医学微生物学的新挑战2012 (2).ppt

医学微生物学的新挑战,湖南省第二人民医院 尹铁球,OUTLINE,微生物学发展简史 感染性疾病与人类 自动化仪器的进展 分子生物学在微生物检验中的应用 细菌鉴定及分类 耐药性检测 病毒变异的临床意义,微生物学发展简史,经验微生物学时期 实验微生物学时期 现代微生物学时期,认识微生物的历程,微生物的发现 微生物学的开山鼻祖列文虎克 微生物学的奠基人巴斯德 医学微生物学的奠基人科赫,微生物学的经验时期 (十七世纪上半叶以前) 利用微生物,古希腊时蒸酒,微生物在地球上存在了30多亿年，人类并不知道一直和微生物生死共处 我国公元2000多年前就利用微生物酿酒 许多疾病是由微生物引起的：11世纪肺痨 我国17世纪初，吴有性医生在瘟疫论中认为传染病是“乃天地间别有一种异气所感”，并且指出“气即是物，物即是气”，肯定地预见有某种实体是传染病的病原体 我国18世纪，描述鼠疫,实验微生物学时期 (十七世纪下半叶至二十世纪初) 1、微生物的发现和微生物形态学时期,荷兰人列文虎克(Leeuwenhoek)(1632-1723)是微生物学的先驱,微生物学的开山鼻祖 列文虎克,荷兰人用自己制造的显微镜观察到了被他称为“小动物”的微生物世界 发现了杆菌、球菌和螺形菌 实实在在看到并记录了一类从前没有人看到过的微小生命 因为这个伟大的发现，他当上了英国皇家学会的会员,列文虎克观察到的微生物,2、微生物生理学时期 建立了一套独特的研究方法,寻找各种传染病病原菌,巴斯德在观察受狂犬病感染的兔脊髓,巴斯德在工作中,著名的巴斯德研究院,巴斯德在微生物学上的贡献,有机物发酵和腐败由微生物引起 解决葡萄酒和啤酒变酸问题创立巴氏消毒法 解决蚕茧的“微粒子病”的疾病，挽救了法国蚕丝业 主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾液及粪便传播 19世纪70年代，研究炭疽病，拯救了畜牧业 1881年研制成功减毒活疫苗开创人类战胜传染病的新世纪 1885年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的9岁男孩梅斯特奠定了免疫学基础,微生物方法学和医学微生物学奠基人 科赫,科赫,1882年发现引起结核病的病原分离出结核杆菌 创立了微生物学检查方法：固体培养技术、染色技术、实验动物感染 发现炭疽杆菌、霍乱弧菌 总结了著名的“科赫法则” -确立病原微生物 1905年获得了诺贝尔医学和生理学奖,分离细菌的固体培养基,Koch氏确定病原体四要点,在每一例患病的病人中，都应找到此种微生物 该微生物能被分离，且能在纯培养基中生长 培养出的微生物接种于易感动物，一定能导致动物产生该病 在实验性发病动物中，一定能观察并重新获得此种微生物,李斯特在石炭酸喷雾下进行手术,李斯特 无菌操作奠基人,伊凡诺夫斯基 病毒的发现者 欧立希 （Ehrlich） 1910年砷凡纳明抗梅毒药的发现者,1929年青霉素发现者弗莱明 1940年弗洛瑞提纯应用于临床,弗莱明 研究微生物的生命活动,Domagk发现黄胺药,Griffith发现细菌转化现象,新病原微生物的确定方面 1974年从莱姆(Lyme)病患者分得疏螺旋体 1976年在美国费城一次退伍军人会议期间发生 肺炎流行,次年分离出军团菌 1983年从慢性胃炎病人活检标本中分离出 幽门螺杆菌,现代微生物学时期,二十世纪中叶至今,1986年我国台湾省分离得肺炎衣原体 1983年首先在美国发现人类免疫缺陷病毒 （HIV） 近期新发现的病毒有肾综合征出血热病毒、新疆出血热病毒、B 组轮状病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒等,1973年以来认识的病原体示例,年份 微生物 疾病 1973 轮状病毒 全球性婴儿腹泻的主要原因 1976 小隐孢子虫 急性和慢性腹泻 1977 埃博拉病毒 埃博拉出血热 1977 嗜肺性军团杆菌 军团病 1977 Hantaan病毒 伴有肾综合征的出血热 1977 空肠弯曲菌 全球散布的肠病 1980 HTLV-I T细胞淋巴瘤白血病 1981 金葡萄菌产毒素株 中毒性休克综合征 1982 大肠杆菌O157：H7 出血性肠炎、溶血性尿毒症 1982 HTLV-II 毛细胞白血病 1982 Burgdorferi螺旋体 莱姆病 1983 HIV 爱滋病 