第二章酶.ppt

第三章 酶,第一节 酶的概念,在生物体内的生命活动过程中，生物体内要发生错综复杂的化学变化。 在生物个体的繁殖、生长、分化和发育过程中，在生物体对食物的消化吸收以及对新陈代谢所产生的废物的排出过程中，在生物体的运动、对外界刺激的反应和对内外因素所造成的机体损伤的修复过程中等等，均都有许多化学变化发生，最终都伴随有物质和能量的变化。,所有这些变化又都是在生物体内这样 一个极温和的条件下（如体温37、pH中 性、有水等）协调进行的。 这主要归功于一类特殊的蛋白质酶。,一. 酶是一种生物催化剂,（一）酶具有一般催化剂的共同特点 1 . 用量少，催化效率高 只催化热力学上允许的反应（即 G0），量虽少但可使反应由慢变快。 2. 不改变化学反应的平衡点，只改变反应速度，酶本身在反应前后无变化,3. 降低反应的活化能，加快反应的进行,在一个反应系统中，一个化学反应的进行有赖于反应物分子之间的相互碰撞。 由于不同的反应物分子所含能量高低不等，因而只有那些能量相对较高、达到或超过一定限度的分子才能进行反应。这些反应物分子即活化分子 。 活化分子：所含能量达到一定程度能进行化学反应的反应物分子。,（反应的）能阈或能障：活化分子所含的足以参加反应的最低限度的能量。 活化能：非活化分子转变为活化分子所必须获得的最低限度的能量。 通常用一定温度下1mol底物全部进入活化态所需的自由能来度量. 单位：焦耳/mol。,活 化 能,活化分子越多，化学反应速度越快,要使活化分子增多，有两种可能的途径。 一是加热或光照射，使一部分非活化分子转变为活化分子，以加速反应的进行。 二是降低活化能的高度，也就是降低反应的能阈，这使得有更多的反应物分子能进入活化态，加速反应的进行。,前人的工作证明： 催化剂能够降低活化能,活化能越低，反应物分子的活化越容易，反应就越容易进行。 酶的催化作用实质上就在于它能够降低活化能，使反应在较低的能量水平上进行，从而加速反应的进行 。,（二）酶作为生物催化剂的特性,1. 催化效率高 前人的工作表明，酶降低反应的活化能之程度要比一般催化剂大得多，其催化效率更高许多。 一般说，酶促反应之反应速度，较一般（非酶）催化剂催化的反应高1071013倍，较非催化反应高1081020倍。,例如, 脲酶的水解尿素的速度常数比酸 水解的要高7×1012倍左右， H2O2酶催化H2O2的水解的速度常数比 Fe 2+的要高6×105倍。,2. 酶的催化作用具有高度的专一性,酶的高度专一性是指一种酶只能作用于某一种或某一类化合物发生化学反应的性质。 这里，酶所作用的物质专名为酶的作用底物（即酶的底物）。 也有学者提出，酶的高度专一性应包括酶对于底物和反应类型都有严格的选择性。,（1）化学结构的专一性,实验证明，酶对底物的化学结构不同程度也具有一定的要求。 绝对专一性 有的酶对底物的化学结构有严格的要求，即只能作用于某一种底物。 此时，它对该底物之衍生物、结构类似物等均无作用。,例如，脲酶催化尿素的水解,但它对尿素的衍生物甲基尿素则不能进行此催化作用。 此时，酶对底物的整个分子结构、特定的化学键及其两端的基团均有严格的要求。,但是，对催化可逆反应的酶来说，酶对反应两边的底物均有严格要求，而对这些底物的衍生物或结构类似物均不起作用。 例如，三羧酸循环中的延胡索酸酶,就可作用于延胡索酸和苹果酸，但不作用于其衍生物或结构类似物。, 相对专一性,有的酶对底物的化学结构则相对要求不严，除了作用于底物之外，还能作用于底物的衍生物或结构类似物。 此即酶的相对专一性，可分为两种情况。,A. 族专一性（也叫基团专一性） 有的酶，除了对底物分子中特定的化学键有严格要求外，还对该键两端之一端的基团要求严格，但对该键另一端的基团则要求不严。,例如，-D-葡萄糖苷酶可以催化 -D-葡萄糖苷的水解。 该酶要求底物分子中不仅要有-葡萄糖苷键，而且要求该键之一端为-D-葡萄糖残基，但对该键另一端的基团则无要求。,b. 键专一性,有的酶，只对底物分子中的特定的化学键有要求，而对该键两端的基团则无严格要求。这类酶的专一性是最低的。 例如，酯酶催化酯键的水解断裂。 该酶只要求有酯键，而对酯键两端的基团之性质如何并无严格要求。,（2） 立体异构专一性,a. 光学专一性 对具有不对称碳原子的底物而言，它们都具有旋光异构体，即L-型和D-型的底物。 酶在催化具有不同旋光异构体的底物时，要么作用于L-型分子，要么作用于 D-型分子。 