第2章提取分离方法.ppt

第二章 中药化学成分的 一般研究方法,第一节 中药化学中的 主要化学成分类型,糖类，苷类，醌类，苯丙素类，黄酮类，萜类和挥发油，生物碱，甾体化合物，三萜类，鞣质。,第二节 生物合成,一、一次代谢及二次代谢,这些是植物生命活动不可缺少的物质，该过程存在于所有的绿色植物中，称为一次代谢过程，产生的物质称为一次代谢产物（primary metabolites）。,1一次代谢：,这些物质对植物生命活动不起主要作用，该过程不是存在所有的绿色植物中，产生的生物碱、萜类等化合物称为二次代谢产物（secondary metabolites）。,2二次代谢：,在植物学、生物学、植物化学、生物化学 等学科知识的基础上，应用同位素示踪技术从 可能的新陈代谢过程、生化反应等多方面推测 各类化学成分在植物体内的形成过程，即植物 化学成分的生物合成学说。,二、生物合成学说,三、主要的生物合成途径,醋酸-丙二酸（AA-MA）途径： 脂肪酸类、 酚类、蒽醌类 2. 甲戊二羟酸类（MVA）途径： 萜类、甾类 3. 莽草酸途径（shikimic acid pathway）： 苯丙素类、黄酮类,4.氨基酸（amino acid pathway）途径： 生物碱 5.复合途径：复杂的化合物,四、生物合成的意义,有利于天然化合物的结构分类或推测 有利于植物化学分类学以及仿生合成等学科的发展 指导使用组织培养方法进行物质生产,第三节 提取分离方法,一、中草药有效成分的提取,提取方法： 按提取原理分类： 溶剂提取法、 水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法，其他方法（升华法，超声提取法，微波提取法） 溶剂提取法最为常用。,(一）溶剂提取法 1溶剂提取法的原理： 依据中药中各种成分的溶解性能，选用对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小的溶剂将有效成分从药材内溶解出来的方法。,（1）常用溶剂,水、亲水性有机溶剂、亲脂性有机溶剂。,其极性大小如下： 水 甲醇乙醇丙酮 正丁醇乙酸乙酯乙醚氯仿 二氯甲烷苯四氯化碳 石油醚,亲脂性有机溶剂,亲水性有机溶剂,（2）常见官能团极性比较：,羧基酚羟基醇羟基氨基酰氨基(巯基)醛基酮基酯基醚基烯基烷基,（3）化合物的极性判断：,由分子中官能团的种类、数目及排列方式等综合因素决定。,分子较小，极性基团多的物质：亲水性较强 易溶于亲水性溶剂,分子较大，极性基团少的物质：亲脂性较强 易溶于亲脂性溶剂,4）溶解规律： 相似相溶 是从 中药中提取有效成分的重要依据之一。,选择溶剂的原则：对有效成分溶解度大，而对共存杂质的溶解度最小。,2溶剂的选择,常用溶剂可分为以下三类： 水可以溶解： 氨基酸、糖类、无机盐等。,甲醇、乙醇、丙酮（与水任意比例混溶 ）： 苷类、生物碱、鞣质等。 特点： 水溶性较大 对植物细胞穿透能力较强 对许多成分的溶解性能好，提取完全 毒性低，价格便宜，回收方便。 乙醇提取中药化学成分是目前最常用的方法。,挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、 某些生物碱及一些苷元。 特点：沸点低，浓缩回收方便， 易燃，有毒，价贵，设备要求较高， 穿透药材组织的能力较差，有局限性。,亲脂性有机溶剂可溶解： （与水不能任意混溶）,3溶剂提取顺序：,（1）系统溶剂提取法按极性递增的顺序,石油醚或汽油油脂、蜡、叶绿素、挥发油、 游离甾体及三萜类化合物 氯仿或乙酸乙酯游离的生物碱、有机酸、 黄酮、香豆素等苷元 甲醇、乙醇、丙酮苷类、生物碱、鞣质 水氨基酸、糖类、无机盐,提取液浓缩成膏，拌硅藻土等辅料，减压干燥成粉再以不同极性溶剂进行分步洗脱。,（2）先用乙醇（或含水乙醇 或含水丙酮）提取,浸渍法 渗漉法 煎煮法 回流法 连续回流法,溶剂提取的方法：,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法 强极性溶剂 溶解范围广（酸水、碱水） 生物碱盐 穿透能力强 苷类 价廉易得、安全 鞣质 煎煮法 糖类 渗漉法 水 有些脂溶性成分溶解不完全 氨基酸 浸渍法 有些苷类成分的酶解 蛋白质 水提液易发霉、变质 水溶性杂质多，过滤困难 沸点高，浓缩困难,常用提取溶剂性能特点,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法 除去多糖、 溶解范围广（不同浓度乙醇） 蛋白质外 渗滤法（稀醇） 水溶性杂质溶出少 的大多数 浸渍法 乙醇 可抑制酶的活性 化学成分 回流法 提取液不易发霉、变质 均可 连续回流法 大部分可回收利用 但有挥发性、易燃烧 甲醇 溶解特点与乙醇相似，但有毒 丙酮 溶解性能同乙醇，但沸点低、易挥发，作为提取溶剂不常用； 但对色素溶解性能好，在分离、精制时常用。 