1983 幽门螺旋杆菌 消化性溃疡病 1988 HEV 肠道传播的非A、非B型肝炎 1990 Guanarito病毒 委内瑞拉出血热 1992 霍乱弧菌O139 与流行性霍乱有关的新株 1992 Hellem巴尔通氏体 猫抓病，杆状血管瘤病 1994 Sabia病毒 巴西出血热 1995 G型肝炎病毒（HGV） 非肠道传播的非A、非B型肝炎 1995 人类疱疹病毒8型 与爱滋病有关的Kaposi肉瘤 1996 TSE致病因子 克罗伊茨非尔特-雅各布病的新变型 1997 禽流感病毒A（H5N1） 流感,汤飞凡发现沙眼衣原体,病原微生物的致病机制方面 微生物基因组研究方面 微生物检测技术方面 防治病原微生物措施方面,感染性疾病与人类,人类已经宣布消灭的疾病：天花 在某些地区已经得到控制的疾病：麻疹、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、结核、鼠疫 正在流行的疾病：伤寒、痢疾、病毒性肝炎、霍乱,感染性疾病与人类,新发生的传染性疾病 原有微生物的再发,一、新发生的传染性疾病,1、原已存在但未被认为是传染病 例如，消化性溃疡 ,T细胞白血病,2、可能早已存在但未知,技术进步发现或人畜接触机会增加 例如，丙型肝炎,莱姆病,3、过去确实不存在,由于微生物发生变异而产生 例如， AIDS, O139 ,耐药菌株,禽流感,SARS,新发生的传染性疾病的原因,人类的不良行为 进入以前未进入的原始森林和地区 采矿 旅游 开垦 嗜食野生动物 宠物热 性乱和吸毒 气候 都市化 人口迁移 拥挤 易感人群增加 “贫民区” 医源性感染和滥用抗生素 战争 贸易 水土流失 微生物的持续不断变异,新近认识的致病微生物,禽流感病毒、SARS、H1N1、产NDM-1细菌,产NDM-1细菌,超级细菌?,产NDM-1细菌,产NDM-1细菌：全称“产型新德里金属-内酰胺酶（New Delhi Metallo-lactamase 1, NDM-1）肠杆菌科细菌”，简称“产NDM-1细菌”，是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌，主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌； 特点： 属于肠杆菌科细菌，致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别； 由于产生NDM-1导致广泛耐药，为“泛耐药菌”； 主要导致医院感染； 源于南亚地区，已在全球播散。,细菌耐药概念,多重耐药（multiple drug resistance, MRD）: 指细菌同时对三种以上结构不同（作用机制不同）抗菌药物耐药，如头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类； 泛耐药（pan-drug resistance, PDR）:细菌对本身敏感的所有药物耐药； 超级细菌（superbug）:并非科学概念，一般指PDR与部分MDR，没有确切定义，以下细菌属于此列： MRSA/VRSA; VRE; MDR-PA,PDR-AB; ESBL(+)+AmpC(+) 肠杆菌 产碳青霉烯酶肠杆菌（包括产NDM-1细菌）,细菌耐药的危害,Cosgrove, et al.Clinical Infectious Diseases 2006; 42:S829,产与不产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的后果比较,细菌耐药的危害,肖永红 等，抗生素类药物滥用公共问题研究，2008,为什么需要关注产NDM-1细菌,泛耐药导致的治疗挑战； 多种肠杆菌科细菌发现； 快速从南亚地区传播到欧美国家； 不仅在医院感染这种发现，同时社区感染这种发现。,产NDM-1细菌的发现,2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，该菌对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素E敏感； 该患者有多年糖尿病和中风史，经常往返于印度和瑞典之间，此前4月曾因臀部脓肿在印度住院治疗，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院； 这株细菌携带一种新型金属-内酰胺酶，研究人员根据患者感染地命名这种酶为NDM-1。