生物化学-叶绿体和线粒体.ppt
MITOCHONGDRION AND CHLOROPAST,第七章 线粒体与叶绿体,MITOCHONGDRION AND CHLOROPAST,第七章 线粒体与叶绿体,本章内容提要,第一节 线粒体 一、结构 二、氧化磷酸化的分子基础 三、氧化磷酸化的作用机理 四、线粒体的半自主性 五、线粒体的增殖 第二节 叶绿体,一、形态与结构 二、光合磷酸化作用机理 三、叶绿体的半自主性 四、叶绿体的增殖 第三节 蛋白质定向转运 一、线粒体蛋白质的转运 二、叶绿体的蛋白质转运,第一节 线粒体,1890年R. Altaman首次发现，命名为bioblast。 1898年von Benda提出mitochondrion。 1900年L. Michaelis用Janus Green B染色，发现线粒体具有氧化作用。 Green（1948）证实线粒体含所有三羧酸循环的酶，Kennedy和Lehninger（1949）发现脂肪酸氧化为CO2的过程是在线粒体内完成的。,一、结构,粒状或杆状。 蛋白占干重的65-70%，脂类占25-30%。 直径0.51m，长1.53.0m，在胰脏外分泌细胞中可长达1020m，称巨线粒体。 肝细胞约1300个线粒体，占细胞体积的20%，许多哺乳动物成熟的红细胞无线粒体。,（一）形态,通常分布在细胞功能旺盛的区域。 在肾细胞中靠近微血管，在精子中分布在鞭毛中区。 线粒体可以向细胞功能旺盛的区域迁移，微管是其导轨、马达蛋白提供动力。,（二）分布,（三）超微结构,分为外膜、内膜、膜间隙和基质四部分。,Structures of the mitochondrion,1、外膜 (out membrane) 含40%的脂类和60%的蛋白，具有porin构成的亲水通道，允许分子量5KD以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。标志酶为单胺氧化酶。 2、内膜 （inner membrane） 含100种以上的多肽，蛋白质和脂类的比例高于3:1。心磷脂含量高（达20%）、缺乏胆固醇，类似于细菌质膜。 通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过。,氧化磷酸化的电子传递链位于内膜。标志酶为细胞色素C氧化酶。 内膜向线粒体内室褶入形成嵴（cristae），能扩大内膜表面积（达510倍），嵴有两种：板层状、管状。 嵴上覆有基粒。基粒由头部（F1）和基部（F0）构成 。 3、膜间隙 (intermembrane space)：是内外膜之间的腔隙，宽约6-8nm。标志酶为腺苷酸激酶。,4、基质（matrix） 为内膜和嵴包围的空间。含有： 催化三羧酸循环，脂肪酸、丙酮酸和氨基酸氧化的酶类。标志酶为苹果酸脱氢酶。 线粒体DNA（mtDNA），及线粒体特有的核糖体，tRNAs 、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等。 纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质，内含Ca2+、Mg2+、Zn2+等离子。,管状嵴线粒体,小鼠肾曲管上皮细胞冰冻蚀刻,人黑色素瘤细胞线粒体,二、氧化磷酸化的分子基础,动物细胞中80%的ATP来源于线粒体，糖、脂肪和氨基酸彻底氧化，电子经过一系列的传递，传至氧分子，逐级释放能量，合成ATP。,（一）电子载体,NAD、黄素蛋白、细胞色素、铁硫蛋白、辅酶Q等。 1、NAD：即烟酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide），连接三羧酸循环和呼吸链，将代谢过程中脱下来的氢交给黄素蛋白。 2、黄素蛋白：含FMN或FAD的蛋白，可接受2个电子2个质子。黄素相关的脱氢酶类主要有：以FMN为辅基的NADH脱氢酶。以FAD为辅基的琥珀酸脱氢酶。,NAD NADP,Flavin mononucleotide(FMN)& Flavin adenine dinucleotide,3、细胞色素：分子中含有血红素铁，以共价形式与蛋白结合，通Fe3+、Fe2+形式变化传递电子，呼吸链中有5类，即：细胞色素a、a3、b、c、c1，其中a、a3含有铜原子。,4、铁硫蛋白：在其分子结构中每个铁原子和4个硫原子结合，通过Fe2+、Fe3+互变进行电子传递，有2Fe-2S和4Fe-4S两种类型。,5、辅酶Q：是脂溶性小分子量醌类化合物，通过氧化和还原传递电子。