生物化学与分子生物学实验技术2.ppt

第三章：层析技术,第三章 层析技术,层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产， 还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。,层析技术的分类 (1) 按流动相的状态分类：用液体作为流动相的称为液相层析，或称液相色谱；以气体作为流动相的称为气相层析，或称气相色谱。 (2) 按固定相的使用形式分类：可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱) 、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。 (3) 按分离过程所主要依据的物理化学原理分类：可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。本章按第三种分类进行叙述。,第一节 吸附层析,吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。 吸附层析在各种层析技术中应用最早，由于吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生，装置简单 ，又具有一定的分辩率等优点，故至今仍广泛使用。,凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的，而固体表面的分子所受的力是不对称的。 向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外的一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的，故在一定的条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，这称为解吸作用。 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。本节主要介绍吸附柱层析和聚酰胺薄膜层析 ，薄层吸附层析将在本章第六节介绍，气固吸附层析在第七节介绍。,一、吸附柱层析,将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂。,在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。 如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。,(一) 吸附剂的选择,常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。,羟基磷灰石 羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，简称HA的吸附容量高，稳定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。,使用HA作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水化后所占有的体积)达到2-3mL/克后，再按16体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，HA的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5的缓冲液。当用过的HA层析柱再生时，要先挖去顶部的一层HA，然后用一倍床体积的1mol/L NaCl溶液洗涤，接着用4倍床体积的平衡液洗涤平衡，如此处理后即可使用； (4) 就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。而从分辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。 用细颗粒HA层析时，柱子直径应大些才能达到满意的流速。,2. 硅胶 是最常用的吸附剂，通常用SiO2.xH2O表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。,3.氧化铝 分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。 氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热6h，使氧化铝的含水量在0%-3%之间， 可得到级或级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化铝的内部结构。 4.大孔吸附树脂和聚酰胺 近年用于中药活性成分的分离。,(二) 洗脱涤的选择 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件： 纯度较高； 稳定性好； 能较完全洗脱所分离的成分； 黏度小； 易和所需要的成分分开。,洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐的缓冲液洗脱。而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。 在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。,(三) 操作,柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。 1.层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为110- 140。采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。,2.吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时， 吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍,3.装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内， 排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中， 待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。这种装柱法对各种基质都适用。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。,4. 上样和洗脱 经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2 (当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率)。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标，有合适的检测器和记录仪时，洗脱液流经检测器再收集，用记录仪可自动绘制洗脱曲线。,理想的洗脱曲线如图3-1所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。,为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。,二、聚酰胺薄膜层析,聚酰胺薄膜(尼龙薄膜)层析是指样品溶液随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的不同，而将各组分分离的方法。 聚酰胺是由己二酸与己二胺聚合而成或由己内酰胺聚合而成的高分子化合物。含有大量酰胺基团，其羰基可与含羟基的物质形成氢键，其亚氨基又可与硝基化合物或醌类形成氢键，而产生吸附作用。不同的物质由于形成氢键的能力不同，故吸附力也不同，通过吸附和洗脱就可达到分离目的。,聚酰胺薄膜层析只适用于极性分子的分离。如，酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸类物质等。特别是在蛋白质的化学结构分析中，氨基酸衍生物，如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等的分析，灵敏度高，分辨力强，操作方便，速度较快。 洗脱时，洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键，而使被吸附物解吸。 各种化合物与聚酰胺形成氢键的能力主要由物质的分子结构所决定。此外也与所使用的溶液有关。一般用水作溶剂时形成氢键的能力最强，故容易吸附，难于洗脱。在有机溶剂中形成氢键的能力较弱，在碱性溶液中形成氢键的能力最弱，所以洗脱剂最好选用碱性溶液，如二甲基甲酰胺(DMF)溶液、稀氢氧化钠溶液或稀氨水等。