亲水性有机溶剂（和水可任意混溶）,常用提取溶剂性能特点,提取溶剂 性能特点 适宜提取成分 提取方法 对化合物溶解选择性较强; 水溶性杂质少、易纯化 ; 游离生物碱 回流法 挥发性大、易燃烧、有毒 ; 苷元 连续回流法 价格昂贵，对提取设备要求高; 某些苷类 穿透力较弱，提取时间长; 作为提取溶剂不常用。 如:乙醚 bp. 35，极易燃 氯仿 bp. 61、d 1. 480，不易燃，毒性大，对生物碱溶解性好 苯 bp. 80.1，毒性大 石油醚 沸程 3060、6090、90120 脱脂、脱色常用 与甲醇、乙醇不能任意混溶。,亲脂 性有 机溶剂,常用提取溶剂性能特点,（二）水蒸气蒸馏法,适用于：挥发性成分，随水蒸汽蒸馏，不与水发生反应 共水蒸馏：水量不断减少，焦糊现象 隔水蒸馏：水蒸汽发生器，不存在焦糊现象,（三）二氧化碳超临界流体萃取技术（CO2 - SFE） 超临界流体萃取技术：以超临界流体作为萃取介质的一种提取 新技术。 超临界流体：处于临界温度（Tc）、临界压力（Pc）以上，介 于气体与液体之间的流体。 特点：具有液体和气体的双重特性， 如：密度与液体近似 黏度与气体近似 对很多物质有很强的溶解能力 扩散系数是液体的 100倍 （不及气体）,中药提取常用的超临界流体 CO2的优点： 1. 临界温度（Tc=31.4）接近室温, 热敏成分稳定。 2. 临界压力（Pc=7.37 MPa）不太高, 易操作。 3. 本身呈惰性，与化合物不反应。 4. 价格便宜。 超临界流体萃取中药成分的主要优点： 1. 可以在接近室温下工作，防止热敏成分的破坏或逸散。 2. 萃取过程几乎不用有机溶剂，萃取物中无溶剂残留，对环境无污染。 3. 提取效率高，节约能耗。,二、中药化学成分分离与精制方法,分离依据 分离方法 分离原理或特点 二相萃取法 分配系数（K）差异 逆流分溶法（CCD） 液滴逆流色谱法（DCCC） 高速逆流色谱法（HSCCC） 液-液分配柱色谱 正相色谱和反相色谱 加压液相色谱法 正相色谱和反相色谱 快速色谱（2个大气压） 低压液相色谱（LPLC） （5个大气压） 中压液相色谱（MPLC） （5-20个大气压） 高压(效)液相色谱法（HPLC） （ 大于20个大气压）,分配系数（K）差异,（1）液液萃取与分配系数K值 是利用混合中各成分在两种互不相溶的溶剂中，分配系数不同而达到分离的方法。 分配系数：K = CU / CL,萃取时，各成分在两相溶剂中分配系数差异 越大，则分离效果越好。,A、B两种溶质用氯仿与水分离， V氯仿/V水=1，假设KA=10，KB=0.1,液-液萃取法,（2）A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值 称为分离因子。 =KA/KB（KAKB） 当100，一次萃取可分离； 10100，10-12次； 2，100次； 当1时，则KAKB，意味着两者性质极其相近， 无法实现分离。,（3）分配比与PH的关系,对于酸性、碱性化合物及两性化合物来说， 分配比还受溶剂系统PH的影响。游离状态一 般可溶于有机相，反之不溶。,以酸性物质（HA）为例,一般pH3时，酸性物质多呈非离解状态(HA)，碱性物质多呈离解状态（BH+)存在；但pH12时，酸性物质多呈离解状态(A-) )，碱性物质多呈非离解状态(B)。,因为酚类化合物的pka值一般为9. 2-10. 8 ，羧酸类化合物的pka值约为5，故pH3以下大部分酚酸性物质将以非离解形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中；而pH12以上时，则将以离解形式(A-)存在，易分配于水中。,类 型 固定相 流动相 应 用 正相色谱 水 BAW系统 极性、中极性物质分离 （以PC为例） 反相色谱 ODS 甲醇-水、乙腈-水 非极性、中极性物质的分离 （以ODS为例）,常用分配色谱介绍,类 型 压 力（Pa） 分离规模 分析用高压液相色谱（HPLC） 20.2 ×105 1mg左右 制备用高压液相色谱（HPLC） 5mg 中压液相色谱 ( MPLC ) 5.05 ×105 20.2 ×105 100mg 低压液相色谱 ( LPLC ) 10mg,物理吸附（表面吸附）特点: 无选择性、吸附可逆、可快速 进行，应用较多 如: 硅胶 极性吸附剂 氧化铝 极性吸附剂 吸附性差别 活性炭 非极性吸附剂 化学吸附的特点: 有选择性、吸附牢固或不可逆、洗脱难，应用少。 