,南亚和英国流行情况,www.thelancet.com/infection Published online August 11, 2010 DOI:10.1016/S1473-3099(10)70143-2,产NDM-1细菌种类,传播方式,医院内感染 污染的医疗器械; 污染的医疗用品; 污染的手 跨国传播 跨国医疗旅游,产NDM-1细菌感染临床特点,产NDM-1细菌主要表现为多重耐药，致病力与敏感细菌没有差别； 主要引起医院感染；有社区感染报道； 感染危险因素： 危重患者，入住ICU； 长期住院患者； 使用广谱抗菌药物，或长期应用抗菌药物； 插管或侵袭性操作； 免疫抑制； 呼吸机应用; ,产NDM-1细菌感染临床特点,主要感染类型： 泌尿道感染； 伤口感染； 医院肺炎；呼吸机相关肺炎； 血流感染； 导管相关感染； 感染表现没有特别之处。 碳青霉烯治疗感染无效，提示该类细菌感染可能，需要及时进行检查。,实验室诊断,产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异，临床诊断困难； 对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能； 诊断主要依据实验室检查结果； 实验室检查分为三步： 表型筛查-表型确认-基因确证,产NDM-1细菌表型筛查,美罗培南或亚胺培南纸片法（K-B法，10g纸片）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌进行初步筛查，达到以下标准，需进行表型确认。 K-B法：美罗培南或亚胺培南抑菌圈直径22mm。 MIC测定法：美罗培南MIC2mg/L；或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC2mg/L。,亚胺培南,美罗培南,亚胺培南,美罗培南,产NDM-1细菌表型确认,双纸片协同试验:采用亚胺培南(10g)、EDTA（1500 g） 两种纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。,产NDM-1细菌表型确认,采用亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值5mm；亚胺培南（美罗培南）/EDTA 复合E试条协同试验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值8;即可判定产金属酶。,产NDM-1细菌基因确证,采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序。,PCR,测序,各医院对阳性结果须加以复核，同时菌株送有条件参考实验室进一步检测确证。,1.加强对产NDM-1细菌监测,医院重视临床微生物检验，提高细菌耐药监测能力； 临床参考细菌检验结果应用抗菌药物； 定期公布各医院细菌耐药监测结果； 定期回顾细菌耐药流行趋势，及时发现异常耐药现象，早期发现产NDM-1细菌加以控制。,2.加强抗菌药物合理使用监管,医疗机构应当有专门抗菌药物合理使用管理小组，开展教育、培训、监督、检查抗菌药物使用情况； 严格执行相关管理规定，特别是抗菌药物分类管理规定。 特殊使用抗菌药物卫生部卫办医政发(2009)38号 第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗、头孢噻利等； 碳青霉烯类抗菌药物：亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南等； 多肽类与其他抗菌药物：万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等； 抗真菌药物：卡泊芬净，米卡芬净，伊曲康唑（口服液、注射剂），伏立康唑（口服剂、注射剂），两性霉素B含脂制剂等。,3.加强医院感染的预防与控制,加强医务人员感染控制教育、培训，强化对NDM-1细菌等多重耐药菌感染的预防、控制的认识。 在进行各种侵袭性操作中，严格执行无菌操作。,严格执行医务人员手卫生规范： 医疗机构必须提供充足的手卫生设施。 