,第二节 分配层析,分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。 分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值： K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。 在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配。当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的 次数越多，越容易被彻底分离。,纸层析属于典型的分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用。本节主要通过纸层析介绍分配层析的基本知识。 此外，将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可构成薄层层析系统，由于薄层层析还可做吸附、离子交换等层析，将在本章第六节专门叙述，在硅藻土上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱上，以气体为流动相可构成气液分配层析，即气相色谱系统，在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定的溶剂，装到层析柱中，用一定的洗脱剂洗脱， 可构成液液分配层析，这种系统在高效液相色谱中应用普遍。 气相色谱和高效液相色谱系统复杂，将在本章第七节和第八章专门介绍。,二、纸层析,(一) 原理 滤纸一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，一般情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。,溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： Rf= a/ b 式中a：溶质斑点中心的移动距离 b：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。,(二) 影响Rf值的主要因素,物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大的物质，在水中的溶解度较大，其Rf值就较小，反之亦然。 2.滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。 此外，滤纸上所含的杂质也会影响Rf值，必要时要进行预处理，以去除杂质的影响。例如：可用0.01-0.4mol/L的HCl处理滤纸，以除去滤纸上的金属离子，然后再用水洗至中性。 层析滤纸由高纯度的棉花制成。要求质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，并具有一定的纯度。国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采用。,3.层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间，样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。 溶剂系统中的试剂若纯度不够，需经过预处理后才能使用。处理的方法因溶剂的性质而异。常用的处理方法有：酸、碱抽提，水洗涤，重蒸馏，脱水干燥等。举例如下： (1) 苯酚：重蒸馏，收集180的馏分。 (2) 乙酸：在冰醋酸中加入1%重铬酸钾，蒸馏，收集118的馏分。 (3) 正丁醇：先后用2.5mol/L硫酸溶液和5mol/L氢氧化钠溶液洗涤，再用无水碳酸钾脱水， 用磨口蒸馏器蒸馏，收集117的馏分。,4.pH值 溶剂和样品的pH值会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。 为了避免或减少pH值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的pH值，通过调节溶剂或样品溶液的pH值，使pH值保持恒定。 5.温度 温度能影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，即影响固定相的体积；同时在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使Rf值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。 某些对温度敏感的溶剂系统，最好不要配成饱和溶液。如水饱和的酚溶液，可改成酚水 41或51等。,6.展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下，用不同的展开方式进行层析时，所得到的Rf 值不相同。用下行法展开时，Rf值较大；用上行法展开时，Rf值较小；用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf值也较小。 7.样品溶液中杂质 样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。,(三) 操作方法,1.样品处理 用作纸层析的样品，应尽可能除杂纯化。调节到一定的pH值，浓度太低的可用真空浓缩提高浓度，浓度太高则需稀释。 2.点样 将滤纸裁成适当大小，用铅笔在距边线2cm左右划一直线(称为原线)，线上每隔2-3cm划一圆点(称为原点)。然后用点样器(定性分析可用普通毛细管，定量分析需用血球计数管或微量注射器)轻轻点在原点上。样品点的直径约0.3-0.5cm。点样的量应根据纸的长短以及样品的性质来决定，一般每一样品的量为5-30g。点样一般采用少量多次，每点一次必须用冷风吹干，然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合，否则会出现斑点畸形现象。,3.平衡 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和，这个过程称之为“平衡”。若不经平衡，滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和，在层析过程中，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，从而改变溶剂系统的组成，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。,4.展开 平衡结束后，将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中，溶剂液面距原线距离约1cm，此时即开始展开。当溶剂前沿到达滤纸另一端0.5-1cm处时，展开结束，取出滤纸，在溶剂前沿处做一标记，晾干或用冷风吹干。 按溶剂在滤纸上流动的方向不同，展开有上行、下行和环行三种方式。 (1) 上行法：将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中，溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单，重现性好，是最常用的展开方法，但展开时间较长。 (2) 下行法：在层析缸上部有一盛展开剂的液槽，将滤纸点样的一端朝上浸入槽中，溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快，但Rf值的重现性较差，斑点易扩散。,(3) 环行法：又称水平法，样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。滤纸水平放置，溶剂由滤纸条引向圆心，然后不断向四周水平方向流动。由于溶剂向圆周方向扩散，所以展开的图谱呈弧形。用环行法展开时，最好使用无方向性的特制滤纸。如东洋51UH滤纸等。 （4）双向展开法：如果样品组分较多，用一种溶剂系统（常为酸性）不能将各组分全部分开时，可将样品点在方形滤纸的一角，用一种溶剂系统展开后吹干溶剂，将滤纸转动90o后再用另一种溶剂系统（常为碱性）展开，这称为“双向展开法”。,5.显色 为了显示层析斑点位置，可根据物质的性质不同，采用显色剂显示或紫外光显示。 (1) 显色剂显示： 被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物，显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 (2) 紫外光显示：有些物质有紫外光吸收性质，如核苷酸类物质。