例如，L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸发生反应.,b. 几何专一性,对具有双键的底物分子而言，它们都有顺反异构体，即顺式与反式的底物。 酶在催化具有顺反异构体的底物时，要么作用于顺式分子，要么作用于反式分子。,例如前面所提延胡索酸酶，它只能催化延胡索酸（即反丁烯二酸）发生水化生成苹果酸，但不能作用于顺丁烯二酸发生此反应。,3酶促反应的条件温和,酶促反应（即酶催化的反应）一般在 接近生物体温和接近中性的环境下进行， 即在常温、常压、中性酸碱度等温和条件 下进行。,化学反应中的催化剂会因中毒而失去催化能力，酶也会出现类似的“中毒”现象。 凡能使蛋白质变性的因素，如强酸、强碱、高温、高压等条件均会使酶失活。,4酶的催化作用可被调节控制,这是酶有别于其它催化剂的又一个重要特征。 在体内，酶的活性可受到多方面的调节，如共价修饰调节、反馈调节、别构调节、酶原激活、激素调节以及抑制剂、激活剂等的调节。,这些均有利于生物机体根据环境条件的变化来保证机体代谢活动的协调性和统一性。 总之，酶的专一性、高效性及其反应条件的温和性使酶在生物体内的新陈代谢过程中发挥了重要作用。,二酶的化学本质,酶的化学本质是蛋白质，它在细胞内产生。 根据酶在细胞内还是细胞外起催化作用而将之分为胞内酶和胞外酶。,胞外酶在细胞外起作用。 例如动物消化道中的水解淀粉、脂肪或蛋白质的酶，一般占少数。 胞内酶在细胞内起作用。 例如细胞内催化氧化磷酸化、三羧酸循环等的酶。这类酶占多数，用以维持细胞正常的生命活动之需。,酶的化学本质为蛋白质 的主要依据,1926年，Sumner从刀豆中制备了脲酶结晶，并证明了它的化学本质为蛋白质。 1 对热不稳定 酶遇热失活的过程与可溶性蛋白质的加热变性过程极为相似。,2 酶是两性电解质 酶与蛋白质一样，在不同的pH条件下分别以阳离子、阴离子或兼性离子形式存在。 3能使蛋白质变性的物理化学因素，如无机酸、碱、重金属盐、生物碱沉淀剂、长时间振荡、紫外照射、高温、高压等，均可使酶失去活性。,4. 酶具有胶体物质的一系列性质 酶不能透过半透膜，在超速离心机中，其沉降速度大体与蛋白质相同。 5. 许多酶经蛋白酶处理后失去活性。,6. 已获结晶的酶，其催化活性与蛋白质本性密切相关。 虽多次结晶，其均一性和活力也不改变。 7. 许多酶的氨基酸顺序已测定。 牛胰核糖核酸酶是第一个结构被研究清楚的酶，并已于1969年首次被人工合成。,关于核酶（ ribozyme ）,1982年，T.Cech发现原生动物四膜虫的26SrRNA前体经加工转变成的L19 RNA能催化寡聚核苷酸的切割与连接。 1983年，S.Altmen等发现核糖核酸酶P(即RNase P, 一种加工tRNA前体的酶)中的RNA具有该酶的部分催化活性(RNase P 由20%的蛋白质和80%的RNA组成)。,Cech 给这类RNA取名为ribozyme , 中文译为核糖酶、核酶、酶性RNA等。 实际上，这类RNA（即ribozyme）不能看作酶，而只是催化剂乃至生物催化剂中的新成员。 有学者将之译为“酉亥”，这也许更为贴切。,有学者认为核酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,核酶（催化核酸） ribozyme,第二节 酶的组成分类与结构分类,一酶的组成及结构 （一） 酶的组成分类和辅助因子 1 单纯蛋白酶类 从化学本质看，这类酶只含有酶蛋白部份，已足以行使催化作用，不需也不含非蛋白部份。 如胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶等。,2 结合蛋白酶类,从化学本质看，这类酶由酶蛋白部份和非酶蛋白部份组成。 这非酶蛋白部份又叫辅助因子。 酶蛋白+辅助因子=全酶。,只有全酶才是有活性的,这类酶必须同时具备酶蛋白和辅助因 子这两部份才有活性。,3 辅助因子,（1）按其与酶蛋白结合之牢固程度来分 a辅酶 它与酶蛋白结合较疏松。 一般为非共价结合（如离子键、疏水键、氢键，与酶蛋白上的氨基酸残基的侧链结合），可用透析方法除去。,b辅基 它与酶蛋白结合较紧密（或牢固）。不能用透析法除去。 一般为共价结合。 （2）按其化学本质来分 a. 无机金属元素Cu、Zn、Mg、Fe等。 b. 小分子有机物维生素（或其衍生物）铁卟啉等。