；,功能(functional unit) 突变(mutation unit) 交换(cross-over unit),“三位一体”的,最小的 不可分割的 基本的,遗传单位,(1926 T. H. Morgan),2.3. 基因概念的 演变与发展,2.3.1. 基因的位置效应 Position effect,Bar eye,16A,780个,68个,45个,chromosome,Sturtevant,385个,（Ww in euchromatin）,（W gene be silenced in heterochromatin）,W,W,w,w,Ww Red eye,Ww white eye,Position effect,2.3.2. 拟等位基因概念的提出 （pseudo alleles）,Multiple alleles,a1a1 × a2a2,a1a2 ( no wild type ),But !,red eye (w.t),w-wa × w-Y,?,1/1000 W.T red eye,white eye (mut),amygdaloid eye (mut),in Drosophila,紧密连锁 （交换率极低），功能相同（表型相似）,Single Simple Propagation Population,Genetics developing,Pseudo Alleles,顺反子理论 Theory of cistron (S.Benzer 1955) 对经典的基因概念的 第一次重要修正与发展,Diplococcum pneumonice DNA as genetic material,1948. retired, The Nobel committee has been criticized for not recognizing Averys achievement before his death ( 1877-1955 ),理论基础,2.3.3. Theory of cistron (S.Benzer 1955),Mut.T4 rII : rII107, rII105, rII51, rII47(400),E.coli B,plane E.coli B,Blotting into plane E.coli K12,Recombination assay,Three in one !,How many genes ?！,Complementary assay,plane E.coli K12,recombination ? !,function complementary,rII 47 rII106,rII106 rII51,difficult,propagation,recombination,Why?,How?,相 依 为 命 ！,无 能 为 力 ！,杂合二倍体内，野生型基因对突变型等位基因,可以发生功能的补偿, 产生功能互补效应,带有不同突变位点的噬菌体同时感染一个E.coli，构成双突变杂合二倍体，组成互补测验体系，以测定各突变位点所在基因的等位性,不同的 非等位基因,同一等位基因,功能互补效应 的测验体系,具有,不具有,突变 位点 处于,A gene,B gene,rII of T4 phage including two genes,顺反子假说（Theory of cistron）,Cistron 是基因的同义词,在一个顺反子内，有若干个突变单位 突变子(muton),在一个顺反子内，有若干个交换单位 交换子（recon）,基因是一个具有特定功能的，完整的，不可分割的 最小的遗传单位,基因内可以较低频率发生基因内的重组，交换,pseudo alleles 是基因内的突变体,cistron 概念的提出 是对经典的基因概念的动摇 是对pseudo alleles概念的修正,2.3.4. 等位基因（Allele, Allomorph）概念的发展,Allele 同一座位存在的两个以上不同状态的基因, 其总和称 之为复等位基因（multiple alleles）（A, a1, a2）,site,Gene locus,ATTCGGAGCT,ATTCAGAGCT (mut2),ATTCAGAGCT,ATTCGGAGCT (mut1),全同等位基因 在同一基因座位(locus)中，同一突变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因( homoallele ),非全同等位基因；在同一基因座位（locus）中，不同突变位点（site）发生突变所形成的等位基因。( heteroallele ),site,Gene locus,site,ATTCGGAGCT,ATTCGGAGAT (mut),ATTCTGAGAT,ATTCTGAGCT (W.t),ATTCTGAGCT,早期基因的概念 经典的基因概念 基因概念的发展,Lac. Operon,2.3.5. 操纵子理论 (Lactose operon 1961. Jacob, Monod ),某一基因功能的表现 是若干基因组成的信息表达的整体行为,one gene one function (Ribozyme, Abzyme, rDNA, tDNA),one gene one enzyme,one gene one peptide, transcritable, translatable gene ( Z,Y,A ),Transcritable but non-translatable gene ( tDNA, rDNA ),Non-transcritable, non-translatable gene ( promoter, operator ),2.3.6 基因的类型, cis action factor,Affects the activity only of DNA sequences on its own molecular of DNA, this property usually implies that the factor does not code for protein,通过核苷酸自身的特异二级结构控制与它紧密连锁的结构基因的表达，,一般不编码蛋白质(无基因产物的DNA功能区), trans action factor,Affects the activity of any gene located on genome by