有3种氧化还原形式，即：氧化型醌Q，还原型氢醌（QH2）和介于两者之者的自由基半醌（QH）。,（二）呼吸链的复合物,呼吸链组分按氧化还原电位由低向高的方向排列。 利用deoxycholate处理线粒体内膜、分离出呼吸链的4种复合物。辅酶Q和细胞色素C不属于任何一种复合物。,1、复合物I：NADH脱氢酶。 组成：42条肽链组成，呈L型，含一个FMN和至少6个铁硫蛋白，分子量接近1MD，以二聚体形式存在。 作用：催化NADH的2个电子传递至辅酶Q，同时将4个质子由线粒体基质（M侧）转移至膜间隙（C侧）。 NADHFMNFe-SQ NADH + 5H+M + QNAD+ + QH2 + 4H+C,2、复合物II：琥珀酸脱氢酶 组成：至少由4条肽链，含有一个FAD，2个铁硫蛋白。 作用：催化琥珀酸的低能量电子转至辅酶Q，但不转移质子。 琥珀酸FADFe-SQ。 琥珀酸+Q延胡索酸+QH2,3、复合物III：细胞色素c还原酶。 组成：至少11条不同肽链，以二聚体形式存在，每个单体包含两个细胞色素b（b562、b566）、一个铁硫蛋白和一个细胞色素c1 。 作用：催化电子从辅酶Q传给细胞色素c，每转移一对电子，同时将4个质子由线粒体基质泵至膜间隙。 2还原态cyt c1 + QH2 + 2 H+M2氧化态cyt c1 + Q+ 4H+C,复合物的电子传递比较复杂，和“Q循环”有关,4、复合物IV：细胞色素c氧化酶 组成：为二聚体，每个单体含至少13条肽链，分为三个亚单位。 作用：将从细胞色素c接受的电子传给氧，每转移一对电子，在基质侧消耗2个质子，同时转移2个质子至膜间隙。 cyt cCuAheme aa3- CuBO2 4还原态cyt c + 8 H+M + O24氧化态cyt c + 4H+C + 2H2O,由复合物I、III、IV组成，催化NADH的脱氢氧化。 由复合物II、III、IV组成，催化琥珀酸的脱氢氧化。 对应于每个复合物，大约需要3个复合物，7个复合物，任何两个复合物之间没有稳定的连接结构，而是由辅酶Q和细胞色素c这样的可扩散性分子连接。,（三）两条主要的呼吸链,Transport of electrons from NADH,Transport of electrons from FADH2,两条呼吸链,鱼藤酮、阿米妥,抗霉素A,CN、CO,呼吸链组分及ATP酶在线粒体内膜上呈不对称分布。 可用亚线粒体颗粒和冰冻蚀刻技术呼吸链组分的分布。 用超声波破碎线粒体，形成颗粒朝外的小膜泡，称亚线粒体颗粒，具有正常的电子传递和磷酸化的功能。 用细胞色素c的抗体能够抑制完整线粒体的氧化磷酸化，但不能抑制亚线粒体颗粒的氧化磷酸化，为什么？,P. Mitchell（1961）提出“化学渗透假说”。认为： 电子沿呼吸链传递时，所释放的能量将质子从内膜基质侧（M侧）泵至膜间隙（C侧），形成质子动力势（ P）。 P=-(2.3RT/F)pH 其中：pH= pH梯度， =电位梯度，T=绝对温度，R=气体常数，F为法拉第常数，当温度为25时P的值为220mV左右。,（一）质子动力势，proton-motive force,Chemiosmotic Theory,状如蘑菇，属F型质子泵。 分为球形的F1（头部）和嵌入膜中的F0（基部）。 F1由5种多肽组成33复合体，具有三个ATP合成的催化位点（每个亚基具有一个）。 F0由三种多肽组成ab2c12复合体，嵌入内膜，12个c亚基组成一个环形结构，具有质子通道。,（二）ATP合酶（ATP synthetase）,ATP 合酶,1979年代Boyer P提出构象耦联假说。其要点如下： 1ATP酶利用质子动力势，发生构象改变，改变与底物的亲和力，催化ADP与Pi形成ATP。 2F1具有三个催化位点，但在特定的时间，三个催化位点的构象不同（L、T、O），与核苷酸的亲和力不同。 3质子通过F0时，引起c亚基构成的环旋转，从而带动亚基旋转，由于亚基的端部是高度不对称的，它的旋转引起亚基3个催化位点构象的周期性变化（L、T、O），不断将ADP和Pi加合在一起，形成ATP。,支持构象耦联假说的实验：,ATP synthase as a reversible coupling device,（三）氧化磷酸化抑制剂,1电子传递抑制剂 抑制NADHCoQ的电子传递。阿米妥、鱼藤酮。 抑制复合物III。抗霉素A 。 抑制复合物IV。如：CO、CN、NaN3、H2S。 电子传递抑制剂可用来研究呼吸链各组分的排列顺序，当呼吸链某一特定部位被抑制后，底物一侧均为还原状态，氧一侧均为氧化态，可用分光光度计检测。,2磷酸化抑制剂 与F0结合结合，阻断H+通道。如：寡霉素。 