,4结合蛋白酶中各组成之作用,（1） 酶蛋白决定酶作用的专一性。 （2）在酶促反应中，辅助因子一般起传递氢、电子、原子或化学基团的作用，决定酶促反应的类型。 有的蛋白也有此作用，故称蛋白辅酶。,（3） 一种酶蛋白必须与某特定的辅助因子结合才能形成有活性的全酶，否则酶不表现活力。 另外，一种辅助因子常可与多种不同的酶蛋白结合组成具有不同专一性的全酶。 如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶中均以NAD+为辅助因子。,5金属离子作为辅助因子的作用,（1） 作为酶的活性中心的组成成分 a常具有传递电子的作用，决定反应类型 如细胞色素氧化酶中的Cu+/Cu2+，Fe2+/Fe3+。 b在酶与底物分子间起桥梁作用 如羧肽酶A分子中的Zn2+，它能与底物上的肽键结合，从而促进肽键断裂。,（2） 对酶活性所必需的分子构象起稳定作用 （3） 有的可中和阴离子，降低反应中的静电斥力 关于辅助因子的构成及其与维生素的关系，留待糖、脂代谢及Vit部分再做介绍。,（二） 酶的结构分类,根据酶蛋白的结构特点可对酶进行分类。 1单体酶 只含有一条多肽链，不能再分为更小的单位。分子量一般在1300035000。 属于这类的酶很少，一般为水解酶。 如胰蛋白酶、胃蛋白酶、溶菌酶等。,2寡聚酶 由至少两个亚基组成。亚基个数多为偶数。 每个亚基一般为一条蛋白质多肽链，彼此之间非共价结合，易分开。 亚基之间可以相同或不同。 分子量一般从35000到几百万。 如己糖激酶、3磷酸甘油醛脱氢酶等。,3多酶体系（即多酶复合体、多酶络合物),多酶体系指在完整细胞的某一代谢过程中，由若干个酶形成的反应链体系。 反应链是若干个酶促反应之间存在的一种关系，即前一反应的产物为后一反应的底物，只要第一反应发生，便会逐一发生后面的反应，直到终产物生成。,多酶体系的类型,（1）可溶性的 组成多酶体系的各种酶在胞质中以可溶 性状态单独存在，各种酶之间虽然没有结构 上的联系，但其各自催化的反应之间构成反 应链。,（2）结构化的 组成多酶体系的各种酶有机地组合在一起，形成具有一定结构的复合物，如丙酮酸脱氢酶（系）。 （3） 在细胞结构上有定位关系的 如呼吸链就固定在线粒体内膜上。,二酶的活性中心和必需基团,（一）活性中心（即活性部位） 活性中心是指酶分子中能与底物直接结合并与催化作用直接有关的部位。 它由两个部分组成。 一是结合中心（也叫结合部位），它与底物结合，决定酶的专一性； 二是催化中心（也叫催化部位），它决定酶促反应的性质。,在这两个部位上相应地有结合基团和催化基团来具体实施有关的作用： 即结合基团与底物直接结合， 催化基团直接参与催化反应。 从大分子结构外观上看，活性部位是酶分子中的微小区域，常位于酶分子表面的一个深陷的空穴或一条深沟中。,构成活性中心的有关基团在不同的酶中是有差异的,对单纯蛋白酶而言，其活性中心是由那些在蛋白质多肽链的一级结构上可能相距甚远（甚至可能位于不同的多肽链上），但在经盘绕折叠形成的蛋白质多肽链的三维空间结构中则比较靠近的少数几个氨基酸残基或这些残基的侧链基团组成的。,而对结合蛋白酶而言，活性中心的组成 基团则应包括辅助因子（或辅助因子上的一 部分结构）以及辅助因子在结构上紧密偶联 的蛋白结构区域。,酶的活性中心一般只有一个，但有的酶有几个。 催化中心常常只有一个，包括23个氨基酸残基。 至于结合中心，则有的酶只有一个，有的酶则有几个，每个结合中心的氨基酸数目也不一致。,（二） 必需基团,这些基团若经化学修饰（如氧化、还原、酰化、烷化等），则酶活性丧失。 常见的有Ser-OH、Cys-SH、Lys-NH2、 His-咪唑基、 Asp-COOH和 Glu-COOH。,必需基团不仅位于活性中心，而且还 位于维持酶活性所必需的三维空间结构的 关键位点上。,三酶原的激活,有的酶在生物细胞内最初合成及分泌时并无催化活性，而只是有活性的酶之前体，叫做酶原。 酶原在一定条件下经适当物质作用后可转变为有活性的酶，这个过程就叫酶原的激活。,例如，胰蛋白酶原去掉N端一个六肽 有活性的胰蛋白酶（该酶原由胰脏细胞分 泌）。 再如，胃蛋白酶原由胃粘膜细胞分泌， 胃蛋白酶原胃蛋白酶 。,酶原激活的实质就是酶的活性中心组建、完善并暴露的过程。 象一些参与消化作用的酶往往就是先以酶原的形式被合成并分泌出来。