its translated product.,通过扩散自身表达产物（酶，调节蛋白）控制其他基因的表达 可转录，可翻译调节蛋白的DNA功能区 可通过互补测验体系确定其功能区域,Cis (Latin = here) In cis = On the same DNA molecular Trans (Latin = across) In trans = On the different DNA molecular,? !,DNA is a main genetic material,Is the protein genetic material ?,复制 ?,表面遗传信息 ?,RNA is genetic material also,Tobacco Mosaic Virus (TMV), Hershey lambdar phage cycle, Watson & Crich DNA double helix,2.3.7. DNA 是主要的遗传物质,是否存在核酸之外的 其他遗传物质？,高度纯化的病体脑组织的感染性粒子,可被蛋白酶K抑制,不被核酸酶和辐射灭活,不含大于100nt的核酸,28kD 的疏水性糖蛋白 由核基因组基因 PrP（Prion Protein）编码,Prion (proteinaccous infections particle) 传染性病原蛋白颗粒引起的风波,Prion 复制? 转录? 翻译?,统称Prion (元病毒),DNA作为遗传物质的优点 (自然选择的优势), 储存遗传信息量大,大基因组生物,DNA中如有U, DNA中有T无U是进化的结果,2.4.基因的分子结构,Nucleic Acid (NA),Mono-phosphate (Mp),Nucleoside (Ns),Deoxy-ribose ( Ribose ),Base,2.4.1. 基因是DNA分子的片段,l DNA 与RNA的区别,RNA,2 单磷酸核苷酸,3 单磷酸核苷酸,Nucleotide (Nt) basic unit,2.4.2. DNA 双螺旋结构模型 (DNA Double Helix Model),1938. W. T. Astbury,1950. Chargaff,1952. Alexander Todd,NtNt NtNtNt,X ray photograph of DNA,Rich AT form & rich GC form,3, 5 phosphodiester bond,Xray photograph of DNA with high quality,1953. Watson & Crick,Right handed B-form DNA Double helix Model,G-C pair, held together by three hydrogen bonds A-T pair , held together by two hydrogen bonds,l 碱基顶部基团裸露在DNA 大沟内,l 蛋白质因子与DNA 的特异结合依赖于 氨基酸与DNA 间的氢键的形成,l 蛋白质因子沿大沟与DNA形成专一性 结合的机率与多样性高于沿小沟的结合,l 大沟的空间更有利于与蛋白质的结合,DNA双螺旋的结构特点,Right handed B-form DNA Double helix Model,2.4.3. 影响双螺旋结构稳定性的因素,碱基堆积的棒状实体,l 氢键 (Hydrogen bond 46 kc / mol),消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力,弱键, 可加热解链,氢键堆积, 有序排列(线性, 方向),l 磷酸酯键 (phosphoester bond 8090 kc / mol),l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件,强键, 需酶促解链,l 碱基堆积力 (非特异性结合力),3.4A°,( 1 kc / mol 0.6kc / mol ) ×n (热运动消耗), 磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列, Van de waals force (1.7A°/ 嘌呤环与嘧啶环作用半径),(0.34 nm/碱基对间距), 疏水作用力 (Hydrophobic interaction),不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力 即为熵 Entrophy （S）,成为碱基间的部分堆积力,l 磷酸基团间的静电斥力,l 碱基内能增加, 使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱,DNA分子中非极性的嘌呤、嘧啶环（-NH2等），使有序的以氢键连接的水分子层绕，熵值降低。,DNA分子中非极性碱基的聚集，使有序的水分子层绕减低到最低的限度，减少熵值的降低。,2.4.4. DNA分子变性( DNA denaturation ), D.S. DNA,S.S. DNA,( 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺 ),变性过程的表现, S.S. DNA粘度降低,溶液粘度取决于分子流动过程中的内摩擦和阻力,高分子溶液 普通溶液 线状分子 不规则线团 球形分子,D.S. DNA 钢性较强，结构较为舒展的 Double helix S.S. DNA 没有氢键的支撑 由螺旋结构向折叠和线团结构转变,变性过程的表现, S.S.DNA 沉降速度加快, S.S.DNA分子的A 260 nm UV 值上升 ( Hyperchromicity ),1.185,Concentration 50g/ml Opetical Density,= OD增加值的中点温度(一般为85-95),Marmur-Doty formula,Evaluation GC% of DNA,Tm = 69.3 + 0.41 × GC%,Tm1 Tm2,what is meaning ?,l 增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity ),高分子量的DNA分子在热变性过程中, 富含AT区域首先发生 变性, 然后逐步扩展, 