医务人员在接触病人前后、进行侵入性操作前、接触病人使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或用含醇类速干手消毒剂擦手。,3.加强医院感染的预防与控制,3.加强医院感染的预防与控制,加强对重点部门尤其是ICU物体表面的清洁、消毒 。 消毒剂：含氯消毒剂、0.5%过氧乙酸、2%戊二醛、0.5%醋酸环己啶-乙醇等； 表面消毒方法：选择不同消毒液擦拭或浸泡。,3.加强医院感染的预防与控制,隔离疑似或确诊产NDM-1细菌感染或定植者，预防耐药菌传播。采用接触隔离，将病人安置单独房间，接触患者时需要穿隔离衣、戴手套，相关医疗器械或物品如听诊器、血压计等专用，不能专用的物品，需用后严格消毒。 隔离期间需要定期检测耐药菌情况。,二、原有微生物的再发,病毒性疾病 狂犬病、登革热、黄热病 寄生虫 疟疾、血吸虫病、神经囊尾幼病、棘阿米巴病、内脏利氏曼病、弓形虫病、贾第虫病 、棘球幼病 细菌性 A群链球菌、战壕热、鼠疫、白喉 、结核、百日咳、沙门菌属、肺炎球菌、霍乱、多重耐药菌株的流行,多重耐药菌株的流行,葡萄球菌 肠球菌 肺炎链球菌 肠杆菌科 结核分支杆菌,多重耐药的结核杆菌,是指病人排出的TB至少已对INH和RFP产生耐药或对5种基本抗痨药物（INH、RFP、链霉素、乙胺丁醇、砒嗪酰胺）中的两种以上（包括两种）耐药者 发生原因：单一化疗、不合理化疗、不规律化疗 对策： 合理化疗，预防MTB出现 加强检测，及时检出MTB 约有75%的临床分离株存在RNA聚合酶亚单位基因(rpo B)发生突变，对RFP耐药,肠杆菌科,对三代头孢菌素耐药的肠杆菌科在临床大量出现 主要耐药机制: 产生超广谱-内酰胺酶(Extend-spectrum -Lactamases,ESBLs) 持续产型-内酰胺酶,肠球菌,可引起多种临床感染 对头孢菌素、林可霉素、磺胺类呈现天然耐药,对氨基糖甙类部分天然耐药 现已出现耐万古霉素的肠球菌(VRE),耐万古霉素的肠球菌(VRE),由VanA,VanB和VanC控制 VanA对万古霉素和替考拉宁高度耐药 VanB对万古霉素高度耐药,对替考拉宁敏感 VanC对万古霉素和替考拉宁高度耐药 选用氯霉素红霉素四环素及利福平或其它药物,葡萄球菌,对甲氧西林耐药的葡萄球菌 对万古霉素中度敏感的葡萄球菌 对万古霉素耐药的葡萄球菌,对甲氧西林耐药的葡萄球菌,由mecA基因编码的PBP2a与现有的-内酰胺类抗生素亲和力极低 常伴有大内环酯类、林可霉素类和其它抗生素的多重耐药 常呈异质性表达 万古霉素是唯一有确切疗效的药物 凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌均有较高的发生率,MRSA的调控机制,调控基因 mec I, mec RI Mec I 为阻遏基因，其编码产物为mec I蛋白，为mec A基因的抑制子（repressor) Mec RI 为诱导剂激活基因，在诱导剂存在时编码mec RI蛋白，是一种辅助诱导因子（co-inducer),解除对mec I蛋白对mec A基因的抑制,对万古霉素中度敏感的 葡萄球菌（VISA or GISA),对万古霉素的MIC在8-16ug/ml 已有数起报道、主要发生在MRS中 测定困难：异源性表达、生长缓慢、常规方法不能识别（K-B法、MicroScan rapid plate) Vitek 旧版软件不能测定（只能测到4ug/ml万古霉素），新版能测定,三、自动化技术在微生物学 检验中的应用,数码及数值鉴定技术 常见的鉴定系统,常见的鉴定系统,VITEK AMS系统 icroScan系统 BD BD Phoenix System BBLCrystal半自动细菌鉴定系统 BBLCrystal AutoReader自动细菌鉴定系统,使用自动化鉴定仪的局限性,所有实验室工作人员必须认识仪器的局限性。 细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，及时补充和修改数据库是自动化鉴定仪生存的根本 要加强对自动化仪器的日常维护和质控 自动化鉴定仪得出的结果，必须要与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。,四、分子生物学在微生物检验应用,核酸杂交(生物芯片） 核酸扩增技术 靶扩增系统，包括PCR、TMA、SDA； 探针扩增系统，包括Qbeta复制酶、LCR； 标记扩增技术。 