,酶以酶原的形式合成，分泌出来后， 再于特定的部位、环境及特定的条件下被激 活成有特定活性的酶。 这有其重要的生理意义。,例如，胰腺细胞合成并分泌的大多数水解 酶（如一些蛋白酶）都以酶原的形式存在， 待到消化道后才被激活成酶，这就可以保护 该细胞本身不被这些酶破坏。,而血液中的凝血酶原，只是在有创伤出 血时才被激活成有活性的凝血酶，促进血液 凝固，堵塞伤口，防止大量流血，但在平时 并无此作用，也就不会引起血液的大量凝固， 妨碍血液循环。 并非所有的酶都有酶原形式。,四同工酶,在同一种属、同一个体、同一组织或同 一细胞中，催化相同的反应而酶蛋白分子的 结构、理化性质及其生物学性质都又有所差 异的一组酶，就叫同工酶。,同工酶也就是能催化相同反应的几种不同分子形式的酶。 1959年，Market等用电泳法第一次发现了同工酶乳酸脱氢酶同工酶。 至今已被证明有同工酶的有100多种酶。,哺乳动物的乳酸脱氢酶同工酶（LDH）有五种分子形式，它们都是四聚体，但其亚基组成不同。 分子形式：LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5 亚基形式： H4 、 H3M、 H2M2、 HM3、 M4 电泳方向： 正极原点（负极）,这里，M亚基与H亚基在一级结构上有明显差异，因此这五种分子形式在理化性质及免疫学性质方面都是不同的。 这五种分子形式在电泳行为上也是不同的。 但是，它们都催化一个共同的反应。,同工酶之所以能催化相同的反应，在于其活性中心的结构极为相似甚至于相同。 同工酶可由不同基因编码而来，这些同工酶属于初级同工酶。 它们在电泳、层析、免疫学及动力学特点等方面各不相同，但都催化相同的反应。,有的同工酶虽由同一基因编码，但它们是由于该基因的转录产物不同或翻译产物经过不同的加工过程后而产生的。 因此，这些同工酶能催化相同的反应，免疫学特性与动力学参数也相近，只是电泳和层析性质不同。 它们属于次级同工酶。,第三节 酶的催化机理,一 中间产物学说 前已谈到，酶之所以能催化反应的进行在于它能与其它催化剂一样能降低反应的活化能。 但是，酶为什么能够降低反应所需的活化能呢？,目前，一般认为酶在催化反应过程中与 底物形成了一个中间产物，可由中间产物学 说加以解释之。,(一)中间产物学说内容,目前认为，酶促反应中，酶与底物结合 形成酶-底物复合物，然后转变成酶-过渡 态中间物复合物，再转变为酶-产物复合 物，最后产物从酶分子上释放出来。可以用 如下反应式表示： S + E SE S*E PE P + E,在这个过程中，原来的底物分子本身具 有一定的能量，当酶与底物结合形成复合物 时要释放一部分结合能，这导致过渡态的中 间产物处于较E+S更低的能级，从而降低整 个反应之活化能，加速反应的进行。,底物与酶结合形成中间复合物主要是非 共价结合，依靠氢键、离子键、范德华力等 次级键来维持。,(二) 关于中间产物的证据,实验证明，酶促反应速度与底物浓 度之间的关系为一双曲线，而这在化学反应 动力学中被证明是催化剂与反应物形成复合 物的一个证据。,现已用电镜观察到核酸与其聚合酶结合 形成的复合物，用X-射线结晶学方法测得了 羧肽酶与甘氨酰-L-酪氨酸形成的复合物。,酶底物复合物的形成改变了酶的物理 性质稳定性、溶解度均发生了改变。 另外，某些酶与底物形成复合物时，有 特殊的光谱变化。,二诱导契合学说,酶与底物如何形成中间物以完成其 催化作用？ 酶对底物为什么有专一性？,(一)锁钥学说（模板学说，参考）,1890年，E .Fischer提出此学说。他认 为底物或其一部分象钥匙一样，专一地楔入 到酶的活性中心，即底物分子进行化学反应 的部位与酶分子上有催化功能的必需基团之 间具有密切的互补关系。,(二) 三点附着学说 （参考）,立体对映的一对底物，虽基团相同， 但排列不同，导致底物基团与酶的活性部位 的结合基团之间能否互补配对成问题。,此学说难以解释催化的可逆反应，因 为强调了只有固定的底物才能楔入到与其互 补的酶表面。,(三) 诱导契合学说,1958年，Koshland提出此学说。 酶的活性部位在结构上是柔性的，而 非刚性的。,当底物与酶分子相遇时，会诱导酶分子 发生构象变化，使酶的活性中心上的结合基 团与催化基团进行正确的定向与排列，从而 使酶和底物契合（或互补）结合而成中间产 物，使底物发生反应。