3解偶联剂（uncoupler） 解偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPs)：位于动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体，与维持体温有关。 质子载体： DNP、FCCP。 质子通道：增温素（thermogenin）。 其它离子载体：如缬氨霉素。 某些药物：如过量的阿斯匹林。,四、线粒体的半自主性,1963年M. & S. Nass发现线粒体DNA。 线粒体类似于细菌的特征： 环形DNA；70S核糖体；RNA聚合酶被溴化乙锭抑制，不被放线菌素D所抑制；tRNA和氨酰基-tRNA合成酶不同于细胞质中的；蛋白质合成的起始氨酰基tRNA是N-甲酰甲硫氨酰tRNA；对细菌蛋白质合成抑制剂氯霉素敏感对细胞质蛋白合成抑制剂放线菌酮不敏感。,mtDNA的遗传密码与通用的遗传密码的区别： UGA不是终止信号，而是色氨酸的密码。 多肽内部的甲硫氨酸由AUG和AUA两个密码子编码；起始甲硫氨酸由AUG,AUA,AUU和AUC四个密码子编码； AGA,AGG不是精氨酸的密码子，而是终止密码子，因而，在线粒体密码系统中的4个终止密码子（UAA，UAG，AGA，AGG）。,五、线粒体的增殖,线粒体来源于已有的线粒体的分裂。 间壁分离：分裂时先由内膜向中心皱褶，将线粒体分为两个，常见于鼠肝和植物分生组织中。 收缩后分离：通过中部缢缩分裂为两个。 出芽：见于酵母和藓类植物，线粒体出现小芽，脱落后长大，发育为线粒体。,线粒体分裂 狗心肌细胞线粒体 新生鼠肝细胞线粒体,2,1,3,第二节 叶绿体,绿色植物通过叶绿体（Chloroplast）完成能量转换，利用光能同化二氧化碳和水，合成糖，同时产生氧。绿色植物年产干物质达1014公斤。 光合作用是地球上有机体生存和发展的根本源泉。,一、形态与结构,象双凸或平凸透镜，长径510um，短径24um，厚23um。叶肉细胞一般含50200个叶绿体，占细胞质的40%。 由外被（chloroplast envelope）、类囊体（thylakoid）和基质（stroma）3部分组成。含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜，3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。,Chloroplast,双层膜组成，膜间为1020nm的间隙。 外膜的渗透性大。 内膜对通过物质的选择性很强，CO2、O2、Pi、H2O、等可以透过内膜，ADP、ATP、 NADP+、葡萄糖等及焦磷酸不能透过内膜，需要特殊的转运体（translator）才能通过内膜。,（一）叶绿体外被,是膜围成的扁平囊。主要成分是蛋白质和脂类（60：40），不饱含脂肪酸含量高（约87%），膜流动性高。 基粒：扁平小囊堆叠而成，每个叶绿体含4060个。 基质类囊体：连接基粒的没有堆叠的类囊体。 膜的内在蛋白主要有：细胞色素b6f复合体、集光复合体（LHC）、质体醌（PQ）、质体蓝素（PC）、铁氧化还原蛋白（FD）、黄素蛋白、光系统I、II复合物等。,（二） 类囊体,是内膜与类囊体之间的空间。 主要成分包括： 碳同化相关的酶类：如RuBP羧化酶占基质可溶性蛋白总量的60%。 叶绿体DNA、蛋白质合成体系：如，ctDNA、各类RNA、核糖体等。 一些颗粒成分：如淀粉粒、质体小球和植物铁蛋白等。,（三）基质,二、光合磷酸化作用机理,首先光能转化成电能，经电子传递产生ATP以及NADPH形式的不稳定化学能，最终转化成稳定的化学能储存在糖类化合物中。 分为光反应和暗反应，前者需要光，涉及水的光解和光合磷酸化。后者不需要光，涉及CO2的固定，分为C3和C4两类。,（一）光合色素和电子传递链组分,1光合色素 包括：叶绿素、类胡萝卜素，比例约为3:1。 叶绿素分为a、b，比例约为3:1。 全部叶绿素和几乎所有的类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质以非共价键结合。,-CHO in chl b,2集光复合体（LHC） 由大约200个叶绿素分子和一些肽链构成。 全部叶绿素b和大部分叶绿素a都是天线色素。,3光系统（PS）：P680 至少包括12条多肽链。位于基粒于基质非接触区域的类囊体膜上。包括一个集光复合体、一个反应中心和一个含锰原子的放氧复合体（oxygen evolving complex）。 