多重PCR，RT-PCR，nest-PCR，RAPD, PCR-SSCP等技术,-细菌鉴定及分类,分子生物学-耐药性检测,耐药基因的检测 糖肽类：vanA，vanB，vanB2,vanC1，vanC3，vanD。 -内酰胺类：mecA，blaTEM，blaROB-1，blaSHV，blaIMP，blaMIR-1，blaOXA，blaPER-1，blaPER-2，blaOXY-1，blaOXA-10/11喹诺酮类：gyrA，gyrB，parE 乙胺丁醇：embB，吡嗪酰胺pncA。利福平rpoB。 链霉素：rpsL，rrs。 异烟肼：katG，inhA，ahpC,应用基因技术进行分型和鉴定,菌种鉴定 菌株分型 研究其亲缘关系：复发和再感染判断 分析不同种属间的差别 揭示种内不同菌株间的细微差异 弥补了表型分型的不足 多用于分子流行病学研究,这些技术包括： RAPD RFLP AFLP SSCP PFGE DNA Sequence,细菌种属的鉴定,DNA碱基组成的测定,DNA-DNA杂交,16S rRNA同源性分析,细菌种属特异基因,细菌毒力基因,DNA碱基组成的测定,细菌间DNA分子同源程度可以用细菌DNA分子的G+C或A+T摩尔百分比来反映。亲源关系越近的细菌，G+C mol%越相近 G+C mol%含量不同的细菌，为不同种细菌 含量相同的可能为不同种的细菌 不同菌属间G+C mol%范围在25%-75%之间。细菌的G+C mol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。 最常用的方法是热变性法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法,DNA-DNA杂交,DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。 目前最常用的是复性速率法 同一菌的复性率为100% 80%-90%的同源为同一种内同一亚种的细菌 60%-70%同源性为同一种内不同亚种的细菌 20%-60%同源则是同一属中的不同菌种 这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误,16S rRNA同源性分析,rRNA-DNA杂交 变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法 16S rRNA序列测定 rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16SrRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较,16S-23S rRNA序列测定,在16S和23S rRNA的间隔区，各菌种的长度是不一样的，利用包含16S和23S rRNA部分序列的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，或结合RFLP技术进行分析来鉴定菌种 此外限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机引物扩增法（RAPD）等技术常用于菌株间的差异比较,细菌种属特异基因,某些基因为细菌种特有或属共有，通过对这些基因的检测可以鉴定细菌的种或属 如编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是一组只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。鞭毛蛋白dlh基因通常只存在于伤寒沙门菌 IS6110、IS986插入片段为结核分枝杆菌复合群所拥有等,细菌毒力基因,某些以毒素致病的细菌含有特定的毒力基因 霍乱弧菌的霍乱毒素基因 产肠毒素大肠埃希菌的耐热（ST）和不耐热肠毒素（LT） 白喉棒状杆菌的外毒素基因 可以应用以上技术测定毒力基因的存在，以示相应的细菌存在,五、病毒变异的临床意义,病毒突变体的起源,某些病毒的基因突变率可高达10-310-4（例如逆转录病毒HIV），而有些病毒突变率仅为10-810-11（如疱疹病毒），相当于细胞DNA的自发突变率。