,三 酶的催化机理,酶能够降低活化能、提高酶促反应速度的若干机制 (一) 邻近定向效应 酶促反应过程中，底物分子上的反应基团与酶 分子上的有关基团需要相互靠近，对双底物分子反 应而言底物分子之间也应相互靠近。,不仅如此，还都要求彼此之间要有正确 的排列与定向，这样才能提高活性中心上底 物的有效浓度，使反应朝正确的方向相互作 用以形成中间产物，降低活化能，加速反应 进行。,（二） 底物形变,酶促反应中，酶分子不仅会在底物 的诱导下发生构象变化，而且会使底物分子 上的敏感键产生“张力”导致底物分子发生 扭曲变形，这种效应即应变或形变效应。,这是由于酶上的基团或离子会使底物的敏感 键中某些基团的电子云密度发生增减，从而产生 “电子张力”，使底物发生形变。 这有助于酶-底物复合物进入过渡态，敏感键 易于发生化学反应。,（三） 酸碱催化,酶促反应中，酶的活性部位上的催 化基团可以作为良好的质子供体或受体而 对底物进行的催化作用即酸碱催化。,有的催化基团是质子供体，可以向底物 提供质子，这种催化作用即酸催化； 反之，作为质子受体而从底物上接受质 子的催化作用，则叫碱催化。,（四）共价催化,某些酶能与底物生成不稳定的、反应活 性很高的共价中间物。 这个中间物很容易转变成过渡态，使活 化能大大降低，反应速度大为提高。这种催 化作用即共价催化。,亲核催化,酶的活性中心的亲核催化基团，提供一对 电子，与底物中缺少电子而具有部分正电荷 的碳原子形成共价键，产生不稳定的共价中 间物，从而引起的催化作用。,亲电（子）催化,酶的活性中心的亲电子催化基团，经从 底物上的亲核原子上夺取某一对电子形成共 价键，产生不稳定的共价中间产物，从而引 起的催化作用。,（五）活性部位疏水空穴的影响,某些化学反应在非极性（低于介电常数）的介 质中比在极性（高介电常数）的介质中的反应速度 要快得多。 酶分子的活性中心是位于非极性的空穴中的， 故可推测，非极性的空穴有利于提高酶促反应速 度。,第四节 酶的活力测定,一 酶活力及其测定 （一） 酶活力 酶活力即酶活性，指酶催化一定化学反 应的能力。,酶的这种能力经其催化的反应速度表 现出来，因而酶活力越大，其催化的反应速 度越快；反之，酶活力越小，其催化反应速 度就越小。,因此，测定酶活力就是测定一定条件 下酶促反应的速度。,（二）酶活力的测定,酶活力的测定应包括两个方面，即酶的 定性测定和酶的定量测定。 酶的定性测定主要是确定所测样品中是 否有该酶存在。 可将该样品取两份，一份高 温处理一段时间，另一份则否。然后在相同 的反应条件下观察现象。,如果高温处理的样品未显出特征性现象， 而未处理样品却显出了，则可初步断定该样 品中有该酶的存在。 随后就可进行酶的定量测定。,酶的定量测定,就是要经酶活力的测定来决定，即经测定酶促反应速度来决定。 酶促反应速度的测定可以从两方面来进行。 一是测定单位时间内单位体积中底物的减少量。 二是测定单位时间内单位体积中产物的生成量。,酶促反应速度的测量（二种方法）： 测定单位时间内底物的消耗量 测定单位时间内产物的生成量(较为准确),在开始一段时间内，反应速度几乎维持恒定,随时间延长：曲线斜率逐渐变小，反应速度逐渐降低。,因此：酶促反应的最初速度，能反映酶促反应的情况。,酶促反应的速度曲线 （即酶促反应的过程曲线）,前人的工作表明，当用产物浓度对反应 时间作图时，可以得到如图所示的酶促反 应的速度曲线（即酶促反应的过程曲线）。 由图可知，每个时间点上的酶促反应速度应为 导数d p/dt，为该点的切线之斜率。,在反应刚开始的一段时间内，曲线基 本为直线，这表明产物浓度p随时间t的增加 而线形增加，着意味着，这段时间内酶促反 应的速度保持恒定。,随着反应的继续进行，曲线平缓弯 曲，直至最后几乎为与时间平行的直线，这 段时间段内，各点的切线斜率随时间的延长 而逐渐减小直至最后几乎为“0”。,造成这种现象的原因有很多,例如，底物浓度下降、因产物浓度增加 而使逆反应加快、产物对酶的抑制或酶变性， 等等。,可见，要测定酶促反应的速度应当在 酶促反应过程的初期进行测定，这样才能排 除这些干扰，才能保证所测得的速度值最能 够客观、本质地反映酶促反应的真实情况。,这个在酶反应初期测定的速度就是酶 促反应的初速度。 其测定一般采用在酶促反应刚开始的一段时 间如510min内进行。 只要测定方法足够灵敏准确，原则上，反应 时间越短越好。,因此，可以先测定不同反应时间内产物浓度（或底物浓度），做出产物浓度（或底物浓度）对反应时间的酶促反应过程曲线。 