4细胞色素b6/f复合体(cyt b6/f complex) 可能以二聚体形成存在，每个单体含有四个不同的亚基。5光系统（PSI）：P700 包含多条肽链，位于基粒与基质接触区和基质类囊体膜中。由集光复合体I和作用中心构成。,非循环式光合磷酸化,循环式光合磷酸化,两个光系统的协调作用,（二）光合磷酸化,一对电子从P680经P700传至NADP+，在类囊体腔中增加4个H+。2个来源于H2O光解，2个由PQ从基质转移而来，在基质中一个H+又被用于还原NADP+，所以类囊体腔内有较高的H+（pH5，基质pH8），形成质子动力势。 H+经ATP合酶，渗入基质、推动ADP和Pi结合形成ATP。 ATP合酶，即CF1-F0偶联因子，结构类似于线粒体ATP合酶。,Electron transport in the thylakoid membrane,线粒体与叶绿体的相似性： 均由两层膜包被，内外膜的性质、结构有显著的差异。 均为半自主性细胞器，具有自身的DNA及转译体系。因此绿色植物细胞内存在3个遗传系统。 叶绿体的ctDNA不足以编码叶绿体所需的全部蛋白质，因此必须依靠于核基因来编码其余的蛋白质。通过定向转运进入叶绿体的各部分。,三、叶绿体的半自主性,四、叶绿体的增殖,在个体发育中叶绿体由原质体发育而来。 在有光条件下原质体的小泡数目增加并融合形成片层，发育为基粒，形成叶绿体。 在黑暗生长时，原质体小泡融合速度减慢，并转变为排列成网格的三维晶格结构，称为原片层，这种质体称为黄色体。在有光下仍可发育为叶绿体。 幼小叶绿体能靠分裂而增殖。 成熟叶绿体一般不再分裂或很少分裂。,第三节 线粒体与叶绿体的 蛋白质定向转运,一、线粒体蛋白质的转运,线粒体具有1000多种蛋白质，其自身合成的仅十余种，因此大量蛋白质是在细胞质中合成的。 利用标记氨基酸培养细胞，用氯霉素和放线菌酮分别抑制线粒体和细胞质蛋白质合成，发现人的线粒体DNA编码的多肽为细胞色素c氧化酶的3个亚基，F0的2个亚基，NADH脱氢酶的7个亚基和细胞色素b等13条多肽。,线粒体前体蛋白质在在运输以前，以未折叠的形式存在，N端有一段信号序列称为导肽或引肽，完成转运后被信号肽酶（signal peptidase）切除，就成为成熟蛋白，这种现象就叫做后转译（posttranslation）。信号肽的特点是： 多位于肽链的N端，由大约20个氨基酸构成； 形成一个两性螺旋，带正电荷的氨基酸残基和不带电荷的疏水氨基酸残基分别位于螺旋的两侧； 对所牵引的蛋白质没有特异性要求。,Mitochondrialer Import,蛋白质的转运涉及转位因子（translocator）等多种蛋白。 TOM复合体：负责通过外膜，进入膜间隙。 TIM复合体：TIM23负责将蛋白质转运到基质，或安装在内膜上；TIM22负责将某些转运器蛋白质插入内膜。 OXA复合体：负责将线粒体合成的蛋白和某些进入基质的蛋白插到内膜上。 线粒体内、外膜之间存在着接触点，信号肽牵引蛋白质前体运送时，可通过内外膜的接触点，一步进入基质。,mitochondrial protein import machinery.,Contact Sites of Mitochondria,Protein Transport into Inner Membrane and Intermembrane Space Requires Two Signal Sequences,蛋白质的输入是一个耗能过程。 在线粒体外解除与前体蛋白质结合的分子伴娘，需要通过水解ATP获得能量。 在通过TIM复合体时利用质子动力势作为动力。 前体蛋白进入线粒体基质后，线粒体hsp70一个接一个的结合在蛋白质线性分子上，像齿轮一样将蛋白质“铰进（hand over hand）”基质，这一过程也需要消耗ATP。然后线粒体hsp70将蛋白质交给hsp60，完成折叠。,二、叶绿体的蛋白质转运,叶绿体蛋白转运运输机理与线粒体的相似。 如： 都发生后转译； 每一种膜上有特定的转位因子； 具有接触点（contact site）； 需要能量，同样利用ATP和质子动力势； 前体蛋白N端有信号序列，使用后被信号肽酶切除。 但两者的蛋白质转运体系中除了某些hsp分子相同外，转位因子复合体是不同的。,Pathway for plastid entry. The general import machinery of the chloroplast envelope membranes. The components are explained in the text.,Translocation of proteins into chloroplasts,