有些物质受紫外光照射会发出荧光，如维生素B1、B2等，所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 6.定性分析 层析后的斑点显示出来后，计算出各斑点的Rf值，就可以对物质进行定性。,7.定量分析 对被分离的物质进行定量的方法很多，常用的有： (1) 剪洗比色法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱后，通过分光光度计进行比色定量。 (2) 直接比色法：用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度，画出曲线，由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 (3) 面积测量法：实验证明，圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以，可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。,第三节 凝胶层析 凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。,一、基本原理 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。,样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度： Ka=(Ve-Vo)/Vi 式中Ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积； Vo：外体积(outer volume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积； Vi：内体积(inner volume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出； 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出； Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出 ，Ka值大的后流出。,上述内体积Vi可以从凝胶的干重和吸足水后的湿重求得，也可用小分子物质(如(NH4)2SO4,NaCl等)实际测量而得到(Vo+Vi)。 外体积Vo可用相对分子质量很大的物质溶液(如血红蛋白、印度黑墨水、相对分子质量为200万的蓝色葡聚糖-2000、铁蛋白等)通过实际测量求出。也可以从下式间接计算， Vo=Vt-Vi-Vg 式中 Vg：凝胶基质本身的体积；Vi：内体积；Vt：层析柱内凝胶床的总体积。 Vt可通过测量柱内径和凝胶床高度计算出来，即 Vt=（1/4）R2h 洗脱体积Ve可通过加进某一组分后实际测量而得，也可以在已知Ka后计算出来。即 Ve=Vo+KaVi,在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。 对于同一类型的化合物而言，组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)的关系可用下式表示： Ve=K1- K2lgMr 式中K1，K2为常数。,若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。在实际应用中多以相对洗脱体积Kav (Kav=Ve/Vt) 对lgMr作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。,二、凝胶的选择 凝胶的种类很多，其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。常用的有： (1) 聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺(CH3=CH-CONH2)与甲叉双丙烯酰胺(CH3=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2)共聚而成。 商品名称为生物胶P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性的，适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化。缺点是遇强酸时酰胺键会水解，一般在pH2-11的范围内使用。,(2) 葡聚糖凝胶 由相对分子质量为4 104-20 104的葡聚糖交联聚合而成。由Pharmacia (GE)公司生产的商品名为Sephadex的葡聚糖凝胶，具有良好的化学稳定性等优点，为最常用的凝胶之一。Sephadex耐碱，在0.01mol/L盐酸中放置半年不受影响，故广泛用于各种物质的分离纯化。 Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等多种型号、和粗、中、细、超细多种规格，G后面的数字越大，胶粒内的孔经越大，越适合于大分子的分离，但颗粒 的机械强度随孔经的增大而降低，较高的操作压会使G75、G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液的流速下降，故用上述型号的Sephadex进行层析时，流速慢，时间长。同型号的Sephadex，颗粒越细，在同样柱长的柱子中分辨力越好，但流速也越慢。,(3) 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶，可制成不带电荷的琼脂糖，用琼脂糖制成颗粒内孔径不等的多种型号层析用琼脂糖凝胶，商品为Sepharose。Sepharose的孔经大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子质量较大的分子。 近年Pharmacia (GE)公司推出商品名为Supersose的琼脂糖凝胶，主要有含琼脂糖6%的Superose6 和含琼脂脂糖12%的Superose12 及其衍生物。Superose刚性特好，理化稳定性高，在高黏度液体(如8mol/L尿素)下能保持较好的流速，适合于糖类、核酸、病毒和包含体蛋白在促溶剂中的纯化。,4.聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 商品名Sephacryl，是由甲撑双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成的球形凝胶颗粒，反压特别低，机械性能好，分离速度快，分辨率高，理化稳定性好，在SDS、6mol/L盐酸胍及8mol/L尿素中均可使用。有S-100HR、S-200HR、S-300HR、S-400HR、S- 500HR、S-1000SF6种型号，可分离相对分子质量1 103-1 108 的蛋白质，亦可用于分离多糖和核酸。,5.Superdex Pharmarcia公司提供的新型凝胶过滤介质，是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成的球形凝胶珠，流速快、反压低、非特异性吸附很低，因而样品回收率很高，是目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质。理化稳定性很高，在0.1mol/L HCl及0.1 mol/L NaOH中40保温400小时分辨力保持不变，在1% SDS、8mol/L尿素及6mol/L盐酸胍中均能保持良好的色谱性能，有多种型号可供选择，适合于生物大分子的精细纯化。,三、操作 层析柱一般内径1-4cm，柱长10-150cm，装柱方法同吸附柱层析。 加样方法同吸附柱层析，样品液浓度大些为好，但黏度不能过大，样品体积一般为柱体积的1%-10%。凝胶柱平衡和洗脱一般用同一种溶液，洗脱液无特殊要求，一般选择使样品稳定的缓冲液。洗脱液的流速要稳定，分离蛋白质和核酸时，常用输液泵、柱、检测器、分部收集器、记录仪构成层析系统，要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度， 记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线。若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速，若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度。峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度。峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。 