再根据曲线中反应初期的直线部分，算出其斜率即可以算出酶促反应的初速度。,一般以产物浓度的变化来测定为好。因为酶促反应中底物往往是过量的。 测定酶活力的方法很多，如化学分析法、分光光度法、荧光测定法、电化学法、气体测压、比旋光度等等。 这应由产物或底物的物理化学特性来决定使用。,二 酶的活力单位,酶活力靠酶促反应速度来测定，但现在 用酶的活力单位表示度量。 对酶的活力单位的规定，原没有统一的 标准，多采用习惯法。 以-淀粉酶为例，可用一定反应条件 下，每小时催化1g可溶性淀粉水解所需的酶 量定义为该酶的一个活力单位。,为了统一酶活力单位的计算标准，国际酶学委员会先后做了如下规定。 1961年规定，一个国际单位（U或IU） 为在指定条件下（规定为25、最适pH、饱 和底物浓度），1 min内使1微摩尔（1mol）底物 发生转化的酶量。,若底物分子有一个以上可被作用的化学 键，则规定一个酶活力单位是1min内使 1mol有关基团发生转化所需要的酶量。,为使酶活力单位与国际单位制中的反应 速度（mol/s）相一致，1972年国际酶学委员 会又推荐使用一个新的酶活力单位Kat（即 Katal）最适条件下，每秒钟内可使1mol 底物发生转化的酶量。,目前习惯法仍相当普遍,以-淀粉酶为例。 以1g淀粉/hr为一个酶活力单位， 若所测样品的酶促反应速度为2.5g淀粉/hr， 则所测样品中含有2.5个单位的酶。,三酶的比活力,比活力是指每毫克蛋白质所具有的 酶活力，一般单位为u/mg蛋白。 有时也用单位/克或单位/ml酶制剂来表 示。,由于提取过程中，酶蛋白不够纯，或即使纯，酶活力因种种原因下降，因此酶样品（或酶制剂）中的酶的含量与纯度往往用比活力来表示。 比活力越高，则其中酶的含量和纯度就越高。 在酶的分离纯化过程中，对每一步骤中所制备的酶常采用以下指标进行衡量。,每步酶样品的总活力 回收率= × 100% 第一步酶样品的总活力 开始时的回收率一般设为100%。,每步酶样品的比活力 纯化倍数= × 100% 第一步酶样品的比活力 起始时的纯化倍数一般设为1。,第五节 酶促反应动力学,酶促反应动力学是研究酶促反应速度 规律的科学，它主要研究各种因素对酶促反 应速度的影响。,研究酶促反应动力学对阐明酶的结构 与功能的关系、阐明酶的作用机制、寻找酶的最佳作用条件、阐明某些药物的作用机制及酶在代谢中的作用等，对酶的分离纯化与应用等，都有重要的理论与实践意义。,一底物浓度对酶促反应速度的影响,（一）底物浓度对酶促反应速度的影响 在酶浓度、温度、pH等条件固定不变的情况下，测定不同s下的酶促反应速度值，然后得v-s曲线。 这是一直角双曲线，如图所示。,1，底物浓度对酶促反应速度的影响,V与S呈矩形双曲线关系 曲线 a ：一级反应， V与S成正比关系。 曲线 b ：混级反应。 不成正比关系，v 增加 变慢 曲线 c ：零级反应。 V到达最大值（ Vm）不 再增加。有饱和现象,在s较低时，v随s的增加而线形增加，即v=dp/dt=ks，呈正比关系，表现为一级反应。 在s较高时，v随s的增加而缓慢增加，表现为混合级反应。 在s升高到一定限度时，v 达到最大值Vmax。此时，即使s再进一步增加，反应速度v仍维持在Vmax ，几乎不再改变，表现为零级反应。,这种现象可以用中间产物学说来解释,在酶促反应过程，酶（E）分子先与底物 （S）分子结合形成中间复合物（ES）， 然后降低活化能，发生催化作用使底物S转 变为产物P。,反应速度实际上决定于中间产物ES的浓度。 在一定的酶促反应的体系中，酶量是一定的。 随着S增加，酶与底物形成的ES也相应增加，反应速度也随之增加。,当S增加到一定程度时，反应体系中的酶恰好处于饱和状态，其全部酶分子都与底物形成ES，因而反应速度为Vmax 。 此时，即使S再进一步增加，由于酶分子已不再有多余的去与底物结合，即ES不再增加，因而酶促反应就维持在Vmax而保持不变。,(三) 米氏方程与米氏常数,1. 米氏方程 Vmax S v = Km + S 它表示了底物浓度s与酶促反应速度v之间的定量关系。其中Km为米氏常数。 此公式由Michaelis和Menten总结得出。,当S低时，KmS，S可忽略不计。 则：V与S成正比关系，符合一级反应。,当S高时，KmS，Km可忽略不计。 则：V与S无关，符合零级反应。,2. 