大多数RNA病毒的突变率要远远高于DNA病毒 诱发突变 突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变,从而逃逸免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒 人工突变 现代分子生物学技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡核苷酸突变和基于PCR的基因突变技术已得到广泛应用。现在结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因插入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱导出几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。,病毒突变的类型,生化标志物基因突变： 耐药基因突变，导致病毒毒力改变的特异突变； 形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂的敏感性改变。 缺失突变：在某些方面与无义突变相似，但可以是一个或多个病毒基因缺失，也可以是基因组中非编码调控区（如启动子等）的缺失。 自发缺失突变体通常可在病毒群体中累积，生成大量缺陷-干扰（D.I.）颗粒。尽管这些颗粒不具有感染性，但仍有一定的遗传学上的意义，有人认为它们在某些病毒感染过程中以及发病机理方面起着重要作用。通过重组，可以使基因缺失病毒回复突变为野生型病毒，但发生频率通常比较低。,肝炎病毒的变异及基因分型概述,HAV为小RNA病毒科成员，现已被归入嗜肝RNA病毒科。人源HAV存在4个基因型（型），型间核苷酸同源性85%.不同基因型的HAV抗原性相同，因此，HAV只有一个血清型 HBV为嗜肝DNA病毒科成员，可分为6个基因型（基因型AF）,不同地域、人种的HBV基因型可能有着不同的分布。基因型的差异与致病性、抗病毒治疗效果、预后等的关系尚无明确结论，尚待进一步研究,肝炎病毒的变异及基因分型概述,HDV是一种RNA缺陷病毒现被归类于卫星病毒科成员。世界各地HDV不同分离株的核苷酸变异在11%17%之间。HDV可分为3个基因型 ，大部分分离株为型，型和型分别在日本和南美多见。 HCV为黄病毒科成员，该病毒变异较大，目前至少存在6个以上的基因型。HCV的基因型与致病、预后、干扰素的治疗等密切相关，需引起高度重视。 HEV为环状病毒科成员，感染后导致急性肝炎，临床表现和发病经过与甲型肝炎有一定差异，比如妊娠妇女感染的死亡率较高；发病者年龄分布不明显；更容易发生瘀胆；重型肝炎的发生率高于甲肝；患病后无终身免疫等等。世界各地的HEV分离株可分为2个基因型，即缅甸型和墨西哥型，我国、东南亚各国及印度流行的为缅甸型。,HBV-生物学特性,不完全闭合环状双链DNA S、C、P和X 4个ORFs S基因 C基因 P基因 X基因,S基因区变异,S基因区包括前S1、前S2及S基因，分别编码前S1蛋白、前S2蛋白及主蛋白 前S1蛋白能调节HBsAg的分泌；它的第2147aa是HBV与靶细胞上特异受体结合的主要部位，但第377aa均参与HBV感染靶细胞的过程 前S2蛋白N末端的5个aa是自被感染细胞内分泌完整病毒颗粒所必需的。前S1起始码下游第230碱基，可突变形成终止码，并影响前S2起始码，这种突变与HBV逃避干扰素治疗和宿主免疫清除有关 HBV DNA第2995-3177nt位于前S开放读码框(ORF)内，但其缺失可削弱前S的免疫性，但仍能保留与肝细胞的结合位点，有利于HBV逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态。,S基因区变异,HBsAg第99-169aa是诱导中和抗体产生的决定簇。124-137aa和138-l47aa，特别是第142，l44，145aa三处突变，包括典型的“疫苗逃避株”145甘氨酸精氨酸。这些突变可削弱或改变HBsAg的免疫原性，降低HBsAg被HBIG识别的能力； 这些突变可能是长期免疫压力筛选的结果。,P基因区变异,P基因区编码HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突变率与逆转录病毒gag基因相近，每年约为2×10-4碱基位点 抗HBV药物胞苷类似物拉咪呋啶(1amivudine)和鸟苷类似物泛昔洛韦(famciclovir) ，主要作用于DNAP，通过与底物dNTP竞争结合以抑制HBV的逆转录和复制 HBV耐药株的突变就发生在DNAP基因内。