表现增色效应的跳跃现象, 使变形过程加快., 影响 Tm值的因素, 在 A, T, C, G 随机分布的情况下, GC%含量相同的情况下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小,碱基排列对Tm值具有明显影响（除变性核心外） （碱基堆积力的差异 ）, 大片段D.S. DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关, 小于100bp 的 D.S DNA分子比较,片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小, 变性液中含有尿素，酰胺等, 盐浓度的影响,单链DNA主链的磷酸基团,负电荷的静电斥力,两条单链DNA的分离,Na+在磷酸基团周围形成的电子云 对静电斥力产生屏蔽作用,减弱静电斥力,Tm ,Tm ,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH2+ (质子化),改变氢键的形成与结合力,极端pH条件的影响,一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低,2.4.5. DNA 分子的复性 (anneal or renaturation),D.S DNA,S.S DNA,Denaturation , Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ),影响DNA复性过程的因素 ：,影响DNA复性过程的因素 ：,DNA 分子中, dNt 的排列状况 (随机排列, 重复排列),S.S, DNA 的初始浓度 C0,3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,复性动力学的研究方法,Hydroxyapatite column 羟基磷灰石柱,Low C of P,High C of P,absorb D.S. DNA,release D.S. DNA,复性发生的过程的讨论,遵循second order kinetics formula （二级反应动力学）,dCt / dt = -KCt2,反应初始 t = 0,两条部分同源(小于20dNt)的S.S. DNA, 在复性过程中 形成的部分双链区是不稳定的,单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）,单链 DNA浓度 = C0,反应达 t 时,单链DNA浓度 = Ct,dCt / dt = -KCt2 积分,Ct / C0 = 1 / 1+KC0t,当 Ct / C0 = 1/2 时,Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2),K = 1 / Cot(1/2),Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L),任一DNA分子达到Ct / C0 = ½的速率 是定值,在控制反应条件相同的前提下, 两种DNA分子的C0t(1/2)值, 取决于dNt 的排列复杂性 ( 复性动力学的复杂性, Kinetic complexity, K.C ),AAAAAAAA K. C. = 1 C0t(1/2) = 2×10-6,ATCGATCGATCG K.C. = 4 C0t(1/2) = 8×10-6 K.C. = 5 ×105 C0t(1/2) = 1,Ct/C0,0,1,0,1,C0t(1/2) C0t(1/2),Fraction reassociated,DNA双螺旋的结构特点 影响双螺旋结构稳定性的因素 DNA分子变性 DNA 分子的复性,2.4.6. 核酸分子的空间结构,一级结构： DNA分子的核苷酸组成与排列（sequence）,1977 F. Sanger 174 的全序列分析,二级结构： D. S. DNA Double Helix model,A, B, Z., Linear , circle T. S. DNA (Triplex Strands) Tet. S DNA (Tetraplex Strands),superhelix DNA (Negative , Positive),三级结构： （高级结构）, 二级结构的形态,Linear DNA. L,Open Circle DNA OC relexed form,Supercoiled circle(高级结构) Covalent Closed Circle CCC,核酸分子的二级结构(分别出现在DNA复制， 转录，重组等阶段),核酸分子的二级结构 分别出现在DNA复制， 转录，重组等阶段,(knot),2.4.7. 左旋双螺旋DNA Z-DNA ( Left-Handed Double Helix ),1953. Watson , Crick & Wilkins, 技术条件本身的局限（分辨度）, 研究的精确性（原子间结构的特点?）, 不能人工合成寡聚核苷酸片段 （oligo-dnt fragment ), 仅获得了DNA fiber graphic of X-ray,(G/C)6,1979. Alecxander Rich (MIT),Left-handed double helix,任何 6 bp py-pu 交替排列序列的DNA片段均可形成Z-DNA, 但难易程度不同,DNA的分子构型 ( B, Z, A ) 比较,DNA的分子构型 ( B, Z, A ) 比较,Helix Direction Right Left Right,Bp / circle 10 12 10.7,Distance / bp 0.34nm 0.38nm 0.25nm,Distance / helix 3.4nm 4.46nm 2.8nm,Diameter / helix 2.0 nm 1.8nm 1.9nm,Sequence Any Poly G-C Any Poly C-A Poly T-G Poly T-A,Condition Normal 4M Na+ DNA-Na Crytic D.S RNA DNA/RNA,C2, C3 / Pu C2-endo C3-endo,Groove Minor N7,C8 outer Minor Major Major Minor