凝胶暂时不用时，可加少许防腐剂如0.02%叠氮钠或0.002%的洗必泰防止染菌。用过的凝胶可加热灭菌后低温保存或用20%左右的乙醇保存。,一、基本原理 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连 接，电荷基因与反离子以离子键结合。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+ RB+A+,第四节 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。,离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。,两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 。pH与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。 离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。,氨基酸的离子交换分离原理,氨基酸的分离过程,二、离子交换剂 离子交换剂应满足的基本条件有： 有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解； 有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换； 有较多的交换基团； 有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。,(一) 离子交换剂的种类 根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类： 1. 疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团)和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性)。,(1) 阳离子交换剂 阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。因此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型( 带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种。 (2) 阴离子交换剂 阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺-N(CH3)3、叔胺-N(CH3)2、仲胺 -NHCH3和伯胺-NH2基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。,树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体，其大小在20-50目之间。近年Bio-Rad公司还制造了50-100目、100-200目以及200-400目的产品，目数大的树脂对提高分辨率和交换容量是有利的。 疏水性的离子交换剂由于含有大量的活性基团，交换容量高、机械强度大、流动速度快。因此，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质，其次可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、清洁剂(如tritonX-100)、尿素、两性电解质(Ampholyte)。此外，还可用于分离某些不易变性的蛋白质。,疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留能力。,阳离子交换树脂对氨基酸的分离,2.亲水性离子交换剂 这类交换剂与水的亲和力较大，载体孔径大，适合于分离生物大分子，有多种类型： (1) 纤维素离子交换型 以纤维素为基质，常用的功能基因有磷酸基(P.中强酸型)、磺酸乙基(SE，强酸型)、羧甲基(CM、弱酸型)、三乙基氨基乙基(TEAE，强碱型)、二乙氨基乙基(DEAE，弱碱型)、氨基乙基(AE，中等碱型)、三乙醇基氨基(ECTE，中等碱型)等，可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型，Pharmacia (GE)公司生产的DEAE-Sephacel为球形颗粒，机械性能和理化稳定性好，对蛋白质、核酸、激素等均有良好的分辨率、回收率和交换容量，使用简单方便，在生物化学与分子生物学中使用普遍。此外，Watman公司的DE-、CM-、P- 、AE-、SE-及QA-纤维素，Bio-Rad公司的CellexD、CellexE、CellexP和CellexCM，及一些国产的DEAE-纤维素和CM-纤维素也可选择使用。,(2) 葡聚糖系离子交换剂 以SephadexG25和G50为基质，分别引入DEAE、QAE(二乙基(二羧 丙基)氨基乙基，弱碱型)、CM、SP(磺丙基、强酸型)等功能基因，构成8种交换剂，交换容量较离子交换纤维素大，除离子交换作用外，还有分子筛作用，但层析时床体积随洗脱剂离子强度的增加而缩小，以SephadexG50为基质的交换剂尤其明显，为使用带来不便。,(3) 琼脂糖系列离子交换剂： 以琼脂糖为基质，主要有Pharmacia (GE)公司的Sepharose和Bio-Rad公司的Bio-gel两个系列。 Sepharose系列离子交换剂：早期产品为DEAE-Sepharose CL-6B和CM-Sepharose CL-6B ，对生物大分子分辨力好，交换容量大，床体积随洗脱液的离子强度和pH的改变小，使用较 Sephadex系列方便。后续产品Sepharose Fast Flow(Sepharose FF)理化稳定性和机械性能更好。交换容量大，可以在床清洗，床体积随pH的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。引入的功能机团有Q(强碱性)、SP、DEAE、CM四种。此外，Sepharose High Performnce (Sepharose HP)有Q-Sepharose HP和SP-Sepharose HP两种，颗粒细、分辨率高，理化稳定性好，流速和载量均适合于实验室或大量制备使用。 Bio-GelA系离子交换剂：有DEAE-Bio-GelA和CM-Bio-GelA两种，回收率极高，床体积随pH和离子强度变化小，pH和化学稳定性好。,(4) Source系列离子交换剂 有Q(强碱型的)和S(强酸型)两种，是低压层析系统中分辨率最高，流速最快的离子交换剂，理化稳定性极好，可用1mol/L HCl和1mol/L NaOH在床清洗，使用寿命长 ，样品回收率高，重复性好，工艺放大容易。 (5) Mono Beads系列离子交换剂 是Pharmacia (GE)公司推出的新型交换剂，以亲水性聚醚为基质 ，能快速分离蛋白质，肽和低聚核苷酸，动态载样量大，可分离从mg到g的单克隆抗体。,(二) 离子交换剂的选择 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品。因此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的一个重要环节。 1.阴、阳离子交换剂的选择 如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。假设一蛋白质的等电点为5，若该物质在pH5-8稳定时，应选择阴离子交换剂； 若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。 2.强、弱离子交换剂的选择 一般来说，强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄，在pH为中性的溶液中交换容量也高，用于分离生物大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品多采用弱离子交换剂。,3.反离子的选择 离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。所此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。 4.基质的选择 树脂基质是疏水性化合物，而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。在分离生物大分子时，亲水性基质交换容量高，且对生物大分子物质的吸附和洗脱都比较温和，被分离物质活性不易受到破坏。 要恰当地选择离子交换剂，必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析 。综合考虑上述4个方面，选择的离子交换剂