DNAP催化中心由“酪氨酰(Y)、蛋氨酰(M)、天冬氨酰(D)”基序(YMDD motif)组成，是DNAP发挥催化活性所必需的关键结构。针对核苷类药物的抗病毒治疗，病毒YMDD中M突变为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)。发生突变以后可能使病情加剧（即所谓反跳），对所用药物产生耐受,S基因区和P基因区变异的相互影响,由于S基因区完全重叠于P基因区内，特别是HBsAg决定簇区和DNAP致第454-524aa(系主要催化活性区)相重叠，因此，与拉咪夫丁等抗病毒药相关的DNAP的突变至少可致HBsAg中5处aa改变 DNAP的突变正好位于HBsAg决定簇区(主要亲水区)，提示该处P基因的突变也可导致“中和逃避(neutralization escape)”,C基因区的调控序列：,C基因区中前C和C基因上游的调控序列 基本C区启动子(basal core promoter，BCP) 可启动前C mRNA和C mRNA的转录 核心上游调节序列(core upstream regulatory sequcnce，CURS) 能定向调节BCP的活性 负调节元件(negative regulatory element,NRE)，可抑制或消除CURS的活性,C基因区调控序列的变异,C基因区调控序列均可发生变异， 其中最重要和最常见的突变是 BCP中的1762nt AT，l764nt GA，两者常同时出现，与活动性肝炎、肝硬变、肝癌、急性肝衰竭等相关，在后者又常合并l653nt CT。 体外试验显示这三处联合突变可明显减少前C mRNA及HBeAg的产生。 T1762 A1764变异很少在急性肝炎中检出，主要出现于慢性感染过程中，可能是宿主免疫筛选的结果。 T1762突变亦多出现于HBeAg抗HBe血清学转换时，可作为判断HBeAg(+)免疫耐受者发生免疫激活的指标，以及干扰素治疗时选择合适病例的一个依据。,前C基因突变：,前C基因亦可发生多处位点突变，最有临床意义的突变是l896nt GA，可使前C区第28密码子TGG(色氨酸)转变为终止码TAG，导致前C蛋白翻译中断，HBeAg不能产生； 前C起始码亦可发生突变而不能启动HBeAg合成，此突变有助于HBV逃避免疫攻击而形成慢性感染状态，也见于干扰素治疗后，提示以HBeAg转阴作为疾病好转的指标有时并不准确。 病毒复制受到干扰后，有可能提高HBV DNA整合入宿主染色体的能力，从而致癌。 前C突变先于抗HBe( + )出现者，可能是干扰素等药物诱导的转换，反之则可能是回复突变，因为在抗HBeHBeAg逆转换者的血清中只测及HBV野生株。,C基因突变：,C基因可发生多位点多种类型的突变，是HBV感染慢性化、肝细胞损伤加重的重要原因。 有3个突变集中区域：第48-60aa；第84-10laa，其中第87-97aa更是一变异热点；第l47-155aa，此处系前体蛋白处理位点，相应的DNA序列发生错义突变或出现终止码将减少病毒蛋白的产生和分泌。 Cariani报道前C基因变异可同时合并前S或S基因变异，不能同时合成HBcAg、前S蛋白等免疫原性蛋白，使HBV更易逃避免疫清除。 C区内部缺失突变(core internal deletion，CID)的HBV自然变异株，可见于所有无症状携带者、l4100的慢性乙型肝炎患者(香港地区检出率仅7)，以及肝细胞肝癌、肾移植后使用免疫抑制剂者，但很少在急性肝炎患者中检出,（五）X基因区变异,HBxAg也可能成为致敏CTL攻击的靶抗原。患者血清中可溶性HBxAg相关多肽可调节CTL对靶细胞的免疫识别，因此ORF-X变异可能亦不利于清除HBV HBxAg是一种强力反式激活因子，可通过多种途径促发肝细胞癌变,丙型肝炎病毒变异的意义,HCV RNA 的突变率是真核和原核DNA 复制突变率的106倍，达10-310-4nt/碱基位点.年。 以点突变为主，偶可出现插入突变及缺失突变，但核苷酸插入或缺失为3的倍数。 在进化过程中，5NCR和C最保守，NS其次，E最易变异，尤以E2NSl基因NH2-末端的高变区(HVRl)为甚。 HVRl变异有下述生物学意义。 免疫逃逸 慢性化,基因分型,Simmonds等根据病毒基因组核苷酸序列的同源性提出了一个HCV基因型分类命名系统 该系统将HCV分为6个主要基因型。 