米氏常数及其测定,(1)米氏常数的意义 当v = ½ Vmax时，Km = S 故Km是指当酶促反应速度为最大反应速度的一半时的底物浓度。 其单位为浓度单位，一般用 mol/L 或 mmol/L 来表示。,代入米氏方程,Km=S,米氏常数Km是酶的特征性物理常数,在一定条件下（如25、最适pH）下，一种酶对一种底物而其Km为定值。 不同的酶，其Km不同。 测定Km可以鉴定酶。, Km并不是ES络合物的解离常数（Ks=K2/K1）。 Km一般只与酶的性质（如酶的结构、所催化的反应的性质等）有关，而与酶浓度无关。, 当K2K3时，KmK2/K3。可用以表示酶与底物间的亲和力。 Km越大，则亲和力弱；反之则反。 当一种酶有几种底物时，则它对每一种底物各有一种特定的Km。 其中，Km最小的底物是该酶的最适底物或天然底物。, 当Km s时，v始终不能达到Vmax ; 而当Kms时， v始终达到Vmax 无其生理意义，也不符合实际情况。 因此，作为酶的天然底物，其在体内的浓度以接近其Km为宜。, 可用以判断反应的方向和趋势。 催化可逆反应的酶，其催化正反两个方向的Km常常是不同的。 通过测定这些Km及细胞内正反两个方向的底物浓度，可以大致推测该酶催化正反两个方向反应的效率。,这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能具有重要意义 在由若干个酶催化的连锁反应中，如果 各底物浓度相当， 则Km大的酶为限速酶。 判断抑制类型。,（2） Km的测定,方法有很多，但常用的为Lineweaver-Burk作图法，亦即双倒数作图法。 将米氏方程推导为 1/v = Km / Vmax ·1/S + 1 / Vmax， 此方程式相当于Y=AX+B一次直线性方程。 作图可得到如图所示的一条直线。,d 米氏常数的求法,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,双倒数作图推导过程,双倒数作图法,斜率=Km/Vmax,-1/Km,1/Vmax,此直线 在1/v轴上的截距为1/Vmax， 在1/S轴上的截距为-1/Km， 直线的斜率为Km / Vmax。 因此，量取上述坐标轴的两个截距，并结合斜率的对数值，即可求出Km和Vmax。 此法方便，因而得以广泛应用。 但也有不足，如实验点过于集中在直线的两端，因此作图不易十分准确。,二. pH对酶促反应速度的影响,（一）最适pH 溶液的pH对酶促反应速度有影响，如图所示。 在一定pH条件下，酶促反应速度最大，高于或低于此pH时，酶促反应速度均降低，故此为酶促反应（或酶）的最适pH。,酶的最适pH 值： 在一定pH 下，酶促反应具有最大反应速度，高于或低于此pH 值时反应速度下降，通常称此pH 值为 酶的最适pH 值不是一特征常数,影响酶促反应的因素pH,“吊钟形”曲线,（二）pH影响酶活性的原因,1. 过酸（pH过小）、过碱（pH过大）都会改变酶的活性中心的构象，甚至改变整个酶分子的结构而使酶变性失活。 2. pH的改变会影响酶分子上的有关基团的解离，如与底物结合的基团、参与催化的基团、与酶活性中心构象有关的基团的解离，从而影响酶的活性。,3. pH的改变会影响底物分子的解离，如影响底物中与酶结合的那些功能基团的解离状态，从而影响酶活性。 4. 影响辅助因子的解离，从而影响酶的催化作用。 5. 影响中间活性复合物的解离。,（三）最适pH并非酶的特征性物理常数,它不能用以鉴定酶，但是一个重要的实验参数。 它因底物的性质与浓度、缓冲液的性质与浓度、介质的离子强度、温度、酶的纯度以及作用时间的不同而不同。 如脲酶，在柠檬酸盐缓冲液中的最适pH为6.7，在醋酸盐缓冲液中的最适pH为6.3，在磷酸盐缓冲液中的最适pH为7.3。,（四）最适pH与酶的等电点不同。 前者是酶促反应程度的指标，后者是酶分子本身解离状态的指标。 （五）酶在试管中的最适pH与酶在正常细胞中的生理pH不一定完全相同。 这对调控细胞内复杂的代谢途径可能具有重要意义。,三. 温度对酶促反应速度的影响,（一）最适温度 酶促反应时的温度对酶促反应的速度有影响，如图所示。 在某一温度时，反应速度最大，而高于或低于此温度时，酶促反应的速度均下降。该温度即酶的最适温度。 在反应未达到最适温度之前，随着温度的升高酶促反应速度增加。