如: 碱性氧化铝 对酚酸类（黄酮、蒽醌）的吸附强 酸性硅胶 对生物碱的吸附强,吸附性差别,半化学吸附的特点：吸附力介于上述二者之间，较弱。 如: 聚酰胺 （氢键吸附） 大孔吸附树脂 吸附原理（范德华引力或产生氢键） 分子筛原理（本身多孔性结构的性质决定的）,（1）物理吸附基本规律相似者易于吸附 吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂。,吸附法分离的依据： 化合物极性差异愈大，吸附性差异愈大，分离效果愈好。,常用的吸附剂： 活性炭、硅胶、氧化铝等。,活性炭： 是非极性吸附剂，对非极性物质具 有较强的亲和力。 吸附规律：吸附力大小比较 芳香族化合物脂肪族化合物 分子量大的化合物分子量小的化合物 在水中对溶质的吸附力在有机溶剂中对溶质的吸附力,硅胶、氧化铝： 为极性吸附剂，对极性物质有较强的吸附力。 吸附原理： 硅醇基与化合物形成氢键,硅醇基与水形成氢键 硅胶吸附的水分愈多，吸附其他化合物的能力愈弱。 吸水量超过17，不能作为吸附剂了。加热到100110时即可除去水，恢复吸附活力，这一过程称为硅胶的活化。, 对强极性物质的亲和力强于弱极性物质。 溶剂极性弱，吸附剂对溶质吸附力相对强， 溶剂极性强，吸附剂对溶质吸附力相对弱。 溶质被硅胶、氧化铝吸附，当加入极性 更强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。,其吸附特点是：,常用吸附色谱介绍,吸附剂 分离原理 吸附规律 应用 硅胶 吸附原理 弱酸性、极性吸附剂 广泛（酸、碱及 化合物极性越大、 中性成分均可） 吸附能力强（难洗脱） 溶剂极性越小，吸附力越强 氧化铝 吸附原理 碱性、极性吸附剂 碱性、中性成分 吸附规律同上 （ 酸性成分与铝络合） 活性炭 吸附原理 非极性吸附剂 吸附规律与上相反 脱色（脂溶性色素）,属于氢键吸附，不但适用极性物质也适用于非极性物质的分离。 特别适合酚类、醌类、黄酮类、鞣质的分离。,性质： 为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、 乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳 定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓 盐酸、冰醋酸及甲酸。,（2）半化学吸附-聚酰胺吸附,在水溶液中大致有下列规律 形成氢键基团的数目：越多，吸附力越强。,溶质对吸附的影响,分子内氢键：被分离物质形成分子内氢 键的吸附力减弱。,芳香程度：分子中芳香程度化高者，吸附力强。,溶剂通过改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程。如聚酰胺与酚类或酮类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强，在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。,溶剂对吸附的影响,故在聚酰胺柱色谱分离时，通常用水装柱，样品也尽 可能作成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质的充分吸附，随后 用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度，逐步增 强从柱上洗脱物质的能力。,各种溶剂在聚酰胺上的洗脱能力由弱到强的顺序: 水 甲醇 丙酮 氢氧化钠水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液,甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中 均有酰胺基，作为第三者可以同时与聚酰胺及酚类 等化合物形成氢键缔合，故有很强的洗脱能力。,溶剂也会参加吸附剂表面的争夺而影响吸附过程。, 此外，水溶液中加入碱或酸均可破坏聚酰胺 与溶质之间的氢键缔合，也有很强的洗脱能力，可 用于聚酰胺的精制及再生。 常用的聚酰胺再生剂有10醋酸、3氨水 及5氢氧化钠水溶液等。,聚酰胺的应用,聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的 (鞣质例外)，分离效果好，加以吸附容量又大，故 聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离。 