每型又由若干亚型组成，不同基因型之间全基因组序列差异达30以上或氨基酸差异达2530，同一基因型中不同亚型之间全基因组序列差异达20以上 现在有全基因组序列资料的仅1a、1b、2a、2b和3b等5型，亚基因区序列比较也可取得可信的相同结果，且更简便。 目前已知的各基因型E1、NS4、NS5基因序列资料可用于鉴定HCV新的基因型、亚型和无流行病学意义的分离株。迄今已发现HCV的主要基因型有11个，亚型70余个。,HCV基因型的地理分布特点,HCV基因型分布存在明显的地理差异 其中1a型在美国、巴西和欧洲西北部占优势， 1b型在远东、欧洲东西部多见， 2a和2b型多分布于亚洲和欧洲， 3a型在西方一些国家以及泰国、新加坡多见，并在东印度和孟加拉国的一些感染人群中的唯一基因型。 其他少见基因型的分布则局限于某些持殊区域，如4型在中东和中非占优势；5a型局限于南非；6a型主要见于香港、麦加和越南。,HCV基因型的地理分布特点,中国大陆仅有1b和2a两型，且以1b型为主，在南方城市(南京、南宁、成都)，1b型占90以上，北方城市(哈尔滨、沈阳、兰州)，2a型占4670。大陆的HCV基因型多样性不如香港、台湾及日本，但混合感染率明显高于其他国家和地区。 郭林生等采用Enomoto分型法在10余省、市的122例血清标本中发现5个基因型(RT、K1、K2a、K2b、K3)，其中K1和K2型占75.4。目前我国在HCV基因分型中所用方法难以检出6a或其他新基因型，因此不能除外有其他基因型感染的可能。 迄今尚难对HCV基因型的地理分布作出解释。,研究HCV基因型的意义,作为IFN药效的预测指标 IFN是目前首选的抗HCV药，但反应率仅25左右。,基因型是IFN药效的最重要预测指标,K11b型和K2a2a型的长期缓解率分别为40和91。 1b型的效果低于1a、2a、2b和3型者，4、5、6型HCV对IFN治疗的反应性尚不清楚。 在IFN治疗前应检测病人的HCV基因型和血清病毒量，并以此作为疗效预测指标。 IFN治疗2周后肝组织中负链HCV RNA阴性也是预测IFN长期疗效的有用指标。 1b型对IFN治疗的低反应性原因尚不完全清楚，可能与1b型HCV的E2NS1糖蛋白高变区异质性程度及病毒复制能力较强有关。,研究HCV基因型的意义,与肝损害程度的关系： 文献报道1b型HCV与重度慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)关系密切。 1b型者肝组织学分级、分期的恶化进展速度及血清平均HCV RNA效价均明显高于2型； 1b型较其他型引起更严重的肝损害；肝细胞癌患者中1b型阳性率明显高于慢性肝炎和肝硬化者。,研究HCV基因型的意义,1b型HCV致病性较强的可能机制是： E基因区另有一高变区，随时间推移其突变率增加34培，使病毒有可能逃避宿主的免疫监视； 表达或编码的蛋白有较强的细胞毒作用。 多因素分析显示1b型是肝癌发生最重要的危险因子 也有不支持上述观点，需进一步研究包括建立体内、体外HCV复制和蛋白表达模型等,研究HCV基因型的意义,HCV感染的诊断：HCV各基因型的基因组核苷酸序列差异导致其表达的蛋白免疫原性和抗原性的区别，抗原性变异，尤以非结构编码区蛋白如C33(NS3)、C-100(NS4)、NS5(NS5a)较大 目前所使用的第3代抗体几乎都来自1a型HCV的重组蛋白抗原，感染1a型的献血者抗体血清效价是感染2、3型者的4.5倍，在非1型感染为主的国家应用此抗体检测时应慎重解释检测结果。 目前有学者采用不同基因型HCV的重组蛋白建立HCV抗体检测方法，应根据本地HCV基因型特点研制诊断试剂,研究HCV基因型的意义,HCV疫苗的制备：有效的疫苗是防治HCV感染的重要手段。 有效的HCV疫苗应包含各主要基因型的免疫原， 研制HCV疫苗还有许多问题需要解决，最重要的是要明确是诱导产生中和抗体为主，还是以激发细胞毒T细胞活性为主， 目前认为以C和NS3蛋白或多肽(与高度保守的T细胞位相一致)为基础的疫苗比E蛋白更能诱导广泛的交叉保护反应。 其他：HCV基因型研究对鉴定传染源和追踪传播途径也有重要意义,复习题,目前临床常见的耐药问题有哪些？ 用分子生物学的手段怎样鉴定细菌的种属？ 研究HBV和HCV基因分型和变异有哪些意义？ 使用自动化鉴定仪需注意哪些问题？,Thanks,