,一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此,大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下,反应速度最大。,一般讲，在0-40范围内，可用温度系数Q10来反映温度对酶促反应速度的影响。 温度系数Q10即反应温度每提高10 ，其反应速度与原来的反应速度之比。 一般化学反应的Q10为2-3，但酶促反应的仅为1-2。,（二）温度影响酶活性的原因,1. 在一定温度范围内，随着温度升高，反应速度也加快。 2. 由于酶的化学本质是蛋白质，故随着温度升高，酶会逐渐变性失活，导致反应速度下降，亦即通过减少有活性的酶而引起反应速度下降。,可见，温度对酶促反应速度（即酶活性）的影响为上述两种作用的综合结果。 低于最适温度时，以前一种作用为主，而高于最适温度时，以后一种作用为主。,3. 大部分酶在60以上即失活，超过80 ，则几乎全部的酶都变性失活。动物体内的酶其最适温度一般为37-50 ，植物体内的则多为50-60 。 少数酶的最适温度较高，如细菌淀粉酶在93 下活力最高，牛胰核糖核酸酶到100 仍不失活。,（三）最适温度非酶的特征性物理常数,它不能用来鉴定酶，但是一个重要的实验参数。 它受酶纯度、底物、激活剂、抑制剂及酶促反应时间等因素的影响。 在实验中，应注明是什么条件下的最适温度。,实验表明，测定最适温度时应规定酶作用（或酶反应）的时间。 所规定的酶反应的时间越长，则所测得的最适温度相应越低；反之，则越高。,（四）应用举例,酶在干燥时较在潮湿状态下对温度的耐受力更高。 高温会使酶蛋白变性失活，故工作中可用高温灭菌。,低温时酶活性下降，但并不破坏酶分子构象，故临床上可用低温进行麻醉。 其机理在于酶在低温时活性降低，从而减慢了组织细胞的代谢速度，提高了机体对氧和营养物质缺乏的耐受性。 诸如生物制品、菌种以及精液的低温保存，也基于同一原理。,四酶浓度对酶促反应速度的影响,在酶促反应系统中，底物足够量（即底物浓度 大大超过酶浓度）、其它条件固定（如温度、pH不 变）、不含抑制剂等妨碍酶发挥作用的因素时，酶 促反应速度与酶浓度成正比，即v与E之间呈现直 线关系。,影响酶促反应的因素酶浓度,当底物浓度 S E 时 v = K E 反应速度v与酶浓 度E成正比关系,酶促反应中，酶要与底物先形成中间产物才能进行反应。 当底物量保证足够时，则随着酶浓度增加，中间产物的浓度就增加，反应就加快。,如果底物浓度太小、作用的时间过长、有抑制剂、去掉了辅助因子或酶蛋白变性的话，则v与E之间不可能呈现这种直线关系。,五激活剂对酶促反应速度的影响,（一）激活剂 凡能使酶活性提高的物质即为激活剂。 酶原的激活是使无活性的酶原转变为有活性的酶，而酶的激活则是使有活性的酶的活性由小到大。,（二）激活剂的种类 1. 无机离子 （1）金属离子 如许多激酶需Mg 2+ 、精氨酸酶需Mn 2+、RNA酶需Mg 2+ 、脱羧酶需Mn 2+ 等，醛缩酶需Mn 2+ 。 （2）阴离子 一般情况下其激活作用不明显，但唾液淀粉酶需Cl-。 （3）H+,2. 小分子有机化合物 如抗坏血酸、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽、巯基乙醇等，分别为不同的酶所需以使-SS- 2 -SH，使酶活性上升。 还有学者认为EDTA也可，因为它可去除重金属杂质对酶的抑制作用。 3. 大分子蛋白质 有的酶需其它酶来激活。,（三）激活剂作用的一些特点,1. 激活剂对酶作用有选择性 某物质对A酶是激活剂，但对B酶则可能不起作用甚至起抑制作用。 2. 激活剂的浓度对酶活性也有影响 有的酶在激活剂浓度升高到一定程度后反而转入被抑制状态。,也有的物质对酶活性的影响表现为随着浓度的增加使酶活性由被抑制转入被激活。 故应在一定浓度范围内使用激活剂。 激活剂对酶作用并非多多益善。,3. 离子之间的拮抗作用 例如，Na+可以激活某酶，但K+却抑制这 种激活作用，因此K+对Na+的作用起拮抗作 用。,4. 金属离子之间的替代作用 例如,Mg 2+可作为激酶的激活剂，有的酶 可用Mn 2+替换Mg 2+后酶仍保持被激活状 态，则这时Mg 2+与Mn 2+之间属于替代作 用。,六. 抑制剂对酶促反应速度的影响,（一）降低酶活性的三种情况 1. 失活作用 使酶蛋白变性而引起酶活性降低乃至于丧失的作用即失活作用。 有学者称之为酶的钝化。 蛋白变性剂可产生此种作用，且对酶