对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其他极性 与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。 因为对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗 提取物的脱鞣处理特别适宜。 聚酰胺色谱也有薄层色谱与柱色谱两种方式。,大孔吸附树脂是一种具有大孔结构的白色球形颗粒状高分子吸附剂。主要以苯乙烯、-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲醋、丙腈等为原料加入一定量致孔剂甲酰胺聚合而成，分为非极性与极性两类。,性质：理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒； 对有机物选择性不受无机盐等离子和低分子 化合物的影响。多为球状颗粒，直径在0.3 1.25mm之间。,（2）半化学吸附-大孔吸附树脂吸附,吸附性与分子筛性原理相结合的分离材料。 吸附性是由于范德华力或产生氢键的结果。 分子筛性由于其本身的多孔型结构决定,吸附原理：,（1）分子极性 极性大成分易被极性树脂（国外）吸附，被分离成分与大孔树脂形成氢键的基团越多，吸附力越强，极性大的有机溶剂洗脱能力强。 极性小的成分易被非极性树脂吸附，极性小的洗脱剂洗脱能力强。,影响因素：,（2）分子体积 对非极性大孔树脂而言，化合物体积越大，吸附力越强。 型号选择： 分离大分子，大孔的大孔树脂 分离小分子，小孔的大孔树脂,（3）溶液的pH 酸（碱）性化合物适当的酸（碱）性 溶液中吸附； 中性化合物中性溶液中可被充分吸附,（4）洗脱剂的选择 甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 应用于树脂的与处理与再生。,离子交换色谱：离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换凝胶。 阳离子交换树脂 离子交换树脂法 阴离子交换树脂 原理：主要取决于化合物解离度的大小。 应用：用于氨基酸、生物碱、有机酸的分离,离解程度不同,树脂类型 原 理 应 用 阳离子交换树脂 离子交换 从酸水溶液中 吸附碱性成分（生物碱） 强酸性（R-SO3-H+） （阳离子） （除去酸性、中性成分） 弱酸性（-COO-H+） 阴离子交换树脂 离子交换 从碱水溶液中 吸附酸性成分（有机酸） 强碱性（RN+(CH3)3CI-） （阴离子） （除去碱性、中性成分） 弱碱性 (伯、仲、叔胺),凝胶滤过法 (三维网状结构的分子筛作用) 透析法 (半透膜膜孔的分子筛作用) 超滤法 (分子大小不同引起的扩散速度的差别) 超速离心法 (溶质在超速离心作用下沉降性的差别),分子大小差别,类 型 原 理 溶胀溶剂 应 用 葡聚糖凝胶 分子筛（大小） 水 多糖、多肽、 （Sephadex G） 蛋白质分离 羟丙基葡聚糖凝胶 分子筛（糖苷） 水、极性有机溶剂 适于不同类型 （Sephadex LH-20）吸附原理（苷元） 或二者的混合溶剂 化合物分离,凝胶过滤色谱,溶剂沉淀法: 1.水提醇沉法（水/醇法） 除去多糖、蛋白质等水溶性杂质 2.醇提水沉法（醇/水法） 除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质 3.醇/醚（丙酮）法 皂苷的纯化（除去脂溶性杂质） 4.酸/碱法 生物碱的分离纯化 5.碱/酸法 酸性成分（如苷元）的 试剂沉淀法: 1.钙、钡、铅盐沉淀法 酸性成分的分离 2.生物碱沉淀试剂沉淀法 生物碱的分离纯化 3.结晶及重结晶 化合物的进一步精制,溶解度差异,最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可以用于沉淀有效成分。 铅盐法是利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀，而用于分离中药成分。中性醋酸铅可以沉淀有机酸、蛋白质、氨基酸、粘液质、鞣质、酸性皂苷、树脂、部分黄酮苷和花色苷等。碱式醋酸铅沉淀范围更广，除了上述能被中性醋酸铅沉淀的物质外，还可沉淀某些中性皂苷、异黄酮苷、糖类和一些碱性较弱的生物碱等。 通常将铅盐沉淀滤出，然后将沉淀悬于水或稀醇中，通硫化氢气体或加硫酸钠等试剂进行脱铅，即可回收提取物。,思考题,1 简述中药中所含化学成分的主要结构类型及性能特点。 2 中药二次代谢产物的主要生物合成途径有哪些？其合成的化合物包括哪些类型？ 3 简述溶剂提取法的关键及选择溶剂的依据。 4 总结五种溶剂提取法各自的优缺点。,