deeper deeper,Conformation A,G-anti A, G-syn A, G-anti ( dGMP, dAMP ) C, T-anti T, C-anti T, C-anti,Antigen No Yes Yes (check RNA virus),DNA的分子构型 ( B, Z ) 比较,DNA的分子构型 ( B, Z, A ) 比较,Syn,Anti,碱基堆积状况改变,0.2 M Nacl Br.poly(dG-dC),1.5M Nacl Br.poly(dG-dC),4.0M Nacl Br.poly(dG-dC) poly(dG-dm5C),Z-DNA 的检测,poly(dG-dm5C),poly(dG-dC),0.2 M Nacl Z-DNA (Br8G) 趋于稳定,rabbit,Antibody of Z-DNA,B-DNA,Z-DNA,Z-DNA(Br8G),4M Nacl,Br+,Z-DNA 的检测,羊抗兔二级抗体,goat,Antibody of Z-DNA,偶联荧光标记,免疫反应,果蝇唾液腺染色体,细胞学制片,Z-DNA in Drosophila chromosome proved by anti-Z antibody,Immunological slid,Cytological slid,影响Z-DNA稳定的因素(in vivo),1, m5C,(G-C)n 排列不是Z-DNA形成的必要条件,2, Z-DNA 中G的C2-NH2在大沟内与H2O-H2O形成氢键连接,3, Z-DNA中G的N7, C8外露, 易与特异蛋白(或Br)结合,可能的功能,基因表达调控,基因关闭,基因表达,2.4.8. 三股螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA), T.S DNA 的发现与证实,l 1953 年以前Pauling (Chemist) 提出 T.S DNA 存在的可能性,l 1953 年 Watson & Crick D.S DNA model 证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体,潜在的专一与DNA (蛋白质) 结合的能力,形成T.S DNA 可能性,l 1957年Davis , Felsenfeld , Rich 发现,T.S DNA的概念,l 1966年Miller & Sobell,实现 RNA + D.S DNA,Trible polyNt,as Repressor 关闭基因,但由于D.S DNA的提出而被忽视,但因证明 LacI 产物为 Repressor 而被忽视, 1975年 Perlgut 人工 合成T.S DNA并证明其 Tm 值, 沉降系数(S),l 1987 年 Mirkin . S . M Nature 330 (495) 证明plasmid DNA 在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在, 1987年 Dervan . Moser Science 238 (645) 合成S.S DNA + D.S DNA T.S DNA,实现DNA的定点切割 研究X-ray photograph 核磁共振 结构功能,继Davis（1957）后 30年 第一次证明T.S DNA 在生物体内的存在, T.S. DNA的类型, D.S. DNA + D.S.DNA,T.S. DNA + S.S. DNA, Homologous palindromic sequence in a D. S. DNA (mirror image structure),Mirkin (1987) pGG332 plasmid DNA,Homologous palindromic sequence in a D. S. DNA Nodule DNA or Hinged DNA,l S. S. DNA + D. S. DNA T. S. DNA PU + PU/PY (偏碱性介质中稳定) PY + PU/PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型,第三条链位于B-DNA的 Major groove中 与D. S. DNA一起旋转,T. S. DNA 的连接键,Watson bonding A T G C (D. S. DNA),H+,Hoogsteen bonding G C+ (pH 小于7) 第三链 质子化 第二链的pu 6,7与第三链的碱基形成 H 键,三股螺旋DNA形成的条件及结构特点,第三条单链DNA分子 位于B-DNA大沟内,与B-DNA以 Hoogsteen 键连接,在 Py / Pu : Pu结构中 有多种配对方式，不一 定需要序列的镜向结构,T. S. DNA可能的功能,a) T. S. DNA可阻止调节蛋白与 DNA结合, 关闭基因转录过程,b) T. S. DNA 与基因重组, 交换有关,加入第三条S. S. DNA 作为分子剪刀(molecular scissors), 定点切割DNA分子,d) 加入反义的第三条链(anti-sence polydNt) 终止基因的表达,2.4.9. 四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ),发现,1958. Poly(I) X-ray photograph,碱基形成环状氢键连接结构,Tetrable Helix DNA,均有形成 四股螺旋DNA 的可能,结 构 特 点,Linked by Hoogsteen Bonding,2 × poly(T4G4) 2 ×poly(G4C4),结 构 特 点,GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT,真核生物染色体端粒DNA结构,可能的功能,A 稳定真核生物染色体结构,B 保证DNA末端准确复制,C 与DNA分子的组装有关,D 与染色体的meiosis & mitosis 有关,思考题,DNA双螺旋结构模型建立的基础或研究背景是什么？ DNA双螺旋结构有些什么基本特点？ 为什么DNA双螺旋中维持特定的沟很重要？ 引起核酸变性的因素有哪些？核酸变性后会出现哪些现象？ 何谓熔解温度？熔解温度的大小与哪些因素有关？ 简述DNA结构的多样性,